实时定量逆转录PCR检测急性髓系白血病患者骨髓细胞BAALC基因表达

目的:建立实时定量逆转录聚合酶链反应(RQ-PCR)检测急性髓系白血病(AML)骨髓细胞BAALCmRNA的方法,并对24例初诊AML患者骨髓标本进行检测,初步观察其表达及意义。方法:构建BAALC基因转录本的阳性标准品质粒,利用ABI Prism7300型实时定量PCR仪进行检测,BAALC mRNA定量结果以校正比值(NQ)表示,NQ=BAALC mRNA拷贝数/ABL mRNA拷贝数。结果:RQ-PCR实验敏感度为5个拷贝。ABL及BAALC基因CT值的批内差及批间差均<2.26%。FAB各亚型中,M2型BAALC基因高表达率高于M3-M6型(P<0.05)。BAALC高表达患者血小板计数倾向于比低表达患者更低(P=0.175),CD34阳性率倾向于比低表达患者高(P=0.153)。骨髓增生异常综合征(MDS)转化的或具有MDS特点的AML(MDS-related AML)患者无论BAALC高表达还是低表达均呈现难治/复发,而原发性AML患者BAALC高表达者难治/复发率倾向于比低表达者高(P=0.182)。结论:建立的RQ-PCR检测AML患者骨髓细胞BAALC mRNA的方法稳定可靠,敏感度高。BAALC基因高表达可能是原发性AML患者一个重要不良预后因素。

华南地区不同亚型急性髓系白血病患者骨髓细胞BAALC基因表达对疗效及预后的影响

探讨华南地区不同亚型急性髓系白血病患者骨髓细胞BAALC基因表达对疗效及预后的影响。研究发现, BAALC基因的高表达组复发率远高于低表达组, 死亡率远高于低表达组。其他8种检测基因的高表达组与低表达组的死亡率之间差异无统计学意义。性别是研究病例的保护因素, 男性病例的预后生存率高于女性;BAALC基因表达高低分组变量是研究病例的危险因素, 基因低表达组的预后生存率高于基因高表达组。本研究结果有助于临床工作中为BAALC高表达患者设计个体化治疗方案。

儿茶素对骨髓细胞周期及造血生长因子基因表达的作用

目的 探讨中药鸡血藤SpatholobussuberectusDunn活性成分儿茶素对小鼠骨髓细胞增殖周期及其脾细胞内造血生长因子IL 6和GM CSFmRNA表达的影响 ,以初步阐明其造血调控作用机理。方法 用流式细胞仪检测技术观察儿茶素对正常及骨髓抑制小鼠骨髓细胞增殖周期的影响 ,同时采用RT PCR技术 ,检测在儿茶素刺激条件下 ,小鼠脾细胞内IL 6和GM CSFmRNA表达的变化。结果 儿茶素可促使正常及骨髓抑制小鼠骨髓细胞G0 G1期细胞比例下降 ,S +G2 M期细胞比例增加 ,并可使正常及骨髓抑制小鼠脾细胞内IL 6mRNA和GM CSFmRNA表达显著上调。结论 儿茶素可通过诱导脾细胞内IL 6mRNA和GM CSFmRNA的表达 ,促进正常小鼠骨髓细胞进入增殖周期 ,并促使骨髓抑制小鼠的骨髓细胞跳出“G1 期阻滞” ,进入细胞增殖周期 ,从而加速造血干 祖细胞的增殖和分化。

去势大鼠血清ALP动态及骨髓细胞骨形成相关基因表达研究

目的 了解雌性大鼠切卵去势后血清碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)变化规律及骨髓细胞的骨形成相关基因ALP、骨钙素(Bone Gla-containing protein,BGP)及核结合因子al(core bindingfactor 1,Cbf al)的mRNA表达。方法 6月龄SD雌性大鼠18只,随机分为假切卵(Sham)和切卵(OVX)组。其中每组5只大鼠于术后起每隔10d断尾采血一次至90d,用对-硝基苯磷酸盐(P-NPP)法测量血清ALP;每组4只大鼠于术后10d处死获取骨标本,用RT-PCR方法检测骨髓细胞中ALP、BGP、Cbfal mRNA表达改变。结果 OVX组大鼠血清ALP水平,10d时已较Sham组显著升高(P<0.05,+40.0％),20d时升高呈峰值(P<0.05,+63.6％),30d时则显著性降低(P<0.05,-26.1％),40d起呈回升,与Sham组比较40、50、60、70、80及90d时的ALP分别增加26.2％(P<0.05)、18.1％、16.9％、68.5％(P<0.05)、42.6％(P<0.05)与45.9(P<0.05);切卵后10d骨髓细胞中ALP、BGP、Cbfa lmRNA的表达OVX组明显高于Sham对照组(P<0.05)。结论 大鼠去势后早期血清ALP呈先增高后下降的波动性变化,以后回升呈不同程度增高;骨髓细胞的ALP,BGP和Cbf almRNA表达呈增高改变。

