人造血干/祖细胞多态性的研究:Ⅲ.骨髓CD34^+造血干/祖细胞功能亚群的分析

CD 34^+造血干/祖细胞(HSC/HPC)是十分异质性的,由多个不同功能亚群所构成,在分化方向与重建造血等方面差异显著。本文对正常人骨髓CD 34^+ HSC/HPC各亚群进行了较全面的分析。首先以阳性选择策略,采用Isolex^(TM) 50免疫磁球分选术富集骨髓CD 34^+HSC/HPC,其纯度>90%,随之采用免疫荧光抗体双标记二维流式细胞仪对其测定,发现高纯度的CD 34^+HSC/HPC可分为八个不同亚群:1.CD 34^+/CD 71^-(23.4%—56.6%)与CD 34^+/CD 71^+(33.4%—66.6%);2.CD34^+/CD 45^-(80.8%—82.5%)与CD34^+/CD 45^+(8.1%—11.2%);3.CD 34^+/CD 33^-(20.4%—80.6%)与CD 34^+/CD 33^+(14.6%—64.8%);4.CD 34^+/DR^-(6.3%—11.0%)与CD 34^+/DR^+(82.8%—85.5%)。用免疫胶体金——免疫桥酶联组化双染色对上述亚群进一步分析的结果与流式细胞仪的高度一致。

骨髓增生异常综合征CD34^+造血干祖细胞生物学特征研究进展

骨髓增生异常综合征(MDS)是一组异质性、克隆性造血干/祖细胞疾病。本文就MDS恶性造血克隆的起源、CD34^+造血干/祖细胞增殖动力学异常、凋亡异常及其机制、信号传导异常等作一综述。

人参总皂甙协同造血生长因子体外诱导CD34^+造血干/祖细胞扩增与分化的作用

为探讨人参总皂甙(totalsaponins of panaxginseng,TSPG)协同造血生长因子体外诱导CD34+造血干/祖细胞(HSC/HPC)扩增与分化的作用,收集人脐血、骨髓细胞并采用StemsepTM干细胞分选系统分离纯化CD34+HSC/HPC,用不同剂量TSPG加入不同组合的造血生长因子进行培养,检测细胞总数、CD34+细胞和CD33+细胞比例及集落形成细胞总数(CFC)、粒系祖细胞(CFU-GM)数量变化。结果显示:10-70μg/mlTSPG均可不同程度地提高脐血细胞总数、CFC数和CD34+细胞数,50μg/ml是最佳刺激浓度,可使细胞总数、CFC数和CD34+细胞数分别增至(2470.5±79.96)×103、(53.96±4.29)×100%和(21.86±3.09)×100%;20μg/ml是液体培养诱导骨髓CD34+细胞向粒系分化的最佳浓度,可使细胞总数、CFU-GM和CD33+细胞分别增至(133.2±9.03)×103、(26.78±1.91)×100%和(16.98±1.73)×100%;甲基纤维素半固体培养检测显示,TSPG(10-50μg/ml)均能提高CD34+细胞形成CFU-GM的集落产率,以TSPG20μg/ml效果最为明显。结论:合适剂量的TSPG能够促进CD34+造血干/祖细胞体外扩增与定向诱导分化。

人参总皂甙体外诱导CD34^+造血干/祖细胞增殖的作用

目的：探讨人参总皂甙(TSPG)协同造血生长因子体外诱导CD34^+造血干/祖细胞(HSC/HPC)增殖的作用。方法：收集人脐血细胞,采用Stemsep TM干细胞分选系统分离纯化CD34^+HSC/HPC,经不同剂量TSPG加入不同造血生长因子组合进行培养,检测细胞总数、CD34^+细胞及集落形成细胞总数(CFCs)的变化。结果：TSPG 10、20、50和70μg/ml均可不同程度地提高细胞总数、CFCs和CD34^+细胞扩增倍数,TSPG 50μg/ml是最佳刺激浓度,可使细胞总数、CFCs和CD34^+细胞分别增至(2470．50±79．96)倍、(53．96±4．29)倍和(21．86士3．09)倍。结论：合适剂量的TSPG能够促进CD34^+造血干/祖细胞体外增殖。

