骨髓间充质干细胞在脑缺血模型大鼠脑组织中的迁徙、定居及组织修复作用

目的观察骨髓间充质干细胞(MSCs)移植后,在缺血性脑损伤大鼠脑组织中的迁徙、定居及组织修复作用。方法体外分离、纯化及培养MSCs。线栓法制备Wester大鼠脑缺血模型,经颈动脉移植DAPI标记的MSCs,通过激光共聚焦显微镜,分别在24h、5d及10d观察MSCs在脑组织内的迁徙及定居。采用三苯四氮唑活组织脑片染色方法,观察MSCs治疗对脑组织损伤的修复作用。结果MSCs经颈动脉移植后,在24h即出现在脑损伤区域血管内,第5天在血管周围组织内开始弥散,第10天在损伤区域可见广泛弥散。MSCs治疗20d后,脑片染色显示坏死区域减少。结论动脉移植MSCs后,MSCs首先出现在大鼠缺血性脑损伤区域血管内,然后在周围组织弥散,并可能参与损伤区血管及组织的修复。

淫羊藿总黄酮含药血清促进骨髓间充质干细胞增殖与成骨性分化

目的 研究淫羊藿总黄酮(Total flavonoid extract of Eimedium sagittatum,TFE)对大鼠骨髓间充质干细胞(Mysenchymal stem cells,MSCs)增殖和成骨性分化的影响。方法将TFE和含淫羊藿总黄酮大鼠血清(Serum of rats administered TFE,SES)分别以不同浓度加入大鼠MSCs培养液中,进行细胞增殖和成骨性分化的分析。细胞增殖分析采用MTT法,成骨性分化则检测碱性磷酸酶、骨钙素、钙盐沉积量等分化指标。结果TFE直接加入培养液对:MSCs增殖无明显影响,SES则强烈刺激细胞增殖,成倍增加碱性磷酸酶染色阳性的克隆数。TFE不影响MSCs的成骨性分化,但SES显著提高碱性磷酸酶活性、骨钙素分泌量和钙盐沉积量。结论 淫羊藿总黄酮活性代谢产物强烈刺激MSCs的增殖和成骨性分化,是淫羊藿总黄酮抗骨质疏松症的重要机制。

差速贴壁法纯化分离GFP转基因小鼠骨髓间充质干细胞

目的运用差速贴壁法分离纯化绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)。方法分离GFP转基因小鼠骨髓细胞直接种植在培养瓶中,分别于2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、24h和48h进行首次全量换液,培养3d后按细胞类型对贴壁细胞分别计数,并用CD44、CD45、CD54进行免疫细胞化学染色。另外,选4h、8h、24h后换液的细胞进行传代培养,传至第5代,计算扩增倍数,用CD44、CD45、CD54进行免疫细胞化学染色。结果随着首次换液时间的延长,贴壁细胞密度增多,BMSCs的比例减少。首次换液时间在接种后2h的细胞纯度高,但细胞密度低;24h后的细胞密度高而纯度低;8h后的细胞密度大具有较高的纯度。传代后的GFP转基因小鼠BMSCs能稳定表达GFP。结论差速贴壁法能有效分离纯化GFP转基因小鼠BMSCs,首次换液时间在接种后8～10h时的传代细胞纯度高,具有扩增能力,可作为组织工程和基因治疗研究的种子细胞。

小鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养

探索在体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞 (Bone m arrow m esenchym al stem cells,BMSCs)的最适条件。以密度梯度离心技术及贴壁筛选法相结合 ,在体外分离 BAL B/C小鼠的 BMSCs,通过 MTT法测定了不同离心力、不同换液时间、不同血清浓度、不同种植密度等因素对 BMSCs分离和培养的影响。在 5 0 0 g× 30 min的离心力下分离细胞 ,加入 10 %的胎牛血清 ,原代按 (12～ 2 0 )× 10 5/m l的细胞密度接种 ,接种 2 4 h后换液 ,继代种植密度为 6 .4～ 2 5 .6× 10 4 /ml时最适宜细胞生长 ;在此条件下 ,细胞快速增殖 ,传代后 8h贴壁达 90 %以上 ,2 4 h便进入对数生长期 ,直至第 5 d,细胞约增殖 3倍。本研究建立了在体外分离培养骨髓间充质干细胞的细胞生物学方法和技术参数。

丹参联合骨髓间充质干细胞静脉移植对兔心肌梗死区血管再生影响的实验研究

目的:探讨骨髓间充质干细胞静脉移植对兔急性心肌梗死(AMI)梗死区及梗死周围区血管新生的影响及中药丹参注射液对其的干预作用。方法:用开胸结扎冠状动脉左室支的方法建立急性心肌梗死模型,将已建立心肌梗死模型的日本大耳白兔随机分为3组,模型对照组、静脉移植骨髓间充质干细胞组、静脉移植骨髓间充值干细胞联合丹参组。术后5周取材,观察梗死区内CD31(血小板/内皮细胞黏附分子)和VEGF(血管内皮生长因子)蛋白的表达。结果:1.免疫组化CD31表达,静脉注射干细胞组和干细胞联合静脉注射丹参组高于模型组(P<0.05);2.免疫组化VEGF蛋白表达,各组间无统计学差异(P>0.05)。3.血清中VEGF蛋白含量,各组间无统计学差异(P>0.05)。结论:静脉注射骨髓间充质干细胞可诱导梗死区血管新生,其机制并非通过VEGF的表达来调节的,可能是通过其他途径调节的,中药丹参注射液对干细胞促进血管新生无明显促进作用。

