改良全骨髓贴壁法分离及培养大鼠骨髓间充质干细胞

目的建立简单、优化的分离及培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法,为组织工程支架研究提供细胞基础。方法分别采用常规和改良的全骨髓贴壁法分离和培养BMSCs。常规法按照传统全骨髓贴壁法,对骨髓冲洗液进行过筛和离心处理后加入完全培养基进行培养。在改良全骨髓贴壁法中,将骨髓冲出骨髓腔后直接加入完全培养基进行培养。倒置相差显微镜下观察两组细胞形态,采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法比较两组BMSCs的增殖活性,流式细胞术检测表面标志物CD90、CD29、CD11b/c、CD45。对改良法培养的BMSCs进行定向诱导成骨及成脂分化,并通过茜素红染色检测其成骨分化潜能,通过油红O染色检测其成脂分化潜能。结果改良全骨髓贴壁法培养的BMSCs形态均一,细胞集簇排列呈“鱼群状”“漩涡状”。改良法比常规法培养的BMSCs增殖活性强(P<0.05)。改良法与常规法培养的BMSCs均高表达CD90和CD29,低表达CD11b/c和CD45。改良法培养的BMSCs成骨、成脂诱导分化后茜素红染色和油红O染色均为阳性。结论改良全骨髓贴壁法可成功分离并培养BMSCs,培养的BMSCs具有多向分化潜能,为组织工程支架的研究奠定了细胞基础。

全骨髓贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞体外定向成骨诱导分化及鉴定

背景:流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法对细胞活性影响较大,密度梯度离心法虽然能够获得纯度高的单核细胞,但由于多次离心可造成细胞的大量流失且对细胞活性有一定的影响使其应用值得商榷。目的:采用全骨髓贴壁法分离兔骨髓间充质干细胞进行成骨诱导分化及鉴定。方法:采用全骨髓贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态学特征。在成骨诱导剂作用下,通过碱性磷酸酶染色试剂盒行碱性磷酸酶染色,Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色,VonKossa法及茜素红进行矿化结节染色以及电镜下检测兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后的形态结构。结果与结论:经诱导后细胞出现与成骨细胞相似的形态学特征,碱性磷酸酶染色阳性,Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色,Von-Kossa法及茜素红矿化结节染色阳性。表明经成骨诱导剂诱导后全骨髓贴壁法体外分离纯化培养的兔骨髓间充质干细胞能向成骨细胞方向分化增殖。

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性及优势

背景:骨髓来源的间充质干细胞含量极低,体外纯化、扩增活性好、分化潜能高的骨髓间充质干细胞,对进一步研究至关重要。目的:进一步验证全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化骨髓间充质干细胞的生物学特性、表型及多向分化潜能。方法:通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,流式细胞仪检测细胞标记物表达,分别进行成骨、成脂诱导分化。结果与结论:成功纯化、扩增了高细胞活性、高分化潜能的骨髓间充质干细胞。所得细胞呈成纤维细胞样;表达CD29、CD90,不表达CD45;成骨、成脂诱导分化后,茜素红染色、油红O染色阳性。证实全骨髓贴壁法操作简单、对细胞活性损伤小,可以得到高纯度、高活性、高分化潜能、生物学形态和特征稳定的骨髓间充质干细胞。

