急性髓系白血病患者骨髓细胞HtrA2基因、Set基因表达与疗效和预后的关系研究

研究HtrA2基因在 AML中的应用;Set基因的表达与治疗效果及预后之间的相关性。方法:选取90例在2017年1~2019年1月期间接受过治疗,且有良好的病史记录,并以90例同期在本院接受过治疗的非血液系统肿瘤病人为对照组。①对HtrA2基因进行检测;AML细胞系中 Set基因的表达;② AML组与对照组HtrA2基因、 Set基因的表达;③年龄、性别、白细胞计数与HtrA2基因、 Set基因表达的相关性;④ NCCN预后分型与HtrA2基因、 Set基因的相关性;⑤HtrA2基因、 Set基因与治疗效果之间的相关性;⑥HtrA2基因和 Set基因之间的关系。结果:不同类型的白血病细胞株均存在HtrA2基因,U937未见 Set基因的表达。AML组HtrA2基因的表达较正常组低, Set基因的表达较正常组高,且与正常组相比有显著性差异(P<0.05)。结论:HtrA2基因、 Set基因在 ALL中的表达与治疗效果及预后具有一定的关系,可以通过HtrA2基因、 Set基因的表达来指导治疗。

条件性基因敲除:骨髓细胞特异性敲除Ncol2基因小鼠的建立和基因型鉴定

Ncol2是新发现的参与免疫调节的重要因子,Ncol2基因骨髓细胞特异性敲除小鼠的建立,能够有针对性的研究Ncol2基因缺失后对免疫系统的影响。根据条件性基因敲除的原理,本文利用loxp转基因小鼠和在骨髓细胞特异性表达Cre重组酶的LysMcre小鼠,繁殖建立了骨髓细胞特异性敲除Ncol2基因的小鼠,并提供了用鼠尾做基因型鉴定的简便方法。

以皮肤肿块为首发临床表现的伴MYC和BCL2重排弥漫性大B细胞淋巴瘤

报告1例以皮肤肿块为首发临床表现的伴细胞性骨髓细胞瘤病病毒癌(MYC)基因和B细胞淋巴瘤因子2(BCL2)基因重排弥漫性大B细胞淋巴瘤。患者女,87岁。左侧眉弓上方皮肤结节1年。皮肤科检查:左眉上方一肤色圆形肿物,隆起于皮肤表面,肿物表面可见浸润性红斑,伴少许渗出,并见结痂、鳞屑,边界清楚。皮损组织病理检查:表皮形态正常,真皮层内大量母细胞样淋巴细胞结节状浸润。免疫组化:母细胞样淋巴细胞CD45、CD79a、B细胞淋巴瘤因子6(BCL6)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)及MYC均(+);CD3、CD2、CD30、细胞角蛋白(CKP)、间变性淋巴瘤激酶(ALK)及Epstein-Barr病毒编码RNA(EBER)均(-)。荧光原位杂交检测:MYC、BCL2及BCL6均重排。诊断:伴MYC和BCL2重排弥漫性大B细胞淋巴瘤。患者未治疗,2个月后死亡。

放射线诱导的HtrA2基因表达对人葡萄膜黑色素OCM-1细胞的影响

背景与目的:葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma,UM)是成人最常见的眼内原发性恶性肿瘤,其恶性程度高,转移早。放射治疗是多年来葡萄膜黑色素瘤最常用的方法之一,但辐射抗性和受照部位正常组织的损伤是长期困扰UM放疗的问题。本实验运用放射线可调控的HtrA2基因联合疗法,探讨其对UM的抑制作用。方法:含Egr1启动子的pIRES-Egr1-Omi/HtrA2(pEgr1-HtrA2)质粒体外转染入OCM-1细胞,转染后的细胞暴露于不同剂量的放射线中。将移植瘤模型小鼠分为对照组、放射组、基因组和基因放射组,每组10只。应用实时定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测HtrA2基因的mRNA表达和蛋白表达。流式细胞仪检测联合处理后的OCM-1细胞凋亡情况。通过克隆形成实验检测HtrA2基因对放射敏感性的影响。在动物实验中测量联合治疗后肿瘤体积。结果:转染pEgr1-HtrA2质粒后,放射组HtrA2 mRNA表达在8 Gy达到高峰,且HtrA2蛋白表达较放射前明显增加(P<0.05),OCM-1细胞凋亡显著增加。克隆形成实验显示,HtrA2基因可增强OCM-1细胞放射敏感性。与对照组相比,基因放射组肿瘤生长被显著抑制(P<0.05)。结论:转染pEgr1-HtrA2质粒后可在放射线调控下增加HtrA2基因表达,并能增强OCM-1细胞对放射的敏感性,抑制肿瘤细胞生长。

