骨髓间充质干细胞来源的外泌体静脉移植对脊髓损伤的修复作用研究

目的:分析骨髓间充质干细胞来源的外泌体静脉移植对脊髓损伤的修复作用。方法:选择2013年10月—2014年3月河南省洛阳正骨医院实验室试验的78例大鼠为研究对象,应用随机抛球法将大鼠分为手术组(n=26)、对照组(n=26)、外泌体组(n=26)。通过脊髓法建立大鼠脊髓损伤模型后,对照组不作处理,手术组在对照组的基础上实施切开减压术,而外泌体组在对照组的基础上实施全骨髓培养法培养大鼠BMSCs,收集P2代细胞上清,应用ExoQuickPrecipitation提取法分离并纯化外泌体,通过透射电镜观察鉴定外泌体形态,采用Westernblot鉴定外泌体表面标志蛋白CD9、CD63,在造模1 h后尾静脉给予外泌体移植500μL。分别采用BBB评分、斜板实验在术后1、3、7、14、21、28 d评价大鼠的运动功能恢复情况,并于术后28 d处死试验大鼠,采用苏木精-伊红(HE)染色、髓鞘(LFB)染色观察各组脊髓组织形态学改变,尼氏(Nissl)染色观察神经元存活数目。结果:术后各时间点手术组大鼠BBB评分高于对照组和外泌体组,术后7、14、21、28 d外泌体组大鼠BBB评分高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。手术组术后各时间点斜板评分高于对照组及外泌体组,差异有统计学意义(P<0.05)。造模后28 d,手术组的脊髓组织HE染色体等均正常,神经元数目减少。结论:BMSCs外泌体静脉移植对脊髓损伤有明显的改善作用,可以提高患者的运动能力,减轻脊髓损伤,加速脊髓损伤的恢复。

骨髓间充质干细胞来源的外泌体在脊髓损伤中的研究进展

脊髓损伤(SCI)的治疗一直是脊柱外科急需攻破的难题,随着学者对SCI病理生理机制的深入研究,细胞移植疗法为治疗SCI带来希望。骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源的外泌体作为细胞移植的焦点,可通过旁分泌作用参与机体抗炎、抗细胞凋亡、促进轴突再生、减少胶质瘢痕生成等作用。外泌体分子量较小不会引起排斥反应,避免了移植BMSCs带来的致瘤性、移植率低、伦理等问题。基因修饰后的外泌体将对SCI的治疗、恢复患者肢体运动功能起到关键作用,这为未来治疗SCI提供了新方向。

骨髓间充质干细胞来源的外泌体用于大鼠脊髓损伤修复的初步探索

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分泌的外泌体(exosomes)对脊髓损伤大鼠行为学、损伤处活化星形胶质细胞和残余神经元数量的影响,初步探索BMSCs-exosomes作为脊髓损伤的细胞替代疗法的可行性。方法 :采用全骨髓培养法培养BMSCs,流式细胞术鉴定其表面标志CD90和CD34。收集BMSCs上清液,超速离心法提取并标记外泌体,电镜观察其结构,Western blot法检测其CD63和CD9的表达水平。将外泌体作用于脊髓损伤大鼠,于损伤后各时点进行后肢运动功能评价,并于预定时点处死大鼠取损伤脊髓段,尼氏染色法观察损伤脊髓形态,免疫荧光法检测反应性星形胶质细胞和残余神经元的数量。结果:BMSCs分泌的外泌体电镜下呈"茶托状"结构,Western blot法检测其阳性表达CD63和CD9。脊髓损伤后14d和28 d治疗组神经功能有一定程度改善,与损伤组间差异有统计学意义(P<0.05)。损伤后14 d治疗组较之损伤组的尼氏体结构更完整、分布更匀称,崩解凝聚减少。治疗组损伤后7 d、14 d和28 d反应性星形胶质细胞数量较损伤组明显降低(P<0.05)。损伤后7 d、14 d和28 d治疗组残余神经元数量高于相应时点损伤组(P<0.05)。结论:BMSCs分泌的外泌体可减少脊髓损伤区域反应性星形胶质细胞的数量,减少神经元的死亡,有利于损伤后后肢运动功能改善。