全骨髓贴壁法培养人骨髓间充质干细胞的改良研究

本研究旨在利用红细胞自然沉降性原理,以传统的全骨髓贴壁法为基础,探讨一种改良后简便而高效的人骨髓间充质干细胞培养方法。采用6孔板培养细胞,将骨髓标本用MSC完全培养液培养48 h,吸取上层无红细胞的上清层,置于新的培养孔以分离获取MSC。用倒置显微镜观察细胞形态及贴壁情况,记录细胞首次贴壁时间、首次传代时间,并以传统全骨髓贴壁法为对照;应用流式细胞术检测细胞周期、细胞表面标记;用油红O及碱性磷酸酶试剂盒分别对MSC成脂、成骨能力进行鉴定;应用计数板计数法描绘第1代,第3代,第5代MSC增殖曲线。结果表明,用改良法培养的MSC高表达CD90、CD105、CD13、CD44,低表达CD14、CD45、CD34;细胞周期中G0/G1期88.76%,G2/M期3.04%,S期8.2%,符合干细胞周期特征;增殖曲线呈典型"S"型;油红O与碱性磷酸酶染色均为阳性。同时与传统方法相比,改良方法的细胞贴壁率显著高于传统方法(P=0.0004),首次贴壁时间短(P<0.0001)、首次传代时间短(P=0.001)。结论:骨髓标本培养48 h后的上清层中含大量贴壁活性的悬浮MSC,改良方法是一种比传统贴壁法更具有便捷、高效等优点的培养方法。

全骨髓贴壁法分离培养小鼠骨髓间充质干细胞

为体外建立一种高效、稳定的从小鼠骨髓中分离培养间充质干细胞的方法。采用全骨髓贴壁法分离C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,传至第三代后运用流式细胞术检测第三代细胞的表面抗原;取第三代细胞,分别向成骨、成软骨诱导分化。结果显示:流式细胞术检测CD29、Scal-1、CD45的阳性率分别为97.1%、87.1%、0.7%;在成骨培养基的诱导下,碱性磷酸酶染色、茜素红染色均呈阳性;在成软骨培养基的诱导下,阿利辛蓝染色阳性。由此可知,通过此方法可以获得较高纯度的小鼠骨髓间充质干细胞,并且具有多向分化潜能。

应用全骨髓贴壁法获取高纯度大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的探讨体外获取高纯度大鼠骨髓间充质干细胞的方法。方法应用全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,进行传代培养,倒置显微镜下观察细胞形态并测定其生长曲线,流式细胞术检测细胞周期,免疫细胞化学法鉴定细胞表面标志CD34、CD44及CD45。结果获取的大鼠骨髓间充质干细胞形态呈均一成纤维细胞样,并呈集落样生长。细胞生长曲线示,在传代后的第4-5天细胞开始明显增殖,进入指数增生期。细胞周期显示81.49%P3代细胞为G0/G1期,经免疫细胞化学染色结果显示CD44阳性,CD34、CD45阴性。结论体外应用全骨髓贴壁法可以分离培养出高纯度的大鼠骨髓间充质干细胞,而且此法简单易行、经济。

全骨髓贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞

目的采用全骨髓贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),并进行成骨、脂肪细胞诱导分化及鉴定。方法采用全骨髓贴壁法分离培养兔BMSCs,倒置显微镜下观察细胞的形态及生长状况;分别绘制BMSCs的生长曲线及贴壁率曲线,检测细胞活性;诱导细胞向脂肪及成骨细胞方向分化,检测细胞的多向分化潜能。结果分离培养的原代BMSCs 24 h出现贴壁现象,6 d后出现明显的集落生长,传代后细胞呈长梭形,形态均一,纯度高。P3代细胞培养2 h贴壁30%以上,4 h贴壁60%,8 h贴壁70%以上,12 h贴壁90%。细胞生长曲线呈S形,显示细胞分别在第2、3、8天进入潜伏期、对数期、平台期。加入成骨及脂肪细胞诱导剂后,细胞碱性磷酸酶及油红O染色均阳性,表现出成骨及脂肪细胞的生物学特征。结论全骨髓贴壁法分离培养获得的细胞纯度较高,活性较强,增殖快,且具有BMSCs的一般生物学特性,此方法可以作为组织工程获取BMSCs的一种常用方法。

