羊骨髓肽及其钙螯合物对成骨细胞增殖和活性的影响

成骨细胞在骨代谢过程中发挥成骨作用,笔者制备羊骨髓肽钙螯合物(MP-Ca),探究其对体外培养成骨细胞的增殖及活性的影响,并将其效果同羊骨髓肽(MP)进行比较。制备的MP-Ca经傅里叶红外光谱仪进行扫描鉴定;从新生SD大鼠颅骨中分离纯化的成骨细胞经碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色鉴定;在培养液中添加不同浓度的受试物,CCK-8法确定最佳作用浓度。以17-β雌二醇(10~2μg·mL^(-1))为阳性对照,通过测定各组细胞OD_(450 nm)和ALP、骨钙素(BGP)的含量,考察MP、MP-Ca在最适作用浓度(10~3μg·mL^(-1))下对成骨细胞增殖和活性的影响。结果表明,MP和MP-Ca的红外光谱图未完全重叠,吸收峰发生了明显的位移变化,说明MP与CaCl_2反应形成了MP-Ca。分离的成骨细胞经ALP染色呈阳性,胞内可见大量黑褐色颗粒;茜素红染色后细胞呈深红色,并形成钙化结节。MP-Ca处理组的OD_(450 nm)和ALP、BGP水平均显著(P <0. 05或P <0. 01)高于MP处理组,但均显著(P <0.05或P <0. 01)低于雌激素组。综上,尽管效果不及雌激素,MP-Ca和MP均可促进体外培养成骨细胞的增殖并增强其成骨活性,效果MP-Ca优于MP。

羊骨髓肽-钙螯合物对诱导分化的破骨细胞形成和吸收的影响

目的探讨羊骨髓肽(sheep bone marrow peptides,MP)及其钙螯合物(MP-Ca)对诱导分化的OC形成和活性的影响。方法将MP与CaCl_2螯合制备MP-Ca,以RAW264.7为破骨前体细胞模型,建立OC的RANKL诱导体系,以MP和MP-Ca干预诱导过程,确定二者在最适作用浓度下对诱导曲线、TRAP活性和骨吸收陷窝数的影响。结果诱导后第5天,细胞呈现OC典型形态,TRAP染色呈阳性并在共培养的骨片上形成骨吸收陷窝,MTT检测时OD_(490)达到峰值;以第5天作为检测时间,MP与MP-Ca均以10~3μg/mL时OD_(490)最低;以10~3μg/mL MP和MP-Ca干预诱导体系,除第1天外,干预组OD_(490)均显著低于空白组(P<0.05);在第5天,MP-Ca组的OD_(490)和TRAP活性均显著低于MP组(P<0.05);各干预组的骨吸收陷窝数均显著低于空白组,且MP组显著低于MP-Ca组(P<0.05);17β-雌二醇(10μg/mL)的各检测指标均显著低于干预组(P<0.05)。结论虽效果不及雌激素,MP和MP-Ca均可抑制OC的诱导形成及其破骨活性,MP-Ca对OC诱导形成的抑制作用强于MP。

胎牛骨髓多肽对小鼠骨髓细胞CFUF-GM增殖的实验研究

通过特定工艺将胎牛骨髓进行分离提取,发现其中含有对小鼠造血系统具有调节作用的中分子多肽。用体外半固体琼脂培养及MTT法分别观察其对小鼠骨髓细胞CFU-GM 增殖和骨髓细胞DNA合成的影响,结果表明,胎牛骨髓小分子多肽（BGF）对骨髓单核粒系统细胞的增殖具有刺激作用。

胎牛骨髓多肽对小鼠和人T细胞功能的影晌

用F60透析柱从胎牛骨髓中提取出一组分子量在10kD的多肽物质,以CorA诱导的淋巴细胞增殖反应研究其对小鼠T细胞功能的影响,发现该物质能促进ConA激活的小鼠淋巴细胞增殖反应。研究还发现,胎牛骨髓多肽在终浓度为5.0—10mg/ml时对人淋巴细胞表达mIL-2R有促进作用。从而提示该物质对机体细胞免疫功能具有促进作用。