骨髓间充质干细胞来源的外泌体对骨再生机制研究

目的本研究旨在检测骨髓间充质干细胞外泌体(BMSC-Exos)的特征,并通过体内体外实验探讨其对成骨分化的影响及对骨再生的机制。方法①原代培养人骨髓间充质干细胞(BMSCs),并对其表面抗原和多系分化潜能进行鉴定;②收集BMSC的P4～P6代细胞培养的培养上清液,应用试剂盒提取BMSC-Exos;③透射电镜观察BMSC-Exos的形态结构,免疫电泳检测BMSC-Exos的表面抗原;④茜素红、ALP染色验证BMSC-Exos在体外成骨分化中的作用;⑤通过大鼠颅骨缺损动物模型验证BMSC-Exos在体内骨再生的作用;⑥通过免疫电泳和qRT-PCR检测加入BMSC-Exos后的成骨细胞中相关蛋白和基因的表达情况。结果①分离培养的BMSCs形态呈多角形或长梭形,表面抗原CD90、CD29、CD44为阳性,符合间充质干细胞的特征;②BMSC-Exos呈双面凹的圆形或椭圆形,直径约40～120 nm(81.7±19.9),表面抗原与BMSC一致;③经茜素红染色和ALP染色后,染色强度与Exo浓度呈正相关;④通过对大鼠颅骨缺损模型拍摄X片、组织学分析,外泌体可促进大鼠颅骨缺损的修复和新生骨的形成;⑤免疫电泳显示经外泌体处理后,BMSC中的OCN、Runx2、β-catenin蛋白含量增加,qRT-PCR结果显示Runx2、β-catenin的基因表达上调。结论 BMSC-Exos有促进骨再生的能力,并与上调Wnt/β-catenin通路有关。

骨髓间充质干细胞来源的外泌体对成骨细胞增殖和分化的影响

目的:探讨骨髓间充质干细胞来源的外泌体对成骨细胞增殖和分化的影响。方法:体外分离培养骨髓间充质干细胞,超速离心法收集外泌体,并对成骨细胞进行刺激,细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)法检测骨髓间充质干细胞来源的外泌体对成骨细胞增殖的影响,碱性磷酸酶活性检测及茜素红染色观察骨髓间充质干细胞来源的外泌体对成骨细胞矿化的影响,利用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR)检测成骨相关基因的表达。结果:骨髓间充质干细胞来源的外泌体促进成骨细胞的增殖,上调成骨相关基因的表达,提升碱性磷酸酶活性及促进钙化结节的形成。结论:骨髓间充质干细胞来源的外泌体能够促进成骨细胞的增殖和分化。

骨髓间充质干细胞来源的外泌体对弗氏完全佐剂诱导类风湿性关节炎大鼠的治疗作用

目的评价大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)来源的外泌体(Exo)在弗氏完全佐剂(CFA)诱导的类风湿性关节炎(RA)大鼠中的治疗作用。方法超速离心分离大鼠BMSC上清中的Exo(BMSC-Exo),利用纳米颗粒跟踪分析和Westernblotting法对BMSC-Exo表征进行鉴定。将20只雄性SD大鼠随机分为Sham组、CFA组、Exo组和Cel组,每组5只;除Sham组注射等体积生理盐水外,其余3组在大鼠左后肢足跖部皮下注射0.1 mLCFA,注射7 d后,Exo组大鼠尾静脉注射BMSC-Exo,Cel组灌胃Cel。采用足趾关节肿胀度、关节炎指数(AI)、热痛阈和脾脏指数评价BMSC-Exo对CFA大鼠的治疗效果;采用旷场实验和自动步态实验评价BMSC-Exo对CFA大鼠自主运动的影响;采用流式技术检测BMSC-Exo对CFA大鼠血清炎症因子水平的影响;采用Westernblotting法检测BMSC-Exo对CFA大鼠关节组织NF-κB通路蛋白表达的影响。结果与BMSC相比,BMSC-Exo特异性表达CD63和TSG101分子,但不表达CM130;BMSC-Exo的粒径分布在82.5 nm处达到峰值。与Sham组相比,CFA组大鼠足趾关节肿胀度、AI、脾脏指数高,热痛阈低,站立次数增加,运动距离及步长变短,步宽增加,摇摆时间变短及触地时间变长,血清炎症因子水平和关节组织NF-κB通路蛋白表达上调(P均<0.05)。与CFA组相比,Exo组、Cel组大鼠足趾关节肿胀度、AI、脾脏指数低,热痛阈高,站立次数减少,运动距离及步长变长,步宽降低,摇摆时间变长及触地时间缩短,血清炎症因子水平和关节组织NF-κB通路蛋白表达低(P均<0.05)。结论BMSC-Exo对CFA诱导的RA模型大鼠具有明显治疗作用,其机制可能与抑制NF-κB信号通路有关。