增殖细胞核抗原在脐血CD34^+造血干/祖细胞中的表达及意义

目的 探讨增殖细胞核抗原 (PCNA)在脐血造血干 /祖细胞中的表达及意义。方法 采用流式细胞仪技术对不同培养时间和不同培养条件下脐血CD34+ 细胞中PCNA的表达水平和细胞周期进行了测定。结果 新鲜分离的脐血中CD34+ 细胞低表达PCNA ,阳性率为 (11 6± 5 2 ) % ,在体外短期培养 ,无细胞因子的组合PCNA表达逐渐下降 ,而在含有各细胞因子组合的培养体系中 ,PCNA表达水平明显增高 ,其中以SCF ,IL - 3,IL - 6 ,FL ,Tpo组合作用最显著 ,在培养第 7天时 ,PCNA蛋白表达率为 (78 2± 8 7) % ,且S/G2 /M期的细胞占 (5 9 8± 6 7) % ,明显高于培养前。结论 脐血CD34+ 细胞低水平表达PCNA ,造血生长因子对CD34+ 细胞的促增殖作用与上调PCNA蛋白的表达有关。

2型重组腺相关病毒对人脐血CD34^+造血干/祖细胞的转导效率研究

为探讨 2型重组腺相关病毒 (rAAV 2 )载体能否有效地转导脐血CD34+造血干 /祖细胞 ,采用rAAV 2 /GFP感染经免疫磁珠法分离的脐血CD34+造血干 /祖细胞 ,在荧光显微镜下观察GFP的表达。结果显示 ,转导 19小时后感染复数 (MOI)为 2× 10 5时 ,CD34+细胞GFP基因的表达率为 4 3%。结论 :rAAV 2能有效地转导脐血CD34+造血干 /祖细胞。

CD34^+造血干/祖细胞蛋白质组双向电泳图谱的建立

目的探讨骨髓(BM)和动员后外周血(MPB)CD34+细胞的蛋白质差异表达情况。方法应用免疫磁珠法分离、纯化正常人骨髓和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员后外周血单个核细胞(MNCs)中的CD34+细胞,冻融法提取CD34+细胞的全细胞蛋白质进行双向电泳,并对电泳结果进行图像分析。结果纯化后CD34+细胞的平均纯度为(92.33±2.65)%;每次纯化获得的CD34+细胞数平均为(1.12±0.42)×106个。优化的双向电泳技术获得较为理想的蛋白质组图谱,显示出不同来源的CD34+细胞存在不同的蛋白质表达。结论免疫磁珠联合双向电泳适用于造血干/祖细胞的蛋白质组研究,骨髓和动员后外周血CD34+细胞的蛋白质表达存在差异。

健康人骨髓CD34^+造血干/祖细胞衰老与年龄的相关性研究

目的探讨增龄过程中健康人CD34^+造血干/祖细胞(CD34^+HSC/HPCs)衰老的变化过程。方法由重庆医科大学附属第一医院血液科骨穿室提供正常人骨髓9例,将其分为青年组3例(女性31岁、男性26岁、男性28岁)、中年组3例(男性59岁、男性57岁、女性52岁)和老年组3例(男性70岁、男性70岁、女性62岁)。提取骨髓单个核细胞(BMNCs)后,免疫磁性细胞分选法分离纯化CD34^+细胞群,流式细胞术检测细胞纯度,台盼蓝染色检测细胞活性,衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色观察各年龄组阳性细胞百分比;造血干/祖细胞混合集落培养比较各年龄组CD34^+造血干/祖细胞形成混合集落能力。结果分选前每106个BMNCs中CD34^+细胞群比例为(1. 31±0. 54)%;免疫磁性分选后每106个细胞中CD34^+细胞群比例为(92. 5±0. 39)%。各年龄组人骨髓CD34^+造血干/祖细胞存活率可达99. 1%以上。人骨髓CD34^+造血干/祖细胞的SA-β-gal染色阳性率出现明显的随增龄变化趋势,老年组明显高于中年组及青年组。CD34^+造血干/祖细胞形成的干细胞混合集落能力随年龄增加降低。结论随年龄增加人骨髓CD34^+造血干/祖细胞出现明显衰老,表现为造血增殖能力下降,可能是造成一些老年人血液学疾病的原因。