全骨髓贴壁法获取组织工程髓核种子细胞的相关研究

目的明确兔骨髓间充质干细胞的分化能力及分化条件,以TGF-β3和BMP-7诱导兔骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化,为组织工程髓核的构建提供良好的种子细胞。方法利用全骨髓贴壁法分离获取兔骨髓间充质干细胞,并对细胞进行培养和传代,以特定的环境及细胞诱导液进行诱导,促使其向特定的中胚层细胞分化。再将细胞分为四组,A:空白对照组,B:BMP-7诱导组,C:TGF-β3诱导组,D:TGF-β3与BMP-7共同诱导组,诱导21天后对蛋白聚糖、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和SOX9基因进行realtime-PCR检测。结果全骨髓贴壁法分离获得的原代兔骨髓间充质干细胞生长良好,2周后显微镜下观察细胞间形态较为一致,成纺锤形。细胞传代后生长良好。细胞表面表达CD29、CD105、CD166表面标记物。在成骨诱导培养液、成软骨诱导培养液和脂肪诱导培养液的诱导下,培养21天后,通过特定染色发现兔骨髓间充质干细胞向预定方向分化生长。以TGF-β3和BMP-7生长因子诱导21天后,蛋白聚糖、Ⅱ型胶原和SOX9基因表达C组和D组明显高于A组和B组(P<0.05),X型胶原表达A组和B组明显高于C组和D组(P<0.05),Ⅰ型胶原表达四组之间无明显差异。结论全骨髓贴壁法可以成功分离获得状态良好的兔骨髓间充质干细胞,在成骨诱导培养液、成软骨诱导培养液和脂肪诱导培养液的诱导下,兔骨髓间充质干细胞可向预定的方向分化且生长良好。TGF-β3和BMP-7诱导兔骨髓间充质干细胞后可明显提高其类髓核细胞具有的下游基因表达水平。

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞研究

目的探讨体外全骨髓贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞的可行性,为体外获取纯度较高的骨髓间充质干细胞提供理论基础。方法采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,倒置相差显微镜下观察细胞的黏附、增殖及细胞形态的变化,并采用MTT法绘制P3代细胞生长曲线。结果全骨髓贴壁法分离出的骨髓间充质干细胞经多次换液及传代后得到形态比较一致的典型的纤维样细胞,细胞呈漩涡样、栅栏样及鱼群样集落式生长,细胞间紧密排列,细胞生长曲线呈近似"S"型。结论全骨髓贴壁法能分离出纯度较高的骨髓间充质干细胞,且能最大限度的保持细胞活力。

体外全骨髓贴壁法培养人骨髓间充质干细胞的实验研究

目的探讨体外采用全骨髓贴壁法分离培养人骨髓间充质干细胞(human bone mesenchymal stem cells,h BMSCs)的可行性,为研究h BMSCs提供实验细胞来源。方法从因创伤导致骨折需行骨折复位及髂骨植骨术的志愿者中,获取骨髓,采用全骨髓贴壁法培养和分离h BMSCs,在倒置相差显微镜下观察细胞生长形态,取P3代细胞行表型鉴定;取P1、P2、P3代细胞,分别用胰蛋白酶消化,以培养时间为横轴,细胞数量为纵轴,绘制h BMSCs生长曲线图。结果经全骨髓贴壁法培养分离获得了纯度较高的h BMSCs,细胞呈均一的长梭形、短梭形及多角形,漩涡状或辐射状结构,绘制的生长曲线呈S形。P3代h BMSCs经流式细胞鉴定:CD29、CD44、CD90、CD105分别为99.6%、100%、99.4%、92.5%,呈阳性表达;而表达CD34、CD45分别为0.5%、0.6%,呈阴性表达。结论体外应用全骨髓贴壁培养法可成功分离h BMSCs,方法操作简单易行、经济,且能最大限度的保持细胞活力。