骨髓间充质干细胞来源的外泌体对糖尿病大鼠创面炎症因子的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源的外泌体移植后,对糖尿病大鼠创面愈合及炎症因子的影响。方法全骨髓贴壁法分离BMSCs,超速离心法提取BMSCs外泌体。选取清洁SD大鼠30只构建糖尿病大鼠创伤模型,成功建模后,将存活大鼠分为对照组(n=13)、外泌体组(n=14);采取尾静脉途径,予外泌体组大鼠0.2 mg/ml外泌体悬液1 ml,同时予对照组等剂量PBS溶液注射;采用Image J软件分析大鼠的创面愈合率,并通过HE染色评估创面组织中炎症程度;采用酶联免疫分析法(ELISA)检测大鼠创面组织中TNF-α、IL-1β、IL-10的浓度;采用Western blot检测创面组织中TLR-4的表达。结果流式细胞术鉴定BMSCs表面抗原,CD29、CD90高表达,CD40低表达;超速离心法获取的BMSCs外泌体直径分布于60~160 nm;与对照组比较,外泌体组大鼠创面愈合率较高,且组织中炎性因子浓度较低,TLR-4表达较低(均P<0.05)。结论BMSCs外泌体可通过调控TLR-4的表达降低糖尿病大鼠创面组织的炎症程度。

骨髓间充质干细胞来源的外泌体对应激性抑郁症模型大鼠的治疗作用及机制研究

目的观察骨髓间充质干细胞外泌体(BMSC-Exos)对应激性抑郁症(STRID)模型大鼠的治疗作用及机制。方法分离并培养Wistar大鼠骨髓腔骨髓间充质干细胞(BMSCs),收集4~6代BMSCs细胞培养基上清提取BMSC-Exos。30只成年雄性WKY大鼠随机分为对照组、STRID组及STRID+BMSC-Exos组,每组10只。STRID组及STRID+BMSC-Exos组大鼠给予慢性温和不可预知应激刺激建立STRID模型,连续建模28d后给予STRID+BMSC-Exos组大鼠尾静脉0.1ml BMSC-Exos稀释液注射治疗,其他两组给予等量生理盐水,连续治疗15d。强迫游泳及糖水偏好实验观测各组大鼠抑郁样行为变化;免疫荧光检测大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)表达分布差异;高效液相色谱-荧光法用于检测大鼠脑组织中5-羟色胺(5-HT)和多巴胺(DA)含量变化;ELISA检测大鼠脑组织中白介素-6(IL-6)、β-内啡肽(β-EP)含量变化。结果分离提取的BMSC-Exos符合外泌体形态、粒径及表型鉴定特征;造模后STRID组大鼠出现明显抑郁样行为,脑组织中BDNF、β-EP、5-HT、DA含量较对照组显著降低,IL-6增加;BMSC-Exos回输治疗后,STRID+BMSC-Exos组大鼠较STRID组抑郁样行为减少,BDNF、β-EP、5-HT、DA表达较STRID组增加,IL-6分泌减少,但仍与对照组存在显著差异。结论BMSC-Exos可能通过抑制IL-6分泌,促进脑内BDNF、β-EP表达及5-HT、DA的合成分泌发挥治疗STRID的作用。

