hTGF-β1基因转染骨髓间充质干细胞椎间盘移植术后的表达

目的检测腺病毒介导的hTGF-β1基因转染骨髓间充质干细胞椎间盘移植后hTGF-β1基因的表达。方法兔骨髓间充质干细胞体外分离培养扩增,Ad-hTGF-β1转染后采用组织工程方法自体移植于椎间盘中,在术后1周、2周、4周、6周、8周取材,RT-PCR和免疫组化方法检测hT-GF-β1的表达。结果在Ad-hTGF-β1转染MSCs移植组,RT-PCR可检测到hTGF-β1mRNA的表达,对照组未检测到hTGF-β1mRNA的表达,免疫组织化学染色结果显示,与对照组比较Ad-hT-GF-β1转染MSCs移植各组阳性细胞数量和灰度值均有非常显著性差异(P<0.01)。结论腺病毒介导的hTGF-β1基因转染骨髓间充质干细胞椎间盘移植后hTGF-β1基因的可高表达。

人骨髓间充质干细胞及其外泌体在肝移植术后肝缺血再灌注损伤中潜在治疗作用的研究进展

肝缺血再灌注损伤(HIRI)是传统肝移植术中不可避免的病理生理过程,其严重程度受到来自供体和受体的多方面因素影响,最严重者可导致术后早期移植肝无功能。人骨髓间充质干细胞(BMSCs)及其外泌体已在临床试验中被证实具有促进组织修复与免疫调节的能力,这一治疗作用在HIRI的防治中具有较好的应用前景。该文旨在综述BMSCs及其外泌体在移植肝HIRI防治中潜在作用机制的研究进展及未来研究方向。

凋亡诱导因子基因敲减对骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的影响

背景:众多基础与临床试验证实:骨髓间充质干细胞移植后的低存活率严重制约着其发挥长期的治疗效果。课题组前期研究发现凋亡相关因子在骨髓间充质干细胞凋亡过程中发挥了重要作用,其中凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF)蛋白可能是其中一个关键因子。目的:将AIF敲减的骨髓间充质干细胞移植至小鼠梗死心肌中,验证低AIF表达骨髓间充质干细胞移植后的存活情况以及对进一步改善心功能的重要性。方法:首先,通过LV-AIF-shRNA慢病毒感染骨髓间充质干细胞下调AIF蛋白表达,应用流式细胞术及Western blot、RT-qPCR检测慢病毒的感染效率,CCK-8检测AIF敲减骨髓间充质干细胞在缺血缺氧条件下的细胞活力;然后,构建急性心肌梗死小鼠模型,分别将正常及AIF敲减的骨髓间充质干细胞移植至心肌梗死区域,免疫荧光检测AIF蛋白的表达,ELISA检测血清脑钠尿肽水平,心脏超声检测心功能,Masson染色观察心肌纤维化情况,RT-qPCR检测AIF敲减骨髓间充质干细胞移植后SRY基因表达反映细胞存活情况。结果与结论:①LV-AIF-shRNA慢病毒感染成功构建AIF基因敲减的骨髓间充质干细胞,感染效率为97.7%,且AIF表达有显著下降(P<0.001);②在缺血缺氧培养状态下,AIF基因敲减骨髓间充质干细胞较正常骨髓间充质干细胞的细胞活力显著增加;③与移植正常骨髓间充质干细胞相比,AIF基因敲减骨髓间充质干细胞移植后在梗死心肌中的存活数目显著升高至3.71倍(P<0.001),并且显著减少了梗死区域AIF蛋白表达、心肌纤维化程度;④与移植正常骨髓间充质干细胞相比,AIF基因敲减骨髓间充质干细胞移植后血清脑钠尿肽水平显著降低(P<0.05),左室射血分数、左室缩短分数均有显著改善(P<0.05);⑤结果表明:AIF基因敲减可通过增强骨髓间充质干细胞移植后的细胞活力、增加骨髓间充质干细胞在供体内的存活从而减少心肌纤维化,改善急性心肌梗死后心功能。