全骨髓贴壁法与密度梯度离心法培养小鼠内皮祖细胞的方法比较

目的:比较全骨髓贴壁法与密度梯度离心法分离培养小鼠内皮祖细胞(EPCs)的差异。方法:取8周龄雄性近交系昆明小鼠,提取原代EPCs,分别采用全骨髓贴壁法和密度梯度离心法分离培养细胞,观察细胞形态、细胞摄取DiI-acLDL、结合FITC-UEA-I双阳性率及细胞生长增殖情况。结果:全骨髓贴壁法培养第4天,可见较多贴壁细胞,呈圆形、短梭形,部分为长梭形;第6~8天贴壁细胞多为梭形及类圆形;随着培养时间的延长,梭形细胞数量渐渐增多,可出现细胞集落,10d后EPCs大量增殖,14d细胞长满培养瓶底部。密度梯度离心法接种24h后可见圆形贴壁细胞,并逐渐增多变形;培养至第4~7天,可以观察到贴壁细胞明显增多且体积变大,细胞为类圆形、梭形或多边形,第7~9天,细胞呈集落生长,多数细胞呈多边形或长梭型;培养至第2周可见贴壁细胞生长呈"铺路石"样外观。全骨髓贴壁法细胞摄取DiI-acLDL和结合FITC-UEA-I双阳性率高于密度梯度离心法(P<0.05),但两种方法细胞增殖率比较无明显差异(P>0.05)。结论:全骨髓贴壁法与密度梯度离心法均可培养出EPCs,且两种方法培养的细胞增殖活性相当,但前者更简单易行,EPCs培养成功率更高。

优化骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的:探讨全骨髓贴壁培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的优化方法。方法:全骨髓贴壁法分离、体外培养原代大鼠骨髓MSC,种植后3 h首次换液,培养前72 h内频繁换液;通过流式细胞学方法检测原代培养细胞的MSC特征性表面标记的表达及比例;通过体外培养诱导成脂、成骨、成软骨分化,确立原代培养骨髓MSC的多向分化潜能。结果:早期、频繁换液的方法分离培养大鼠骨髓MSC,P0 MSC以单克隆生长,呈典型漩涡状排列,细胞形态均一;P1细胞均一表达CD29、CD44,不表达CD34、CD45;原代培养骨髓MSC具有成脂、成骨、成软骨分化潜能。结论:全骨髓贴壁法分离培养大鼠原代骨髓MSC,早期、频繁换液有助于在早期获得高纯度细胞,原代细胞具有多向分化潜能。早期、频繁换液的全骨髓贴壁法是体外分离培养骨髓MSC的优化方法。

全骨髓细胞贴壁法分离与培养大鼠骨髓间充质干细胞的多向分化能力

背景:分离培养纯度较高的骨髓间充质干细胞是对其进行深入研究的前提。目的:观察全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特征。方法:选取体质量为80-100g雄性SD大鼠,采用全骨髓细胞贴壁培养法获取骨髓间充质干细胞。在取材过程中需严格掌握大鼠处死至将细胞悬液放入培养箱内的时间,一般控制在40min以内。使用基础培养基冲洗骨髓腔时力度适中且在骨髓腔内旋转数次,可使骨髓细胞充分脱落,保证骨髓细胞的获得量。结果与结论:原代骨髓间充质干细胞为贴壁生长的成纤维样细胞,传代后的细胞形态均一,呈漩涡状排列;第3代骨髓间充质干细胞的生长曲线呈S形,经历3个生长时期:潜伏期、对数生长期和停滞期;流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面抗原结果示:CD29+99.45%、CD34+1.45%、CD44+99.52%、CD45+1.41%;成骨、成脂诱导分化后,矿化结节被茜素红染成橘红色,脂滴被油红O染成红色。说明骨髓间充质干细胞能向成骨、成脂分化,具有多向分化潜能,符合国际细胞治疗学会间充质及组织干细胞委员会提出的鉴定动物来源骨髓间充质干细胞的最低标准。