骨髓间充质干细胞来源的外泌体静脉移植对脊髓损伤的修复作用

目的 :初步探讨大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)来源的外泌体静脉移植对脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的修复作用。方法:全骨髓培养法培养大鼠BMSCs,收集P2代细胞上清,Exo Quick Precipitation提取法分离并纯化外泌体,通过透射电镜观察鉴定外泌体形态,采用Western blot鉴定外泌体表面标志蛋白CD9、CD63。通过脊髓法建立大鼠SCI模型,造模1h后尾静脉给予外泌体移植500μl(外泌体蛋白浓度为200μg/ml),采用随机数字表法分将30只大鼠为三个组:假手术组、对照组(SCI+磷酸盐溶液)、外泌体组(SCI+外泌体),均采用BBB评分、斜板实验于造模后1、3、7、14、21、28d评价大鼠运动功能恢复情况,并于术后28d处死取材,采用苏木精-伊红(HE)染色、髓鞘(luxol fast blue,LFB)染色观察各组脊髓组织形态学改变,尼氏(Nissl)染色观察神经元存活数目。结果:透射电镜下可见大量直径40~100nm的立体圆形或茶托形的小囊泡结构,外周可见完整的类脂质膜性结构,内含低电子密度物质。Western Blot显示CD9、CD63蛋白表达阳性。造模后假手术组各时间点的BBB评分和斜板评分均正常,对照组和外泌体组BBB评分和斜板评分均低于假手术组(P<0.05),造模后7、14、21、28d外泌体组BBB评分分别为6.30±0.95、12.70±1.57、16.60±1.08、17.00±0.67分,均高于同时间点对照组的2.50±1.08、6.90±0.99、10.50±0.85、12.50±1.08分(P<0.05)。造模后7、14、21、28d外泌体组斜板评分分别为43.00±3.50、55.50±4.38、62.50±2.64、65.00±3.33分,均高于同时间点对照组的34.00±3.16、43.00±4.22、49.00±4.59、52.50±4.25分(P<0.05)。造模后28d,假手术组脊髓组织HE染色、LFB染色、Nissl染色正常,对照组脊髓空洞形成、髓鞘排列紊乱、神经元数目减少,外泌体组与对照组比较脊髓组织损伤程度减轻,存活神经元数目增多(P<0.05)。结论:MSCs来源的外泌体可减轻脊髓损伤后的病理变化,改善运动功能,促进脊髓损伤后神经功能修复。

骨髓间充质干细胞来源的外泌体对小鼠肝库普弗细胞极化的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源的外泌体(exosomes)对肝库普弗(Kupffer)细胞极化的影响。方法体外分离培养BMSCs后,经流式细胞术鉴定其表面分子表达,通过成骨和成脂诱导培养基诱导鉴定其分化潜能,通过外泌体提取试剂盒从BMSCs培养上清提取外泌体,电子显微镜观察其形态,并用流式细胞术鉴定表面分子表达。体外培养Kupffer细胞随机分为正常培养组、脂多糖(LPS)刺激组、LPS共培养组,光学显微镜下观察体外培养3组Kupffer细胞形态的变化。60只小鼠腹腔注射CCl_(4)复制急性肝损伤模型,并随机分为PBS对照组和外泌体治疗组,HE染色观察体内两组肝组织病理学变化、眼球取血检测肝功能谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的表达。Western blotting分别检测体外培养的3组Kupffer细胞和体内两组肝脏组织诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶1(ARG1)的表达,Real-time PCR法检测其iNOS、ARG1、白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α和C-X-C基序趋化因子(CXCL)-10的表达。结果成功分离出BMSCs,具有成骨细胞和成脂细胞分化能力,并表达CD105、CD45;电子显微镜观察到分离的外泌体呈囊泡状,并表达CD63和CD81;光学显微镜观察显示,BMSCs的外泌体能减弱Kupffer细胞活化,BMSCs的外泌体注射后能减弱肝脏组织的病理性改变(P<0.05),降低肝功能ALT和AST的表达(P<0.05);Western blotting显示,体外实验LPS和外泌体共培养组与体内实验外泌体治疗组的ARG1的表达均增加(P<0.05),iNOS均降低(P<0.05);Real-time PCR显示,体外LPS和外泌体共培养组与体内外泌体治疗组的iNOS、IL-1β、TNF-α和CXCL-10的表达下降(P<0.05),ARG1的表达增加(P<0.05)。结论BMSCs来源的外泌体抑制肝Kupffer细胞向M1型极化。