川芎嗪对同基因骨髓移植小鼠骨髓细胞PECAM-1/CD31分子表达与造血重建的作用

本研究通过观察骨髓移植后小鼠骨髓中血小板内皮细胞间黏附分子 (PECAM 1/CD31)的表达水平变化及川芎嗪对其表达的调节作用 ,进一步探讨川芎嗪促进骨髓造血微环境修复、改善造血重建的作用机制。将BALB/c小鼠随机分为正常对照组 ,单纯BMT对照组和川芎嗪治疗组 (骨髓移植 +川芎嗪 ) ,接受 7.5Gy60 Coγ射线一次性全身均匀照射 ,照射后进行同基因小鼠骨髓移植 ,并分别胃饲等量生理盐水与川芎嗪注射液 ,2次 /天。骨髓移植后第 7,14 ,2 1天 ,采用流式细胞术检测小鼠骨髓有核细胞表面CD31分子表达水平 ,计数外周血白细胞、血小板及骨髓有核细胞数 ,并做骨髓组织学检查。结果表明 :骨髓移植后第 7,14 ,2 1天川芎嗪治疗组的CD31表达水平 ,外周血白细胞、血小板和骨髓有核细胞计数以及骨髓细胞增生程度均高于骨髓移植对照组 (P <0 .0 1或P<0 .0 5 )。结论 :川芎嗪可以明显促进骨髓移植后骨髓有核细胞表面黏附分子CD31的表达水平 ,这可能是其促进造血重建的作用机制之一。

急性白血病患者骨髓细胞nucleostemin基因的表达与其类型、疗效的关系

目的:探讨nucleostemin(NS)基因在急性白血病中的表达及临床意义。方法:采用荧光定量PCR的方法检测67例急性白血病患者骨髓细胞nucleostemin基因表达,分析其表达与临床的关系。结果:初治急性白血病患者nucleostemin基因的表达水平高于完全缓解组、正常对照组(P<0.01),急性淋巴细胞白血病(ALL)患者nucleostemin表达水平低于急性非淋巴细胞白血病(ANLL)患者(P<0.05),ANLL中M2、M3、M4、M5患者nucleostemin表达进行两两比较无显著差异(P>0.05),急性白血病患者nucleostemin表达水平与性别、年龄、肝、脾肿大和外周血白细胞数无明显相关(P>0.05),nucleostemin基因高表达的急性白血病患者的症状完全缓解(CR)率低于低表达的患者(51.3%vs83.3%,P<0.05),急性白血病患者治疗达完全缓解者nucleostemin呈低表达,nucleostemin持续高表达或下降后又上升的患者呈现难治及复发。结论:Nucleostemin基因在急性白血病细胞中高表达,可作为疗效评价及监测残留病灶的指标。

PTH对骨髓细胞骨代谢相关基因表达的影响

目的观察大鼠骨髓微环境骨代谢相关基因表达变化,拟探讨外源性甲状旁腺激素(ParathyroidhormonePTH)治疗骨质疏松的分子机制。方法给予卵巢摘除(ovariectomyOVX)诱导的骨质疏松(OsteoporosisOP)大鼠每天20μgkg重组人甲状旁腺激素[rhPTH(134)]治疗8周,采用RTPCR方法检测大鼠骨髓细胞骨代谢相关基因的表达,比较PTH用药前、后及停药后各基因表达的变化。结果显示用药后骨髓细胞中成骨活性基因ALP、BGP、Cbfα1表达均持续显著升高(P<0.05～0.001);破骨细胞调节基因MCSF与RANKL表达变化无统计学意义;OPG与TRAF6表达呈双相波动(P<0.05～0.01);RANKLOPG比值在用药1周时增加(P<0.05);IL6表达呈早期短时升高(P<0.01)。结论PTH对骨质疏松的治疗作用可能与其持续增强骨髓细胞的成骨活性基因表达,调节破骨细胞分化和功能成熟基因表达有关。