改良全骨髓贴壁法分离与纯化大鼠骨髓间充质干细胞

目的探讨有效的分离与纯化大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)方案,并研究BMSCs基本生物学特性。方法取SPF级4周龄健康SD大鼠1只,采用改良全骨髓贴壁法分离提取BMSCs,用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及其生长特性,利用流式细胞仪检测P3代细胞表面标志物,细胞计数试剂盒(CCK)-8法绘制P3代细胞生长曲线。结果体外分离的原代细胞可见典型的贴壁生长,形态以梭形和多角形为主,呈旋涡状细胞集落,约8 d可达80%以上融合。传代纯化后细胞形态均一,具有较强的增殖能力。生长曲线提示BMSCs呈S形趋势。P3代BMSCs代表面标志物分化群(CD)29、CD90阳性表达,而CD11b、CD45阴性表达。结论改良全骨髓贴壁法可获得高纯度、增殖活跃、生物学特性稳定的BMSCs,BMSCs的生长曲线呈S形趋势。

全骨髓贴壁法分离培养人骨髓间充质干细胞及成骨诱导分化

目的:探讨体外分离骨髓间充质干细胞的方法及其成骨潜能。方法:应用全骨髓贴壁法分离培养人骨髓间充质干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞周期及免疫表型,碱性磷酸酶及茜素红染色检测成骨能力。结果:传代后的人骨髓间充质干细胞形态均一呈成纤维细胞样。第三代骨髓间充质干细胞免疫表型CD90、CD13、CD105、CD44阳性,CD34、CD45、CD14阴性。96.47%细胞处于G0/G1期,14d、21d成骨诱导培养后碱性磷酸酶及茜素红染色阳性。结论:应用全骨髓贴壁法体外分离培养人骨髓间充质干细胞简便、经济、高效。

小鼠骨髓间充质干细胞分离方法的比较与探讨

目的探讨可高效分离小鼠骨髓间充质干细胞(mBMSCs)的技术方法。方法分别采用骨片消化爬片法、全骨髓贴壁法、骨片消化液上清法和骨片消化研钵法等四种方法分离7~9周龄雄性C57BL/6小鼠的mBMSCs;于倒置显微镜下观察原代mBMSCs形态;运用流式细胞术检测mBMSCs特征性免疫表型;采用多向分化诱导检测mBMSCs成骨分化能力与成脂分化能力。结果分离获得的原代细胞首次换液后于倒置显微镜下观察:骨片消化爬片法分离的细胞,仅见大量骨碎片和杂细胞,该法所分离细胞不再进行后续检测评估;全骨髓贴壁法分离的细胞,仅可见少量多角形贴壁细胞,夹杂大量杂细胞;骨片消化液上清法分离的细胞也可见较多长梭形、三角形贴壁细胞,但杂细胞较多;骨片消化研钵法分离的细胞,可见较多长梭形、多角形贴壁细胞,杂细胞少。分离细胞经培养传代到第3代(P3代)时,一方面采用流式细胞术分析mBMSCs特征性免疫表型,结果表明骨片消化液上清法和骨片消化研钵法分离的mBMSCs纯度均较高,全骨髓贴壁法不理想;另一方面,进行成骨分化诱导与成脂分化诱导,结果表明与全骨髓贴壁法分离的细胞相比,骨片消化液上清法和骨片消化研钵法所分离出的细胞具有较强的多向分化潜能。结论骨片消化液上清法和骨片消化研钵法分离获得的mBMSCs纯度较高、质量较好。

建立ICR小鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养及鉴定方法

目的:建立一种简单的高效分离、培养、纯化和鉴定ICR小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)的方法,初步研究其相关生物学特性。方法:全骨髓贴壁法分离培养BMSCs,用倒置显微镜观察细胞的形态和生长情况;用流式细胞仪鉴定细胞表面标记物;诱导细胞定向分化为成脂细胞、成骨细胞,以检测细胞多向诱导分化能力。结果:利用该方法纯化的BMSCs形态均一,多为梭形。第3代BMSCs进行流式检测CD29、CD44均呈阳性表达,表达率分别为97%、90%;CD34、CD45呈阴性表达;且能够成功诱导分化成成骨细胞、成脂细胞。结论:利用全骨髓贴壁法可以高效分离、纯化ICR小鼠的BMSCs,生物学特性稳定。