骨髓间充质干细胞来源的外泌体诱导巨噬细胞向M1型极化

目的探究不同浓度骨髓间充质干细胞外泌体对巨噬细胞向M1型极化的影响。方法提取骨髓间充质干细胞外泌体,电子显微镜观察外泌体形态,并通过Western blot检测骨髓间充质干细胞外泌体特异性蛋白TSG101、CD63、Alix表达水平;将不同浓度骨髓间充质干细胞外泌体与巨噬细胞共培养,RT-qPCR检测巨噬细胞极化相关基因IL-6、iNOS、Arg-1、CD206等的表达。结果电镜检测显示,外泌体为杯口状结构;Western blot检测显示骨髓间充质干细胞外泌体表达特异性蛋白TSG101、CD63、Alix;外泌体内吞实验表明,在60μg/ml外泌体时,巨噬细胞对外泌体的内吞效率最高。RT-qPCR分析显示,60μg/ml外泌体处理使M1型巨噬细胞相关基因IL-6和iNOS表达升高最明显。结论骨髓间充质干细胞的外泌体可以诱导巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化。

不同年龄大鼠骨髓间充质干细胞来源的外泌体对血管平滑肌细胞钙化的影响及机制研究

目的:探讨不同年龄大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源的外泌体(BMSCs-Exos)对血管平滑肌细胞(VSMCs)钙化的影响及机制。方法:提取年轻大鼠和老年大鼠的BMSCs并进行鉴定,收集细胞培养上清中的外泌体并鉴定。将VSMCs分为4组:空白对照组、β-甘油磷酸钠(β-GP)组、β-GP+年轻大鼠BMSCs-Exos(Young-Exos)组和β-GP+老年大鼠BMSCs-Exos(Aged-Exos)组。除空白对照组外,其他3组用含10 mmol/Lβ-GP的完全培养基培养14 d,诱导VSMCs钙化;茜素红S染色法检测各组钙化情况;Western blotting法检测特异蛋白1(Sp1)、成骨转化标志蛋白Runt相关转录因子2重组蛋白(RUNX2)和α平滑肌肌动蛋白(αSMA)的蛋白表达。结果:与空白对照组比较,β-GP组出现颜色较深的橘红色钙盐结节,β-GP+Young-Exos组较β-GP组和β-GP+Aged-Exos组钙盐结节数量明显减少,且橘红色着色浅。与空白对照组比较,β-GP组Sp1和RUNX2蛋白表达量升高,αSMA蛋白表达量降低(均P<0.05);与β-GP组比较,β-GP+Young-Exos组Sp1和RUNX2蛋白表达量降低,αSMA蛋白表达量升高(均P<0.05),而β-GP+Aged-Exos组与β-GP组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:不同年龄大鼠BMSCs-Exos对动脉钙化的影响不同,其中Young-Exos干预能减轻VSMCs钙化,其机制可能与下调Sp1和RUNX2表达、上调αSMA表达有关。

骨髓间充质干细胞来源的外泌体microRNA对肿瘤的作用和机制研究进展

癌症是严重威胁人类生命和阻碍社会发展的重大疾病,是世界上最严重的的公共卫生问题之一。其传统四大治疗手段—手术、放疗、化疗、生物—都会不同程度的损伤机体正常细胞,机体免疫力也急剧下降,不良反应大。基于此,研究者们正在积极探索各种高效低毒的治疗方法。随着分子生物学的发展,基于骨髓间充质来源的外泌体microRNA治疗应运而生。目前,骨髓间充质来源的外泌体在肿瘤防治领域仍处于起步阶段,对于肿瘤的细胞调控机制不甚明朗。文中主要对骨髓间充质干细胞(BM-MSC)来源的外泌体microRNA对肿瘤的作用和机制的进行综述。