绵羊骨髓细胞抗菌肽基因的改造及其在原核生物中的表达

目的通过对绵羊骨髓细胞抗菌肽(sheep myeloid antibacterial peptides with 29 amino acids,SMAP-29)的活性片段SMAP-29(1-18)基因的改造,使其以C-端融合蛋白的形式在大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)中表达。方法根据大肠埃希菌偏爱密码子表,将SMAP-29的活性片段SMAP-29(1-18)基因序列进行改造,应用ProtParam分析SMAP-29的理化特性,Anthorprot软件预测其螺旋轮结构,设计新的基因片段,插入质粒pET-30a中,构建重组表达质粒pET-30aSMAP-29[1-18,K2,4,L13],转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物过2次Ni2+NTA His Bind resin柱进行纯化。结果 SMAP-29基因序列经改造后,稳定性、等电点及半衰期均明显提高。重组质粒经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确。表达的重组蛋白相对分子质量约61 257,以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的41%,纯度为81%。结论已成功对SMAP-29基因进行改造,实现了其在E.coli BL21(DE3)中的高表达,获得了纯度较高的目的蛋白,为进一步规模化生产SMAP-29奠定了理论及实践基础。

抗菌肽-裂解酶融合抗铜绿假单胞菌蛋白的可溶表达与活性评价

目的通过与促溶蛋白融合表达,分离、纯化获得抗菌融合蛋白,并初步评价其抗菌活性。方法将绵羊骨髓细胞抗菌肽SMAP29的N端与源自噬菌体JD010裂解酶LysPA26的C端融合设计新的抗菌蛋白(AL)。通过同源重组构建pCold-His-TF-AL表达质粒。通过Ni-亲和层析和阴离子交换层析分离纯化AL,采用平板计数法初步评价AL的抗铜绿假单胞菌活性。结果在E.coli BL21(DE3)中,质粒pCold-His-TF-AL能明显表达出抗菌蛋白AL,并且90%以上的AL为可溶形式分布于E.coli破菌液的上清液中。可分离纯化得到纯度超95%的AL。0.05 mg·mL^(-1) AL在30 min内可将铜绿假单胞菌PAO1菌量降低5.55个对数单位,具较高的抗菌活性。结论通过采用Trigger Factor标签融合表达和冷休克诱导方法可实现AL的高效可溶表达,纯化的AL对铜绿假单胞菌具有明显的抗菌活性。

抗菌肽-裂解酶双机制抗菌蛋白质的设计与可溶性表达

目的针对G^(-)菌外膜阻挡裂解酶发挥作用的情况,设计抗菌肽-裂解酶双机制抗菌蛋白,并优化表达体系,获得可溶性表达的抗菌蛋白质。方法采用同源模建方法将绵羊骨髓细胞抗菌肽与源自噬菌体JD010的裂解酶融合设计新的抗菌蛋白质(SMAP-Lysin)。通过构建pET30a、pBV220表达载体的方式,利用小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)的促溶作用,促进SMAP-Lysin的可溶性表达。结果仅在pBV220载体上,SMAP-Lysin有明显的表达,但其表达过程会诱导宿主细菌的死亡,无法有效分离纯化目标蛋白质;通过SUMO标签的促溶作用,可实现SMAP-Lysin的融合表达,且SUMO肽段的融合避免了宿主细菌的死亡;采用亲和层析,酶切步骤处理后,可得到纯化的抗菌蛋白质SMAP-Lysin。结论大肠杆菌是用于表达重组蛋白质的重要工程菌,采用SUMO标签融合表达的方式可有效降低抗菌蛋白对表达菌宿主的毒性,提高抗菌蛋白的可溶性表达,有利于抗菌蛋白的纯化。