骨髓间充质干细胞分离培养方法及其对CD8＋T淋巴细胞的免疫调控

背景:骨髓间充质干细胞具有免疫调节特性,使其在免疫抑制方面有可预期的应用价值。目的:探讨骨髓间充质干细胞的分离培养方法及其对CD8^+T淋巴细胞的免疫调控。方法:采用骨髓直接贴壁法获得原代Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,利用差速贴壁结合消化法纯化原代细胞,加入Ⅰ型胶原蛋白作为细胞外基质,扩增骨髓间充质干细胞。取第2代骨髓间充质干细胞,分别将0,1×10~3,1×10~4,1×10~5/well的骨髓间充质干细胞与CD8^+T淋巴细胞共培养,植物血凝素刺激68 h,荧光CFSE法观察CD8^+T淋巴细胞聚集,MTT法检测CD8^+T淋巴细胞增殖率。结果与结论:(1)不同密度骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞均有抑制作用,1×10~3/well组抑制能力最弱,形成集落现象;1×105/well组抑制能力最强,细胞未见明显聚集现象;(2)1×10~3,1×10~4,1×10~5/well组CD8^+T淋巴细胞增殖率分别为(44.83±4.92)%、(31.94±6.28)%及(15.77±3.98)%,3组间两两比较差异均有显著性意义(P<0.05);(3)结果表明,采用全骨髓直接贴壁法能获得原代大鼠骨髓间充质干细胞,采用差速贴壁联合消化控制法能完成细胞纯化,骨髓间充质干细胞浓度依赖性抑制T淋巴细胞增殖。

大鼠骨髓基质干细胞的改良培养方法及Hoechst体外标记研究

目的:改良大鼠骨髓基质干细胞全骨髓贴壁培养法,并进行Hoechst体外标记初步研究。方法:采用改良全骨髓贴壁法分离扩增大鼠骨髓基质干细胞,以MTT比色实验观察细胞生长状态并绘制生长曲线,行体外诱导向成骨细胞及脂肪细胞分化,以流式细胞术检测细胞表面抗原。以Hoechst体外标记大鼠骨髓基质干细胞,荧光显微镜下计数并观察Hoechest对细胞生长状态的影响。结果:改良全骨髓贴壁培养法能够在较短时间内获得纯化并具备高活性的骨髓基质干细胞,并成功诱导其分化为成骨细胞及脂肪细胞。流式细胞术检测显示细胞表面CD29、CD90、CD44均为阳性,CD45、CD34均为阴性。荧光显微镜观察Hoechst能够在体外成功标记骨髓基质干细胞,并对细胞的生长无明显影响。结论:经改良后的全骨髓贴壁培养法是获得纯化骨髓基质干细胞的一种更为简捷、高效、经济的途径,Hoechst可作为体外标记大鼠骨髓基质干细胞的标记物。

全骨髓贴壁培养兔骨髓间充质干细胞的初步研究

目的:探讨兔骨髓间充质干细胞作为组织工程种子细胞修复骨缺损的可能性。方法:选取2月龄约2.5 kg重健康新西兰兔8只,采用全骨髓贴壁培养法体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,通过倒置相差显微镜观察、MTT检测、细胞贴壁率检测观察细胞生物学特性。结果:全骨髓贴壁培养法培养出的原代骨髓间充质干细胞活力良好,细胞数量经传代后扩增,且细胞纯度提高,但细胞扩增速度较慢。结论:全骨髓贴壁培养法简便易行,能有效的在体外获得原代骨髓间充质干细胞。所提取的细胞活性良好、纯度较高,能用作组织工程种子细胞治疗骨缺损。