血小板生成素诱导胎肝CD34^+造血干/祖细胞增殖分化与周期蛋白表达的关系

为了解胚胎时期巨核细胞增殖分化特有的内在机制 ,本研究观察了在体外培养体系中 ,胎肝源CD3 4 +造血干 /祖细胞在血小板生成素 (thrombopoietin ,TPO)作用下增殖分化特征与相关周期蛋白B1、D1和D3表达及细胞内水平变化的关系。结果发现 :( 1)经 12d培养后 ,TPO使胎肝源CD3 4 +细胞数从 1× 0 5个细胞 /ml增加到 13 12± 4 0 6× 10 5个细胞 /ml,CD4 1+细胞增加到了 95 % ,CD3 4 +细胞下降到了 3 % ,大部分细胞的DNA倍性为 2N ,少数为 4N ,无大于 4N巨核细胞 ,TPO对MegaCultTm C胶原半固体培养体系中胎肝源CD3 4 +细胞形成CFU Mk集落产率的影响呈明显的剂量效应关系 ;( 2 )在整个培养期间 ,周期蛋白B1表达逐渐增加 ,并保持在一个高水平上 ,培养后期 ,高水平的周期蛋白B1出现在G1期细胞上 ;( 3 )周期蛋白D1和D3表达先增加 ,培养后期细胞内水平下降 ,且以G2期细胞为主。该结果提示 :( 1)TPO通过上调周期蛋白B1和在所有细胞周期时限上调周期蛋白D1和D3表达 ,促进巨核细胞祖细胞的增殖分化 ;( 2 )周期蛋白B1在G2 +M期的持续高水平和周期蛋白D1和D3在G2 +M期的水平下降 ,可能导致胎肝源巨核细胞核内有丝分裂延迟或阻滞。

脐血CD34^+造血干/祖细胞基因表达图谱的研究

目的通过脐血CD34+造血干/祖细胞的基因表达分析,理解造血干/祖细胞生物学特性。方法利用Min-iMACS免疫磁珠法从脐血细胞中分离CD34+造血干/祖细胞,提取总RNA,用SMART-PCR技术从微量RNA中扩增产生足够量的cDNA用于高密度点阵膜分析检测CD34+造血干/祖细胞表达的基因。结果在所检测的588个基因中,发现63个基因具有显著的表达水平,其中18个基因强表达。这些基因主要涉及造血干细胞增殖、分化、应激响应、凋亡、转录调节以及细胞周期等。结论对理解脐血干/祖细胞生物学性质以及指导造血干细胞体外培养提供了分子生物学基础。

青蒿琥酯对K562细胞和脐血CD34^+造血干/祖细胞的选择性作用

目的探讨青蒿琥酯(artesunate,AST)对K562细胞和正常造血干/祖细胞是否具有选择性作用。方法选用K562细胞及脐血CD34+造血干/祖细胞,加入不同浓度AST。MTT法检测药物对上述两种细胞增殖的影响;甲基纤维素半固体培养法考察AST对其体外扩增和多向分化能力的影响;以流式细胞术Annexin V-FITC-PI双染定量检测细胞凋亡率;Western blot方法检测BCR-ABL融合蛋白的表达。结果青蒿琥酯对K562细胞有明显的抑制增殖和诱导凋亡的作用(P<0.01),并存在时效和量效关系,对集落抑制作用明显(P<0.01)。青蒿琥酯在12.5~25μg/ml作用48h对脐血CD34+造血干/祖细胞增殖抑制作用和诱导凋亡作用不明显(P>0.05),对集落生成亦无明显抑制作用(P>0.05)。经青蒿琥酯作用48h,K562细胞BCR-ABL蛋白以剂量依赖方式被降解(P<0.01)。结论青蒿琥酯在一定浓度范围内对K562细胞具有选择性抑制增殖和诱导凋亡的作用,对脐血CD34+造血干/祖细胞影响较小。

人骨髓CD34^+造血细胞体外扩增形成HPP-CFC造血祖细胞的能力

目的和方法：高增殖潜能集落形成细胞（ＨＰＰＣＦＣ）是表达ＣＤ３４＋ＤＲＬｉｎ－的最早期造血祖细胞之一，它在体外的增殖分化能力可反映造血干细胞的某些特征。结果：本文研究了人正常骨髓ＣＤ３４＋造血细胞在体外扩增和形成ＨＰＰＣＦＣ的能力。利用ＣＩＭＳ１００免疫磁性分离术首先获得＞９０％的ＣＤ３４＋造血细胞以富集ＨＰＰＣＦＣ。在含有Ｅｐｏ＋ＧＭＣＳＦ＋ＩＬ３＋ＩＬ６＋ＳＣＦ（简ＥＧＩＩＳ）的无基质液培条件下，ＣＤ３４＋造血细胞在四周内可持续产生单个核细胞和ＨＰＰＣＦＣ，并使其总量最高可达１７７０倍和８倍，以第２和３周为最佳时期，但不同个体ＣＤ３４＋造血细胞的这种能力差别较大。结论：高度纯化的人骨髓ＣＤ３４＋造血细胞能够在含有最佳组合造血生长因子的无基质液培条件下持续扩增，为临床应用提供了重要依据。