急性白血病病人骨髓细胞胞苷脱氨酶基因表达的研究

本研究的目的是测定胞苷脱氨酶 (cytidinedeaminase ,CDD)在正常骨髓细胞和不同病期急性白血病 (AL)病人细胞内mRNA的表达水平 ,并探讨该酶与临床的关系。研究采用半定量逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测83例AL病人 (初治 31例、复发难治 2 9例、缓解 2 3例 )和 15例正常人的骨髓细胞CDD表达 ,以CDD/ β actin大于或等于 0 5定为高表达。结果显示 ,CDD基因表达量在初治和难治复发病例中分别为 0 .4 90 5± 0 .2 85 11和 0 .4 96 9± 0 3180 2 ,高表达率分别为 4 8.3%和 5 1.7%;在完全缓解病例和正常人中分别为 0 .3338± 0 .2 3838和 0 .3193±0 15 390 ,高表达率分别为 13.3%和 15 .4 %;初治和难治复发病例的CDD基因表达量显著高于完全缓解病例和正常人 (P <0 .0 5 ) ,但初治与难治复发病例之间、完全缓解病例与正常人之间无显著差异 (P >0 .0 5 ) ;难治复发病例中ALL的CDD表达量显著高于AML(0 .75 0 4± 0 .10 939vs 0 .4 336± 0 .3372 5 ;P <0 .0 5 ) ;初治 3例高表达中 2例缓解 ,1例未缓解 ,5例低表达全部缓解 ;难治复发 8例高表达中 3例缓解 ,5例未缓解 ,10例低表达中 4例缓解 ,6例未缓解 ,但未发现缓解率存在有显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 :CDD在AL的不同病期表达水平不同 。

急性白血病骨髓细胞增殖细胞核抗原、P^(53)基因表达及其意义

目的 探讨骨髓细胞增殖细胞核抗原 (PCNA)及P53 基因在儿童急性白血病 (AL)中表达及其临床意义。方法 用SP免疫组化法检测儿童AL骨髓细胞的PCNA和P53 。结果 急性淋巴细胞白血病 (ALL)组、急性非淋巴细胞白血病 (ANLL)组PCNA、P53 表达与对照组比较均有显著差异 ,组间比较均无差异 ;PCNA表达在ALL标危组显著高于高危组。PCNA阳性表达者缓解率显著高于阴性表达者 ,3年无病生存率无差异 ;P53 阳性表达者缓解率较阴性表达者无差异 ,而 3年无病生存率显著低于阴性表达者。结论 PCNA、P53 基因均参与了儿童AL发病过程 。

逆病毒载体介导的双耐药基因在小鼠骨髓细胞的转移

目的 增强造血细胞对化疗药物的耐受性 ,探讨逆转录病毒介导的基因转移效率及耐药基因导入在造血细胞保护性基因治疗中的作用。方法 应用电穿孔基因转移法将逆转录病毒载体G1Na MGMT IRES MDR1导入病毒包装细胞GP +E86及PA3 17,以VCR加压筛选后的阳性克隆上清感染小鼠骨髓细胞 ,应用PCR、Southernblot及流式细胞仪检测耐药基因MGMT及MDR1在细胞中的转移与表达。结果 加压筛选及乒乓效应使病毒滴度由 ( 0 .2～ 7.6)× 10 4CFU/mL提高到 ( 1.9～ 5 .7)× 10 6 CFU/mL ,从DNA、RNA及蛋白水平上分别证实了双耐药基因在小鼠骨髓细胞中获得了有效转移和表达 ,而转基因后的小鼠骨髓细胞对VCR、高三尖杉酯碱和BCNU的耐药性比未转导细胞分别提高了 5 .7、5 .0和 8.5倍。结论 双耐药基因成功导入小鼠骨髓细胞为肿瘤基因治疗的临床研究提供了实验基础。

低氧对大鼠骨髓细胞OPG,RANKL和TNF-α基因表达的影响

目的:探讨低氧对大鼠骨髓细胞核因子κB受体活化因子配体(RANKL)、护骨素(OPG)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因表达的影响.方法:健康3mo龄雌性SD大鼠,处死后取其骨髓细胞进行缺氧培养,分为低氧1d组(A)、低氧3d组(B)、低氧7d组(C)、低氧14d组(D)和正常对照组(E).分别于培养后1,3,7,14d提取培养细胞总RNA,RT-PCR半定量检测各组OPG,RANKL和TNF-α基因表达变化.结果:低氧组骨髓细胞RANKL和TNF-α的mRNA表达水平与对照组比较显著升高.B,C组上述改变最为显著.OPG的mRNA表达水平与对照组比较显著降低.B,C组改变最为明显.结论:低氧可刺激大鼠骨髓细胞RANKL和TNF-α基因表达,而抑制OPG基因表达.