抑癌基因Kmt2c杂合缺失对小鼠造血系统的影响

目的:探究组蛋白甲基转移酶Kmt2c基因杂合缺失对小鼠血液系统的影响。方法:使用CRISPR/Cas9技术构建Kmt2c基因杂合缺失的模型小鼠,血常规连续监测小鼠全血细胞计数的变化;通过体外集落形成实验探究骨髓细胞的克隆性扩增能力;流式细胞术分析突变小鼠体内原始造血细胞群(长期造血干细胞、短期造血干细胞、多能祖细胞)的比例变化。结果:成功构建Kmt2c基因杂合缺失小鼠(Kmt2c^(+/-))模型,其Kmt2c mRNA表达水平是C57BL/6J小鼠的28%。Kmt2c^(+/-)小鼠骨髓细胞体外集落形成能力随着传代次数的增加而增强,并在第四代时集落数显著高于对照组(P<0.05)。Kmt2c^(+/-)小鼠原始造血细胞群中的长期造血干细胞和短期造血干细胞比例分别为19.6%±3.3%及28.9%±4.9%较对照组的16.9%±2.6%及18.9%±2.5%有增高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。Kmt2c^(+/-)小鼠的白细胞计数在监测的第12周后逐渐上升在第14周时为(9.8±1.0)×10^(9)/L,显著高于对照组的(7.3±1.4)×10^(9)/L(P<0.05)。结论:Kmt2c^(+/-)小鼠的骨髓细胞具有克隆性扩增的潜能。

反转录病毒介导人骨形态发生蛋白2基因修饰骨髓基质细胞的体内成骨效应

目的:构建人骨形态发生蛋白2反转录病毒表达载体,探讨以转人骨形态发生蛋白2基因骨髓基质细胞为种子细胞的组织工程骨修复骨缺损的可行性。方法:实验于2001-05/2003-01在北京大学医学部完成。①采用DNA重组技术,将骨形态发生蛋白2cDNA克隆到pLXSN反转录病毒质粒,经酶切及测序鉴定正确后,包装成为pLXSN/BMP2重组反转录病毒。取15d龄BALB/c系小鼠5只用于骨髓基质细胞的提取。将重组病毒感染小鼠骨髓基质细胞,经筛选后,聚合酶链反应鉴定人骨形态发生蛋白2cDNA在转基因骨髓基质细胞中的整合情况。②转基因骨髓基质细胞的骨形态发生蛋白2表达情况采用免疫印渍杂交和核糖核酸印渍杂交技术检测。转基因骨髓基质细胞碱性磷酸酶的表达采用钙-钴法染色检测,用以评定表达骨形态发生蛋白2的生物活性。③取6周龄BALB/c小鼠6只,将转基因骨髓基质细胞与羟基磷灰石构建人工骨植于小鼠骨骼肌内,体内成骨情况予组织学观察评估。结果:①pLXSN/BMP2质粒的鉴定结果:经酶切及DNA测序证实重组pLXSN/BMP2序列正确。②重组病毒的滴度测定结果:包装的病毒滴度为(6～8)×105cfu/mL。③基因整合及表达的分析:聚合酶链反应证实转基因骨髓基质细胞基因组中有骨形态发生蛋白2cDNA整合;核糖核酸印渍杂交和蛋白免疫印渍杂交证实转基因骨髓基质细胞稳定表达人骨形态发生蛋白2;钙-钴法染色证实转基因骨髓基质细胞碱性磷酸酶阳性。④小鼠体内成骨情况:甲苯胺蓝染色的组织切片镜下观察显示转骨形态发生蛋白2基因骨髓基质细胞构成人工骨可见少量软骨细胞及软骨基质存在,软骨细胞呈巢状分布。结论:成功地构建了pLXSN-BMP2重组反转录病毒载体,该载体不仅有效地表达骨形态发生蛋白2蛋白,表达的骨形态发生蛋白2能够诱导未分化的骨髓基质细胞向成骨细胞方向分化,且在体内肌肉环境下能促进成骨。