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导失巢凋亡过程中半胱氨酸蛋白酶-3的作用

[目的]探讨在体外诱导骨髓间充质干细胞失巢凋亡过程中半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的作用。[方法]将体外培养的骨髓间充质干细胞随机分为3组:对照组、诱导凋亡组、抑制凋亡组。应用Caspase-3活性检测试剂盒,荧光比色法和W estern b lotting法检测失巢凋亡中Caspase-3活性的改变;借助流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞凋亡的变化。[结果]流式细胞术显示诱导凋亡组出现了明显的凋亡峰,凋亡率随诱导时间的延长而明显增加;其它两组的凋亡率较低且较稳定。W estern b lotting检测和Caspase-3活性荧光检测显示,诱导凋亡组Caspase-3的活性以及蛋白表达水平随诱导凋亡时间的延长而明显升高,且与细胞凋亡率相关,以后者更灵敏,其余两组活性无明显变化。[结论]Caspase-3蛋白在诱导骨髓间充质干细胞失巢凋亡的过程中发挥着重要作用;抑制Caspase-3的活性可以有效降低细胞失巢凋亡率。

人胚胎骨髓间充质干细胞的体外培养

目的摸索体外培养人胚胎骨髓间充质干细胞的方法。方法采用含5%胎牛血清的MEM(modified Eagle's medium)培养基培养人胚胎骨髓间充质干细胞,用流式细胞仪检测培养获得的细胞中人胚胎骨髓间充质干细胞含量。结果培养获得的细胞中人胚胎骨髓间充质干细胞含量达93%。结论本研究方法培养获得的人胚胎骨髓间充质干细胞纯度高,细胞活性好。

碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体转染骨髓间充质干细胞的表达

目的 :探讨碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)真核表达载体转染骨髓间充质干细胞 (MSCs)后的表达情况。方法 :应用脂质体介导的基因转移技术将bFGF真核表达载体导入MSCs,用抗药性标志选择方法筛选出阳性克隆后 ,用免疫细胞化学检测bFGF表达分泌情况。结果与结论 :经转染bFGF真核表达载体的MSCs细胞呈阳性 ,说明经转染的MSCs表达并分泌bFGF蛋白。

大鼠骨髓间充质干细胞原代培养换液频度与细胞增生的关系

目的:探索成体大鼠的骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离、体外培养方法,观察采用不同的换液频度与细胞增生和生长的关系,为其应用提供实验依据. 方法:从大鼠股骨获取骨髓,采用梯度离心的方法进行分离,在含10 mL/L胎牛血清的DMEM中常规培养,以MTT法检测不同的时间换液时细胞的生长曲线,并用碱性磷酸酶(AKF)检测的方法对分离的细胞进行鉴定. 结果:采用梯度离心方法分离的骨髓间质干细胞的纯度较高,细胞活性佳,AKF染色为强阴性.首次换液后,每天更换培养液比每隔3-4d换液一次更有利于MSCs的增生, 原代长满培养瓶底比每隔2-3d换液一次平均提前2d. 结论:采用梯度离心的方法分离可获得纯度较高的骨髓间质干细胞,是简单易行的分离方法,每天更换培养液比每隔3-4d换液一次更有利于MSCs的增生和形成形态均一的细胞集落.

清脑灵诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化成神经元样细胞

目的观察清脑灵煎剂是否能诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化成神经元样细胞。方法通过贴壁法分离获得大鼠骨使髓间充质干细胞,体外扩增培养,用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达。用浓度为1mg/mL的清脑灵煎剂诱导MSCs,分别于5h、12h、1d、3d、7d在倒置显微镜下观察细胞形态变化,用免疫细胞化学方法观察被诱导细胞巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果流式细胞仪检示MSCs不表达CD11b、CD45,诱导后细胞的免疫细胞化学示nestin阳性细胞、NSE阳性细胞和GFAP阴性细胞。结论清脑灵能诱导MSCs分化神经元样细胞。

骨髓间充质干细胞移植促进大鼠下颌骨牵张成骨的实验研究

目的:探讨大鼠下颌骨牵张间隙内移植自体骨髓间充质干细胞,促进骨痂形成的可行性。方法:选用54只雄性SD大鼠,密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞(MSCs)。所有大鼠行右侧下颌骨牵张;并于术后随机分为试验和对照2组。牵张结束时,实验组牵张间隙内注射自体MSCs;而对照组只注射等量生理盐水。分别于固定期第2、4、8周分3批处死大鼠,进行放射学、组织学观察,并对骨组织形态计量学参数进行统计学分析(t检验)。结果:放射学和组织学观察表明,2组牵张间隙内均形成了骨痂组织,但实验组新生骨组织显著多于对照组。计量学分析也显示,各时间点实验组新生骨量(NBV1和NBV2)和新生骨小梁宽度(TNT)均显著高于对照组(P<0.01)。结论:牵张间隙内行自体骨髓MSCs移植,可有效促进新骨形成,缩短固定期;该方法对众多的颅颌面外科畸形的矫治极具价值。