自体外周血CD_(34)^+造血干细胞移植治疗多发性骨髓瘤

[目的]探讨自体外周血CD+ 造血干细胞移植治疗多发性骨髓瘤的可行性。[方法]应用CliniMACS系统分选纯化患者外周血CD+ 造血干细胞 ,用流式细胞仪检测分选纯化结果。选马法兰200mg/m2 作为预处理方案。[结果]分选纯化结果 ,单个核细胞数为3.7136×108,活性率96.6% ,CD+ 细胞数3.68018×108,即5.52×106/kg。移植后患者骨髓像获得完全缓解。移植相关并发症少且易于控制。[结论]自体外周血CD+ 造血干细胞移植治疗多发性骨髓瘤是安全、有效、可行的。

骨髓造血干/祖细胞及CD4^+/CD8^+比值联合测定在再生障碍性贫血患者诊疗中的价值

目的:探讨再生障碍性贫血(AA)患者外周血T细胞亚群CD3+CD4+(CD4+)/CD3+CD8+(CD8+)比值和骨髓造血细胞体外集落形成的变化、相关性及其联合检测在AA患者临床诊疗中的价值。方法:应用甲基纤维素半固体体外集落试验对AA患者骨髓单个核细胞培养,观察混合集落形成情况;流式细胞术分析AA患者外周血CD4+/CD8+阳性细胞比值变化,依据CD4+/CD8+比值将AA(59/70)患者分为比值正常型、比值倒置型和比值超高型三个免疫亚型。结果:59例有集落或集簇生成的AA患者,其中比值倒置型占45.8%,比值超高型占20.3%,AA患者组干细胞集落数低于同等条件下对照组的干细胞集落数(35.88对125.26,P<0.001);相关性分析,AA患者骨髓混合集落数与CD8+T细胞数呈负相关(P=0.027),与控制CD4+T细胞影响的CD4+/CD8+比值呈正相关。结论:通过对T细胞亚群CD4+/CD8+比值和骨髓造血干/祖细胞体外集落形成的联合检测可为AA患者临床诊断、分型、病情判断提供重要参考,为临床制订个体化治疗方案提供重要实验依据。

人类CD34^＋造血干／祖细胞的分子生物学特性

造血干／祖细胞（ＨＳＣ／ＨＰＣ）以有序的不同年龄等级结构状态存在于体内，它们的增殖、分化、成熟及程序死亡是一个连续的动态过程。ＣＤ３４抗原是目前所能认识表达在ＨＳＣ／ＨＰＣ表面上的最早抗原分子，对其分子结构的研究使人们更加认识到ＣＤ３４＋ＨＳＣ／ＨＰＣ的不同功能亚群、表达范围及其它生物学特征，诸如细胞周期状态、光散射性、造血生长因子受体（ＨＧＦｓＲ）Ｐ糖蛋白（Ｐｇｎ）或多药耐药基因（ＭＤＲ）的表达以及对活性染料的摄取等，从而完善并更新了现代ＨＳＣ的概念及正常造血调控的基本模式。

高剂量化疗联合自体外周血造血干细胞移植时骨髓及外周血采集物中CD34^+细胞黏附分子的表达

本研究的目的是应用免疫荧光直接三色标记和流式细胞术 (FCM) ,观测高剂量化疗 (HDC)联合自体外周血造血干细胞移植 (APBSCT)时不同阶段的骨髓及外周血CD3 4 +细胞 ,表达CD5 4、CD4 9d和CD62L的情况 ,探讨不同来源的CD3 4 +细胞表达黏附分子的差异及其临床意义。将动员前、干细胞采集后和移植结束而骨髓重建后的骨髓样本及每次外周血单个核细胞样本 ,以CD3 4 PE和CD4 5 PerCP标记的同时 ,分别加CD5 4 FITC、CD4 9d FITC、CD62L FITC直接三色荧光标记 ,应用FACS测定CD3 4 +细胞及各黏附分子表达情况 ,并比较不同时段骨髓中各类黏附分子表达的差异 ,以及外周血造血干细胞采集物与动员前骨髓中各类黏附分子表达的差异。结果表明 ,动员前、采集后及移植重建后骨髓中CD3 4 +细胞对CD5 4、CD4 9d和CD62L表达的变化无统计学差异 ;造血干细胞第 1和第 2次采集物之间CD3 4 +细胞对CD5 4、CD4 9d和CD62L的表达变化也无统计学差异 ;而造血干细胞采集物中CD3 4 +、CD4 9+细胞较之动员前骨髓中CD3 4 +CD4 9d+细胞明显减少 (P =0 .0 0 1)。结论 :化疗联合粒细胞集落刺激因子 (G CSF)的动员方法 ,可使骨髓中CD3 4 +细胞的CD4 9d表达下调 ,并使之动员而进入外周血。移植重建后骨髓中CD3 4 +细胞的CD4