JAK2V617F阳性PV与ET实验室检查混淆诊断的患例骨髓细胞形态观察

目的：真性红细胞增多症（PV）与原发性血小板增多症（ET）临床体征有重叠表现，实验室检查表型间又存在交叉，为明确二者的诊断，减少误诊，将曾经误诊病例的实验室检查数据与骨髓细胞形态学相结合进行分析总结。方法：回顾分析曾误诊的PV、ET患者的外周血结果、骨髓病理活检结果、JAK2V617F基因检测结果、骨髓涂片细胞学检查。结果：JAK2V617F基因阳性，RBC、PLT数明显增高，MCV、HCT偏低，Hb低于WHO规定的PV的诊断标准的病例，依据骨髓形态学诊断为合并缺铁性贫血的PV；IAK2V617F基因阳性，Hb、RBC、WBC外周血计数较高，PLT计数反而较低的病例，依据骨髓形态学诊断为ET。结论：骨髓形态学仍是我们做好PV、ET诊断与鉴别诊断的重要依据。

Htra2基因内含子5-59A/G位点多态性与帕金森病的相关性研究

目的探讨粤西地区汉族人群中Htra2(又被称作Omi)基因内含子5-59A/G位点(rs2241027)的单核苷酸多态性(SNP)与帕金森病(PD)的相关性。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术,检测56例PD患者和109例健康人的Htra2基因内含子5-59A/G位点多态性的基因型。结果病例组A等位基因频率(46.4%)倾向高于对照组(36.7%)(P=0.073);AA基因型频率(21.4%)亦倾向高于对照组(11.0%)(P=0.072)。经性别分层分析发现,男性AA基因型频率(25.7%)高于对照组(10.3%)(P=0.041);病例组A等位基因频率(48.6%)倾向高于对照组(34.6%)(P=0.051)。结论 5-59A/G位点等位基因A和AA基因型均可能增加PD的发病风险,特别是男性。

微小RNA-155在小鼠骨髓来源M1和M2巨噬细胞中表达的差异

背景:目前对微小RNA-155在巨噬细胞中的表达和功能的研究还集中在总体单核巨噬细胞水平。目的:了解小鼠骨髓来源M1和M2巨噬细胞中微小RNA-155表达的差异。方法:用100U/mL干扰素γ和5μg/L脂多糖诱导骨髓细胞来源的巨噬细胞向M1分化,用10μg/L白细胞介素4诱导出M2巨噬细胞。结果与结论:流式细胞检测显示实验诱导的M1和M2巨噬细胞纯度分别达91%和95%。RT-PCR检测显示诱导型一氧化氮合酶mRNA在M1巨噬细胞中高表达,在M2中则基本不表达;而Ⅰ型精氨酸酶、发现于炎症区域1mRNA在M2中高表达,在M1中则表达较低;炎症因子肿瘤坏死因子αmRNA在M1中的表达明显高于M2,相反白细胞介素10mRNA在M2中的表达高于M1(P<0.05)。实时荧光定量PCR检测显示M1巨噬细胞中微小RNA-155的表达量明显高于M2(P<0.05)。提示微小RNA-155可作为鉴别M1,M2巨噬细胞的标志。

HTRA2基因G1195A变异与华中地区帕金森病的相关性研究

目的探讨HTRA2基因G1195A变异与华中地区汉族人群帕金森病(PD)的关系。方法采用病例对照研究提取208例散发性PD患者及234名正常对照者外周血基因组DNA,采用PCR直接测序方法检测HTRA2基因第7号外显子序列。根据Genbank检索到HTRA2基因序列,将正常对照者和散发性PD患者组测得的序列用DNAMAN7进行比对,寻找突变。结果 PD组与正常对照者DNA样品均未发现G1195A突变。结论 HTRA2基因G1195A变异不是华中地区汉族PD患者发病的主要致病因素,有待深入研究。