骨髓间充质干细胞来源外泌体调节大鼠肝细胞凋亡的机制

背景:骨髓间充质干细胞可释放大量外泌体,关于骨髓间充质干细胞来源外泌体对肝细胞凋亡的影响以及具体机制还没有完全阐明。目的:探索骨髓间充质干细胞来源外泌体所携带的miR-21-5p对大鼠肝脏细胞凋亡的影响及其作用机制。方法:分离大鼠骨髓间充质干细胞,将miR-21-5p NC或miR-21-5p inhibitor转染到骨髓间充质干细胞中,采用超速离心法提取外泌体,命名为(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos,(BMSCs+miR-21-5p inhibitor)-Exos,将外泌体与BRL大鼠肝细胞共培养,观察抑制miR-21-5p表达后对大鼠肝细胞凋亡的影响。通过双荧光素酶报告基因检测验证外泌体中miR-21-5p和PIK3R1之间的靶向关系;TUNEL检测外泌体中miR-21-5p直接靶向PIK3R1激活PI3K/AKT信号通路对BRL大鼠肝细胞凋亡的影响。结果与结论:①双荧光素酶报告系统证实,PI3KR1野生型载体与miR-21-5p mimics共转染293T细胞时的荧光素酶活性显著低于PI3KR1突变型载体共转染组,表明miR-21-5p可靶向结合PIK3R1;②TUNEL检测结果显示:相比于(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos组,(BMSCs+miR-21-5p inhibitor)-Exos处理后BRL肝细胞凋亡率显著增加;与(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos组相比,加入AKT抑制剂LY294002之后,细胞凋亡率显著增加;③结果提示:外泌体可能通过miR-21-5p直接靶向PIK3R1激活PI3K/AKT信号通路抑制BRL大鼠肝细胞凋亡。

骨髓间充质干细胞外泌体联合茶多酚治疗大鼠脊髓缺血再灌注损伤

背景:研究表明,抑制内质网应激所致的细胞凋亡能够挽救神经部分功能。茶多酚能抑制内质网应激,但是存在生物利用率差不易透血脑屏障等问题,结合外泌体靶向脊髓修复及高效载药,理论上两者结合能够发挥更优的脊髓保护效能。目的:探讨茶多酚联合骨髓间充质干细胞外泌体对脊髓缺血再灌注损伤大鼠神经功能及内质网应激的影响。方法:SD雄性大鼠50只,随机分为假手术组、模型组、茶多酚组、外泌体组、联合治疗组,每组10只,除假手术组外,其余4组制作脊髓缺血再灌注损伤模型,术后2 h经尾静脉注射生理盐水、外泌体、茶多酚、茶多酚+骨髓间充质干细胞外泌体混合液;脊髓损伤后7,14,28 d进行BBB神经功能评分,脊髓损伤后14 d,取脊髓组织进行苏木精-伊红染色、尼氏染色、ATF6和GADD153内质网应激标志物免疫荧光染色。结果与结论:①神经功能评分:与假手术组比较,模型组、外泌体组、茶多酚组、联合治疗组神经功能评分均不同程度下降,术后14 d联合治疗组神经功能评分优于茶多酚组、外泌体组、模型组(P<0.05),术后28 d后联合治疗组神经功能评分优于模型组和茶多酚组(P<0.05);②苏木精-伊红染色和尼氏染色显示:模型组大鼠神经元细胞数量减少,脊髓损伤区域内大量空洞坏死及瘢痕增生,茶多酚组、外泌体组、联合治疗组神经元数量和周边空洞坏死有不同程度改善,联合治疗组改善最为明显;③内质网应激相关蛋白ATF6、GADD153表达:术后14 d联合治疗组GADD153表达低于模型组和茶多酚组(P<0.05),联合治疗组ATF6表达低于模型组、外泌体组和茶多酚组(P<0.05);④结果表明:茶多酚联合骨髓间充质干细胞外泌体能改善脊髓缺血再灌注损伤大鼠的神经功能,可能与抑制内质网应激相关蛋白ATF6、GADD153表达有关。