Chfr基因在急性白血病骨髓细胞中表达的研究

为了探讨急性白血病(AL)患者骨髓细胞中有丝分裂早期检查点Chfr基因的表达及其意义,对46例初诊未治疗的AL患者骨髓单个核细胞,用RT-PCR和免疫组织化学的方法检测Chfr基因mRNA及蛋白的表达,并与正常人骨髓单个核细胞进行对照。结果表明:免疫组织化学和RT-PCR分析显示,28例急性髓细胞白血病(AML)中的15例,18例急性淋巴细胞白血病(ALL)中的13例骨髓单个核细胞Chfr基因mRNA和蛋白的表达与正常对照相比显著下降,同时Chfr基因表达异常病例染色体检查存在核型异常。结论:急性白血病骨髓细胞有丝分裂检查点Chfr基因表达受损,可能在白血病发病中具有重要作用。

异基因MHCⅠ修饰对骨髓细胞的免疫学特性的影响

目的 :观察异基因MHCⅠ修饰对骨髓细胞的免疫学特性的影响 ,探讨MHCⅠ类分子在诱导免疫耐受中的作用机制。方法 :由逆转录病毒载体pMSCV介导 ,将BALB C小鼠的MHCⅠ类分子H 2Dd 基因导入C5 7BL 6小鼠的骨髓细胞 ,流式细胞仪检测转染后基因的表达。MTT法检测混合淋巴细胞反应 ,乳酸脱氢酶释放法测定BALB C小鼠NK细胞对H 2Dd 修饰后C5 7BL 6小鼠骨髓细胞的杀伤活性。结果 :重组逆转录病毒感染的C5 7BL 6小鼠骨髓细胞对BALB C小鼠脾细胞的刺激强度或应答程度 ,与未转染和空载体病毒感染的C5 7BL 6小鼠骨髓细胞相比都显著减弱。BALB C小鼠NK细胞对转染H 2Dd 基因后的C5 7BL 6小鼠骨髓细胞的杀伤显著降低。结论 :在骨髓移植中用受者MHCⅠ分子修饰供者骨髓细胞可能诱导免疫耐受。

mdr1基因转染小鼠骨髓细胞在化疗中药物耐受量的研究

肿瘤细胞对抗癌药物多药耐药性的产生及化疗中出现的骨髓抑制是目前临床治疗恶性肿瘤面临的主要问题。多药耐药基因(mdr1)编码产生的相对分子量为170 kD的跨膜蛋白(P-gp),可将多种化疗药物排出细胞外,从而避免药物对细胞的损害。正常骨髓造血于祖细胞mdr1基因表达水平极低,故化疗中易产生骨髓抑制。本研究旨在探讨将已转染mdr1基因的小鼠骨髓细胞回输入同种小鼠体内后,受体鼠对化疗药物骨髓毒性的耐受性有无增强,从基因水平寻找一种解决化疗中骨髓抑制的措施。

逆转录病毒载体介导的双耐药基因转染小鼠骨髓细胞的实验研究

目的:将耐药基因以逆转录病毒为载体转染骨髓细胞以解决大剂量化疗所造成的骨髓抑制。方法:以逆转录病毒为载体,将双突变的二氢叶酸还原酶基因(DH-FR)和胞苷脱氨基酶基因(CD)转染小鼠骨髓细胞,观察该细胞耐MTX及Ara-C的CFU-GM生成情况;RT-PCR检测转基因的表达情况。结果:转基因的小鼠骨髓细胞有耐药克隆形成(14%);基因转染后小鼠骨髓细胞对MTX和Ara-C的耐受明显增加,P<0·005;RT-PCR显示转基因细胞有转染的基因条带。结论:双耐药基因通过逆转录病毒转染小鼠骨髓细胞并且获得表达,提高了骨髓细胞对MTX和Aar-C的耐药性。