促凋亡基因HtrA2在急性髓系白血病中的表达及临床意义

目的:研究促凋亡基因HtrA2在急性髓系白血病(AML)中的表达及临床意义。方法:收集78例AML患者(初发组、完全缓解组和难治组)及同期就诊的25例对照组骨髓及外周血标本,提取总RNA,检测HtrA2基因的表达水平,分析不同组别、不同型别之间的HtrA2基因的表达水平。同期随访17例患者。结果:初诊组、完全缓解组和难治组的HtrA2的表达量存在较大的差异,最高值与最低值比值高达68.76,HtrA2水平在不同的患者存在较大差异,3组间差异有统计学意义(χ~2=35.13,P<0.05)。FAB各型别间HtrA2基因的相对表达量差异无统计学意义(F=0.004,P>0.05)。随诊患者治疗后其HtrA2基因表达明显高于治疗前(P>0.05)。HtrA2基因可以影响患者生存时间(Wald=4.979,P<0.05),而年龄和性别对患者生存状态的影响无统计学意义(Wald分别为2.426和0.883,P>0.05),随访期患者生存曲线分析显示患者的中位生存时间为34.50个月。结论:HtrA2基因的表达水平的检测有助于AML的诊断,治疗及预后评估。

Omi/HtrA2基因与神经变性疾病的研究进展

人HtrA2(也称作Omi)是HtrA丝氨酸蛋白酶家族的新成员,可以通过破坏X染色体连锁的凋亡蛋白抑制物和caspase的相互作用,和(或)直接利用其蛋白酶活性诱导凋亡,也可以校正、降解错误折叠的蛋白质,抵抗应激,具有细胞保护的作用。研究已经发现它参与了许多疾病的发生、发展。作者就其生物学功能、单核苷酸多态性与神经变性疾病的相关性做一综述。

Omi/Htra2基因1195G/A多态性与帕金森病的相关性研究

目的探讨中国汉族人群Omi/Htra2基因编码区1195G/A位点的单核苷酸多态性(SNP)与帕金森病(PD)发病的关系。方法采用聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)技术,检测56例PD患者和109例健康人的Omi/Htra2基因编码区1195G/A位点多态性的基因型及等位基因频率。结果 56例PD病例中Omi/Htra2基因1195G/G基因型55例,G/A杂合子1例;对照组中109例全部为G/G基因型。结论中国汉族人群Omi/Htra2基因编码区1195G/A杂合子可能是PD的患病因素。

KIR2DL4基因多态性及促凋亡基因HtrA2在老年白血病病人中的表达及与预后的相关性研究

目的探讨KIR2DL4基因多态性及促凋亡基因HtrA2在白血病病人中的表达及与预后的相关性。方法选择2016年7月至2018年1月收治的老年白血病病人156例作为研究对象,设为观察组,其中急性淋巴细胞白血病(ALL)67例,急性髓系白血病60例,慢性髓系白血病(CML)29例,所有病人均给予常规方法治疗,随访2年。选择同期健康体检的老年人79例,设为对照组。完成基因组DNA提取,检测KIR2DL4基因分型;采用实时荧光PCR技术测定2组促凋亡基因HtrA2 mRNA水平;对KIR2DL4基因多态性及促凋亡基因HtrA2表达与老年白血病病人预后的相关性进行分析。结果2组KIR2DL4基因多态性中2DL4-001、2DL4-005、2DL4-006、2DL4-008、2DL4-0011差异无统计学意义(P>0.05);观察组9A型KIR2DL4高于对照组(P<0.05);10A型KIR2DL4低于对照组(P<0.05)。观察组HtrA2 mRNA水平高于对照组(P<0.05)。随访期间死亡54例,死亡率为34.62%。死亡组2DL4-0011、9A型KIR2DL4检出率均高于存活组(P<0.05),10A型KIR2DL4检出率和HtrA2表达水平低于存活组(P<0.05)。多因素Cox回归分析结果表明老年白血病病人预后与2DL4-006、9A型KIR2DL4基因多态性及HtrA2表达水平均有关(P<0.05)。结论KIR2DL4基因多态性及促凋亡基因HtrA2在老年白血病病人中表达异常,其水平与预后存在相关性。