miR-141-5p/ZNF705A对慢性粒细胞白血病细胞源外泌体调控骨髓间充质干细胞黏附作用的机制

目的探讨慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)细胞源外泌体(exosome,Exo)中miR-141-5p/ZNF705A对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)黏附作用的影响。方法电镜和NTA粒径分析检测CML患者外周血和K562细胞中的Exo形态大小;qRT-PCR和Western blot检测转染前后K562细胞的Exo、BMSCs标记分子及黏附蛋白的表达情况;细胞黏附实验检测BMSCs的黏附能力;CCK-8法检测BMSCs活性、萤光素酶实验检测miR-141-5p与ZNF705A结合情况等。结果qRT-PCR结果显示,miR-141-5p表达在CML患者和K562细胞源Exo中均明显降低;qRT-PCR和Western blot等结果表明,CML患者中BMSCs的黏附蛋白CD44和CXCL12表达明显降低,且能够吞噬K562细胞源Exo。进一步发现,与CD34^(+)细胞相比,K562源性Exo能够降低Exo促进的BMSCs中CD44和CXCL12表达和黏附作用;同时,双萤光素酶基因报告等验证miR-141-5p与ZNF705A靶向结合;最后发现通过上调K562细胞源Exo中miR-141-5p的表达,靶向抑制ZNF705A,进而促进BMSCs的活性和黏附功能。结论K562细胞下调Exo中miR-141-5p表达,减少对ZNF705A的靶向抑制,进而抑制BMSCs的黏附功能,从而调控CML患者的骨髓造血功能。

骨质疏松环境下骨髓间充质干细胞外泌体通过OPG/RANKL调控破骨分化

目的:绝经后骨质疏松PMOP(postmenopause osteoporosis)是一种慢性炎症性疾病,破骨细胞的异常活化是发病的重要原因之一。病理环境下骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)外泌体对破骨细胞的作用及影响尚不明确。本研究分析了PMOP环境下,BMSCs外泌体(exosome,Exo)对破骨细胞分化的调控作用,对于明确骨质疏松的发病机制具有至关重要的意义。方法:分别从正常和绝经后骨质疏松患者骨髓中提取BMSCs,通过超速离心联合Exoquick试剂盒分别提取两种细胞的Exo,即正常BMSCs外泌体(healthyExo,H-Exo)和绝经后骨质疏松骨髓间充质干细胞外泌体(postmenopause osteoporosis-Exo,P-Exo),并通过透射电子显微镜(TEM),纳米颗粒示踪分析技术(NTA)、Western blot对分离的外泌体进行鉴定;两种不同的外泌体被引入RAW264.7细胞中,以便通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)、Western blot分析和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色来评估RAW264.7细胞中破骨分化相关指标的表达。同时,使用Western blot和ELISA方法来测定这两种外泌体中OPG/RANKL蛋白的表达水平。实验数据通过SPSS 24.0软件进行统计分析。结果:对提取后的两种外泌体进行形态学比较发现,与H-Exo相比,P-Exo直径更大,P-Exo能够促进RAW264.7细胞破骨分化标志性基因NFATC1和Trap mRNA及蛋白的表达,Trap染色可见分化的破骨细胞,Western blot及ELISA检测两种外泌体OPG/RANKL的表达发现,与H-Exo相比,P-Exo内OPG的表达量下降,而RANKL表达量升高。结论:绝经后骨质疏松中骨吸收增加,可能是炎症微环境下,BMSCs外泌体通过传递RANKL,促进破骨细胞分化引起的。此项研究为深入研究骨质疏松病因的开辟了新的途径,并为骨质疏松的治疗提供了新的治疗靶点。

骨髓间充质干细胞来源的外泌体在骨再生中的新作用

外泌体作为一种膜状脂质囊泡,能够与释放到细胞外环境中的细胞内多细胞体融合。骨髓间充质干细胞来源的外泌体可以通过调节成骨细胞增殖和分化在骨重塑中发挥作用,现已成为一种治疗骨代谢疾病的有效方法。本文总结了骨髓间充质干细胞来源的外泌体对成骨再生中的调控作用以及经过药物和生物学等方法处理后的骨髓间充质干细胞来源的外泌体对骨再生的研究进展,以期为骨代谢疾病的临床治疗提供理论依据。