条件性基因敲除:骨髓细胞特异性敲除Ncol2基因小鼠的建立和基因型鉴定

Ncol2是新发现的参与免疫调节的重要因子,Ncol2基因骨髓细胞特异性敲除小鼠的建立,能够有针对性的研究Ncol2基因缺失后对免疫系统的影响。根据条件性基因敲除的原理,本文利用loxp转基因小鼠和在骨髓细胞特异性表达Cre重组酶的LysMcre小鼠,繁殖建立了骨髓细胞特异性敲除Ncol2基因的小鼠,并提供了用鼠尾做基因型鉴定的简便方法。

BLM基因在白血病骨髓细胞中的表达及其临床价值

目的探讨BLM基因在白血病骨髓细胞中的表达及其临床价值。方法选取2011年6月至2013年6月我院收治的68例初治白血病患者作为观察对象,采集患者治疗前后骨髓细胞标本,采用半定量反转录-聚合酶链反应(R T-P C R)测量B L M表达情况,比较不同年龄、性别等参数之间及治疗前后的B L M表达差异性。结果男性白血病患者较女性BLM基因阳性表达率高,差异有统计学意义;白细胞计数≥18×109/L的白血病患者BLM基因阳性表达率高于白细胞计数<18×109/L的患者,差异有统计学意义。治疗后、移植后患者BLM表达率均显著低于初诊(未经治疗)患者,差异有统计学意义;移植后的患者B L M基因阳性表达率显著低于药物治疗后的患者,差异有统计学意义。结论白血病患者B L M基因表达与患者的性别及白细胞计数水平有关,且患者接受药物治疗或移植治疗后,B L M阳性表达率和表达量变化均可提示患者疗效及预后,结论有待进一步研究。

PTH作用于老年大鼠骨髓细胞骨代谢相关基因表达的实验方法

目的 从骨髓微环境角度研究甲状旁腺激素 (parathyroidhormone,PTH)对老年大鼠骨形成刺激作用的分子机制。方法 8只 2 0月龄雄性大鼠随机平均分两组 ,每组 4只 ,分别给予人重组甲状旁腺激素和生理盐水 ,1次 /天 ,5次 /周 ,8周后处死 ,无菌获取股骨和腰椎骨髓细胞 ,用RT PCR法检测成骨功能相关基因核结合因子α1(Cbfα1)、碱性磷酸酶 (ALP)和骨钙素 (BGP)及破骨细胞分化成熟调节基因NF κB受体激活因子配体(RANKL)、骨保护素 (OPG)、巨噬细胞克隆刺激因子 (M CSF)、肿瘤坏死因子受体相关因子 6 (TRAF6 )和白介素 - 6 (IL 6 )mRNA表达水平。结果 PTH显著增加骨髓细胞中成骨功能相关基因Cbfα1、ALP和BGPmRNA表达 (P <0 .0 5～ 0 .0 0 1) ;调整破骨细胞分化成熟调节基因mRNA表达 :下调RANKL、M CSF和TRAF6mRNA表达 (P <0 .0 5～ 0 .0 1) ,上调OPGmRNA表达 (P <0 .0 1)和IL 6mRNA表达 (P <0 .0 5 )。股骨与腰椎呈类似变化。结论 PTH增加老年大鼠骨量可能与其强烈刺激骨髓微环境中成骨活性基因表达 ,同时调整破骨细胞分化和功能成熟状态有关。

用基因芯片体外研究苯暴露大鼠骨髓细胞基因的表达

目的 研究正常和苯处理后的大鼠骨髓细胞的基因表达谱 ,大规模分析苯作用后骨髓细胞基因表达水平的变化。方法 1实验大鼠骨髓细胞分为两组 ,一组为正常对照组 ,一组为染苯组 ;2从两组骨髓细胞中抽提总 RNA ,经反转录分别用 Cy3、Cy5荧光标记 ,获得 c DNA探针 ;3c DNA探针与基因谱芯片杂交 ,结果由扫描仪扫描并用软件进行分析统计。结果 骨髓细胞暴露苯后 2 0 0条 (4 .88%)基因发生明显变化 ,其中 1 5 4条 (77%)基因已在 Gene Bank中登录。这 2 0 0条基因中 ,有 94条基因表达降低 (Cy5 / Cy3* <0 .5 ) ,1 0 6条基因表达升高 (Cy5 / Cy3* >2 .0 )。结论 利用基因芯片技术结合体外细胞培养能大规模地研究苯毒性作用的基因表达谱 ,初步筛选出苯毒性作用相关基因。对进一步阐明苯毒性在基因水平的发病机理有十分重要的作用。