体外培养环境对脐血CD34^+造血干/祖细胞基因表达的影响

目的研究体外培养环境对脐血CD34+造血干/祖细胞基因表达的影响。方法脐血单个核细胞(MNC)在静态和动态培养系统中培养7d后,收集CD34+造血干/祖细胞,利用SMART-PCR技术从少量RNA中扩增cDNA用于标记探针,与基因芯片杂交后分析培养前后以及不同培养模式下培养的CD34+造血干/祖细胞基因表达的差异。结果在所检测的588个基因中,45个基因在培养前后的CD34+造血干/祖细胞中差异表达,其中20个基因在培养后表达上调,25个基因表达下调。另外,12个基因在不同培养模式中差异表达,只有CCL2在动态培养中高表达,而其余11个基因均在静态培养中高表达。结论通过分析体外培养环境对CD34+造血干/祖细胞基因表达的影响,可以在分子水平上理解CD34+造血干/祖细胞对培养环境的生理响应。

脐血单个核细胞和CD34^+细胞体外扩增造血干/祖细胞

考察了脐血单个核细胞 ( MNC)和 CD3 4 +富集细胞在 SCF+IL- 3 +IL- 6 +FL+Tpo细胞因子组合下的体外扩增特性。实验发现 :CD3 4 +富集细胞具有很高的扩增潜力 ,通过 3周培养总细胞扩增了 ( 883 .2± 3 2 2 .4)倍 ,而 MNC仅扩增了 ( 5 3 .3± 6 .2 )倍。对比细胞集落生成和 CD3 4 +细胞的扩增发现 ,MNC的集落密度由最初的 ( 2 70 .9± 5 4 .9) CFCs/ 1 0 5cells上升至第 7天的( 1 496 .3± 41 7.7) CFCs/ 1 0 5cells,CD3 4 +细胞百分比则由最初的 ( 0 .99± 0 .1 8) %上升至第 7天的( 4.4± 1 .9) % ,而 CD3 4 +富集细胞在培养过程中 ,虽然集落总数和 CD3 4 +细胞总数始终呈上升趋势 ,但是其集落密度和 CD3 4 + 细胞百分比则始终呈下降趋势。在两种起始细胞培养中 ,CFU- GM(粒细胞 -巨噬细胞集落形成单位 )在集落中的含量逐渐增加 ,BFU- E(爆式红细胞集落形成单位 )含量则逐渐降低。在 3周的短期培养中 ,MNC可以得到更多的集落形成细胞 ( CFC)和 CD3 4

血管内皮生长因子体外诱导CD34^+造血干/祖细胞信号传导与转录活化因子的活化

目的通过对血管内皮生长因子(VEGF)诱导CD34+造血干/祖细胞内信号传导与转录活化因子(STAT)活化的研究,探索VEGF作用于CD34+造血干/祖细胞的分子机制及其信号传导途径。方法利用磁活化细胞分选系统(MACS)分离并纯化脐血CD34+造血干/祖细胞,体外以重组人细胞因子VEGF(50ng/ml)持续刺激不同时间(0,15,30,45,60,90min)后,提取细胞总蛋白,用Westernblot检测CD34+造血干/祖细胞内STAT-3和STAT-5磷酸化;免疫细胞化学鉴定CD34+造血干/祖细胞表面VEGF受体-2(VEGFR2)的表达,以及VEGF刺激不同时间后CD34+造血干/祖细胞内磷酸化STAT-3和STAT-5有无发生转核;采用能与VEGFR2特异性结合的七肽ATWLPPR封闭VEGF与VEGFR2的结合,Westernblot观察STAT-3和STAT-5的磷酸化是否被相应阻断。结果Westernblot检测结果显示,CD34+细胞在VEGF刺激下,STAT-3和STAT-5均发生了磷酸化,50ng/mlVEGF作用15min后,即可检测到磷酸化的STAT-3和STAT-5的表达,并分别在30和45min时达到峰值;之后开始下降,到90min时均已检测不到,不同刺激时间组间有显著性差异(P=0.0001)。免疫细胞化学显示VEGF能诱导磷酸化STAT-3发生转核并且在作用30min时最为显著,不同刺激时间组间有显著性差异(P=0.0001),而磷酸化STAT-5在VEGF刺激的各时间组均未出现明显的转?