PF-127水凝胶联合骨髓间充质干细胞外泌体来源miR-132诱导成骨分化修复牙槽骨缺损

目的:探究PF-127水凝胶联合骨髓间充质干细胞外泌体来源miR-132诱导成骨分化对牙槽骨缺损的修复作用。方法:培养骨髓间充质干细胞,(bone mesenchymal stem cells,BMSCs),并转染anti-miR-132、anti-miR-NC质粒。制备BMSCs来源外泌体(bone mesenchymal stem cells-exosomes,BMSCs-exo),蛋白质印迹法鉴定表达标志物。制备PF-127水凝胶和BMSCs-Exo复合物,PKH67标记法检测BMSCs的摄取;茜素红染色检测BMSCs的成骨能力;逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测细胞中miR-132表达和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)mRNA表达。建立牙槽骨缺损大鼠模型,将大鼠随机分为PF-127水凝胶组、PF-127水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-NC组和PF-127水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-132组。微型计算机断层扫描(Micro-computed tomography,micro-CT)评估牙槽骨缺损情况;蛋白质印迹法检测牙槽骨组织中ALP、OCN、Runx2蛋白表达。结果:anti-miR-132组BMSCs中miR-132表达明显低于anti-miR-NC组(P<0.05),提示anti-miR-132成功转染至BMSCs中。BMSCs-exo-anti-miR-NC组和BMSCs-exo-anti-miR-132组中外泌体标志物CD9和CD63显著表达。和BMSCs-exo-anti-miR-NC组相比,BMSCs-exo-anti-miR-132组中miR-132表达明显降低(P<0.05)。和PF127水凝胶组相比,BMSC-exo-anti-miR-NC组、PF127水凝胶+BMSC-exo-anti-miR-NC组、PF127水凝胶+BMSC-exo-anti-miR-132组中miR-132表达均明显降低,茜素红染色相对活性、细胞中Runx2、ALP和OCN mRNA表达均明显增加,且PF127水凝胶+BMSC-exo-anti-miR-132组变化最显著(P<0.05)。和Control组相比,PF-127水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-NC组和PF-127水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-132组BV/TV比值、BMD、Tb.N和Tb.Th及细胞中Runx2、ALP、OCN蛋白表达均明显升高,Tb.Sp明显降低(P<0.05),且PF-127水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-132组变化最显著。结论:PF-127水凝胶联合骨髓间充质干细胞来源外泌体来源干扰miR-132表达可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化,从而促进牙槽骨缺损大鼠的修复。

骨髓间充质干细胞来源外泌体的微小RNA-22-3p参与抑制环磷酰胺诱导卵巢颗粒细胞损伤的机制研究

目的分析骨髓间充质干细胞来源的外泌体微小RNA-22-3p(miR-22-3p)对卵巢早衰的影响。方法选取接受体外受精或者第二代试管婴儿治疗的卵巢早衰患者以及接受同样治疗的因男性因素不孕的正常志愿者提供卵泡液;通过差速离心法分离骨髓间充质干细胞来源外泌体;分离外泌体的形态学、粒子大小以及标志蛋白通过透射电子显微镜、NanoSight LM10分析仪以及蛋白免疫印迹方法进行分析。将颗粒细胞经环磷酰胺(CTX)、外泌体、miR-22-3p模拟物以及相应对照处理,分为CTX组、Control组、外泌体孵育组、PBS处理组、CTX+miR-22-3p组、CTX+miR-NC组、CTX+Exosomes组以及CTX+PBS组;采用蛋白免疫印迹法和定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)检测基因表达水平;利用二苯基四氮唑溴盐(MTT)试剂以及流式分析仪检测细胞活力和凋亡。结果提取的外泌体具有典型的杯状囊泡,外泌体标志蛋白簇状分化抗原63(CD63)和簇状分化抗原9(CD9)表达在所提取的细胞上清外泌体中,外泌体粒子大小为80~150 nm;miR-22-3p在卵巢早衰患者和CTX诱导的卵巢颗粒细胞中显著低表达(P<0.05),在骨髓间充质干细胞来源外泌体孵育卵巢颗粒细胞中显著高表达(P<0.05);颗粒细胞活力在CTX组低于对照组,但在CTX+miR-22-3p组或CTX+Exosomes组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);颗粒细胞凋亡率在CTX组高于对照组,但在CTX+miR-22-3p组或CTX+Exosomes组低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论骨髓间充质干细胞来源的外泌体miR-22-3p抑制CTX诱导的卵巢颗粒细胞损伤。