急性髓系白血病中HtrA2和WT1基因的表达

本研究通过检测HtrA2和WT1基因在急性髓系白血病(AML)患者骨髓单个核细胞及细胞系中的表达,探讨其表达水平与临床变量的关系及二者之间的相关性。应用RQ-PCR方法检测104例初诊AML患者的HtrA2和WT1基因表达水平;比较其表达量与正常对照的差别,并分析与年龄、性别、白细胞计数、诊断分型、预后分型及治疗疗效的关系;比较治疗前后表达量的变化,分析HtrA2与WT1二者相关性。结果表明:AML患者骨髓细胞中HtrA2表达量显著低于正常对照组(P<0.01),而WT1则显著高于正常对照组(P<0.01);二者表达量与患者年龄、性别、白细胞计数无关;HtrA2在不同的NCCN预后分组中表达量无显著差异,而WT1在预后良好组表达量明显低于预后中等组(P=0.003);无论完全缓解(CR)组还是非完全缓解(non-CR)组HtrA2表达量在治疗后均显著高于治疗前(P<0.05),而WT1表达量只有在CR组治疗后才低于治疗前(P<0.01),non-CR组治疗后虽然也低于治疗前,但差异无统计学意义;HtrA2与WT1的表达水平呈弱负相关(r=-0.249,P=0.011)。结论:HtrA2和WT1表达与白血病的发生、发展密切相关,二者表达水平呈负相关,上调HtrA2基因的表达和干扰WT1基因的表达有望成为白血病治疗的靶点。

HtrA2转基因鼠的建立与鉴定

旨在建立神经特异性过表达HtrA2转基因鼠。通过质粒重组技术构建神经特异性表达HtrA2质粒pNSE-HtrA2,利用EcoR I及PvuI切割pNSE-HtrA2获得转基因。显微注射转基因到FVB/N受精卵并移植到假孕鼠的输卵管中发育,获得的转基因鼠利用Western blot鉴定特异性过表达情况。结果显示,成功建立神经特异性过表达HtrA2转基因鼠,神经特异性过表达HtrA2达到5.4倍。本研究建立了神经特异性过表达HtrA2转基因鼠,可用于HtrA2在神经系统的作用研究。

地塞米松诱导促进BMP-2基因转染的兔MSCs的成骨转化

目的: 研究地塞米松诱导对BMP 2基因修饰的rMSCs的增殖和分化表型的影响.方法: 将地塞米松诱导和未经诱导的兔MSCs分别转导BMP 2基因后,以RT PCR和免疫组化方法检测转导后细胞BMP 2的表达;通过观察细胞生长及碱性磷酸酶活性和骨钙素含量的测定,分析地塞米松诱导对BMP 2基因修饰的rMSCs的增殖和分化表型的影响.结果: 转导后BMP 2基因在两组rMSCs中均有表达,定量分析显示诱导组细胞碱性磷酸酶活性 ( 134 36±8 84 )nkat/L较对照组(104 02±7 83)nkat/L明显增高;诱导组细胞骨钙素含量(14 68±0 73)μg/L较对照组(6 52±1 21)μg/L明显增高.结论: 转导前地塞米松诱导能够促进BMP 2基因修饰的rMSCs的增殖和成骨转化.

Omi/HtrA2与Livin对子痫前期及子痫患者胎盘凋亡的影响

目的:检测子痫前期及子痫患者(观察组)和正常晚期妊娠孕妇(对照组)胎盘组织中Omi/HtrA2基因与凋亡抑制蛋白Livin基因表达,探讨Omi/HtrA2与Livin在子痫前期及子痫胎盘凋亡中的作用。方法:采用免疫组织化学SP法检测60例观察组和20例对照组分娩后胎盘组织中Omi/HtrA2与Livin表达。结果:Omi/HtrA2主要在胎盘组织中滋养细胞及间质细胞胞质中表达,观察组表达水平(150.46±26.59)高于对照组(132.11±18.43),子痫前期重度(161.17±19.45)高于子痫前期(136.79±26.57)(P<0.05);Livin主要在胎盘组织中合体滋养细胞及间质细胞的细胞核中表达,观察组表达水平OD值(116.07±22.40)低于对照组(136.73±20.81)(P<0.01),但子痫前期与子痫前期重度组间比较无差异(P>0.05)。结论:Omi/HtrA2、Livin均参与了胎盘的凋亡,在子痫前期及子痫发生发展中可能有重要作用。