骨髓间充质干细胞诱导为成骨细胞的初步研究

目的观察兔骨髓间充质干细胞的生长特点及诱导条件下的成骨能力。方法抽取兔骨髓组织,梯度离心后,保留贴壁细胞传代,稳定传代后改用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的诱导培养液,通过倒置显微镜观察,碱性磷酸酶染色,骨连接素、骨桥素免疫细胞化学染色等方法进行观测。结果原代兔骨髓间充质干细胞7～8d左右即可长满,并可稳定传代,传代细胞5～6d即可传代。诱导培养细胞碱性磷酸酶染色,骨连接素、骨桥素免疫细胞化学染色阳性。结论兔骨髓间充质干细胞经合理的体外诱导培养后,符合成骨细胞的形态特征和生物学特性,可为体外构建组织工程化骨提供自体种子细胞。

体外诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的研究进展

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）具有自我复制和跨胚层多向分化的潜能，可以被诱导分化为神经细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肝细胞等，同时它的来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，免疫原性弱，免疫耐受性强，体外基因转染率高，并能稳定高效表达外源基因等优点，是目前较为理想的种子细胞，在临床应用方面特别是在治疗中枢神经系统疾病中有着广阔的应用前景。BMSCs用于治疗中枢神经系统疾病的前提是能大量诱导分化为神经细胞，本文就体外诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的研究进展作一综述。

兔骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经样细胞的实验研究

目的动态观察体外神经营养剂联合碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)定向诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经样细胞的效果。方法将BMSCs分离体外扩增培养后,分别加入神经营养剂金路捷、三磷酸腺苷(ATP)、神经节苷脂(GM1)+bFGF诱导其分化。分别于6、24、48、72、96h后光镜下观察细胞形态变化并通过免疫组织化学测定特异性神经元稀醇化酶(NSE)、神经巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况。结果神经营养剂联合bFGF诱导6h后出现胞体收缩,Nestin表达阳性,24h后伸出突起,有不同程度NSE、GFAP表达,3d后达高峰。结论神经营养剂联合bFGF能提高诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的诱导率。

源于骨髓间充质干细胞的神经元存活与c-myc

目的:探讨源于骨髓间充质干细胞的神经元的存活与原癌基因蛋白c-myc的关系.方法:从成年大鼠骨髓分离、扩增rMSCs至6代.给予不同的诱导条件,采用免疫组化方法观察神经分化过程中神经特异抗原和c-myc蛋白的表达,并计算分化率.结果:在不同的分化诱导条件下,MSCs呈现典型的神经元形态.加入MNM组分化率高于对照组.分化后4～36h,可检测到c-myc蛋白的持续表达.结论:c-myc在MSCs向神经元分化过程中有重要作用.

体外培养骨髓间充质干细胞的形态观察及其端粒酶活性

本实验选用恒河猴，于胫骨粗隆处无菌抽取骨髓后，采用贴壁筛选法分离、培养骨髓问充质干细胞，光镜及电镜观察细胞形态；原位杂交方法检测其端粒酶活性；应用流式细胞仪检测其细胞周期。细胞接种后的最初几日，培养板中悬浮的血细胞成分较多，这些悬浮细胞随着时间延长逐渐崩解，并随换液次数增多而被清除。

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化的心肌样细胞内Ca^(2+)和CaMKⅡ的变化

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone m arrow m esenchym al stem cells,MSCs)体外诱导分化为心肌样细胞内游离钙浓度([Ca2+]i)及钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的表达变化。方法取健康SD大鼠骨髓,用5-氮杂胞苷体外诱导培养。取诱导培养2、3、4周的MSCs为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组,另取急性分离的心肌细胞为对照组,分别用激光共聚焦技术和W estern b lot技术检测[Ca2+]i及CaMKⅡ表达水平。结果经荧光探针结合Ca2+后,用激光共聚焦技术检测发现,随诱导培养时间的延长,[Ca2+]i逐渐增加;诱导培养4周的MSCs内[Ca2+]i与对照组比较无显著差异[(100.81±17.64),(100.32±17.10),P>0.05]。各组细胞CaMKⅡ的变化趋势与[Ca2+]i定量分析结果相似,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组及对照组分别为(322.45±19.43)、(434.43±16.77)、(680.91±20.61)、(682.69±21.03),Ⅲ组与对照组比较P>0.05。结论大鼠MSCs在体外诱导培养4周后已分化为心肌样细胞,其细胞内游离钙浓度和CaMKⅡ蛋白表达水平与正常心肌细胞相似。