成骨细胞线粒体移植促骨髓间充质干细胞体外增殖、迁移和成骨分化

为探究成骨细胞(OBs)线粒体移植对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨分化的影响,本研究体外人工提取BMSCs线粒体和OBs线粒体,分别移植入受体BMSCs.实验结果发现,接受成骨细胞线粒体的BMSCs表现出显著增强的增殖、迁移、抗凋亡和成骨能力.此外,接受成骨细胞线粒体的BMSCs胞内活性氧水平降低、氧气消耗速率上调、ATP产量增加.以上结果表明,(1)成骨细胞线粒体移植能够增强体外BMSCs功能,促进其向成骨分化;(2)相较于接受骨髓间充质干细胞线粒体,接受成骨细胞线粒体移植的受体BMSCs具有更强的有氧代谢能力以及更强的成骨分化能力,有望为骨生长与骨损伤修复提供一种候选方法 .

运动预处理联合骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠心肌梗死

背景:干细胞疗法在改善心肌梗死后心脏重构方面具有广阔前景,但心肌微环境改变影响干细胞疗效。运动预处理类似于缺血预处理,能够对心肌产生保护作用。然而,运动预处理与干细胞移植联合作用的效果与机制鲜有关注。目的:观察运动预处理对心肌梗死大鼠骨髓间充质干细胞移植效果的影响,探讨局部炎症微环境在其中的作用机制。方法:80只雌性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、移植组和联合组,每组20只。利用结扎冠状动脉左前降支的方法制作心肌梗死大鼠模型,假手术组仅穿线不结扎。移植组和联合组造模后于心肌内注射雄性大鼠来源骨髓间充质干细胞,此外,联合组在造模前还需进行8周跑台运动(即运动预处理)。干细胞移植后4周,采用递增负荷运动力竭实验测定运动能力,超声心动术测定心脏结构与功能,压力容积导管法检测左心室血液动力学,原位染色法进行心肌组织病理学观察并获取心肌胶原容积分数。干细胞移植后1,7 d和4周,采用定量反转录聚合酶链反应检测左心室促炎症因子(白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α)、抗炎症因子(白细胞介素10)、Y染色体性别决定区和胚胎基因(心房钠尿肽、脑钠肽、β-肌球蛋白重链)m RNA表达量。结果与结论:(1)干细胞移植后4周:与假手术组比较,模型组运动能力、左心室射血分数降低(P <0.05);心肌梗死面积、心肌细胞横截面积、胶原容积分数增加(P <0.05);胚胎基因以及促炎因子m RNA表达量上调(P <0.05),白细胞介素10 m RNA表达量下调(P <0.05)。与模型组比较,移植组运动能力、左心室射血分数增加(P <0.05);心肌梗死面积、心肌细胞横截面积、胶原容积分数下降(P <0.05);胚胎基因以及促炎因子m RNA表达量下调(P <0.05),白细胞介素10 m RNA表达量无显著性变化(P> 0.05)。与移植组比较,联合组上述各指标均进一步改善(P<0.05)。(2)干细胞移植后1,7d:与移植组比较,联合组Y染色体性别决定区m RNA表达量升高(P<0.05)。(3)相关分析显示,白细胞介素1β、白细胞介素6(除移植后1 d)、肿瘤坏死因子α与Y染色体性别决定区m RNA表达量呈负相关(P <0.05),白细胞介素10与Y染色体性别决定区m RNA表达量呈正相关(P <0.05)。结果表明:运动预处理能够增强骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死大鼠的效果,表现为心脏重构得到抑制、心功能进一步提升,其机制与心肌炎症微环境改善促进骨髓间充质干细胞滞留和存活有关。

骨髓间充质干细胞来源外泌体调节大鼠肝细胞凋亡的机制

背景:骨髓间充质干细胞可释放大量外泌体,关于骨髓间充质干细胞来源外泌体对肝细胞凋亡的影响以及具体机制还没有完全阐明。目的:探索骨髓间充质干细胞来源外泌体所携带的miR-21-5p对大鼠肝脏细胞凋亡的影响及其作用机制。方法:分离大鼠骨髓间充质干细胞,将miR-21-5p NC或miR-21-5p inhibitor转染到骨髓间充质干细胞中,采用超速离心法提取外泌体,命名为(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos,(BMSCs+miR-21-5p inhibitor)-Exos,将外泌体与BRL大鼠肝细胞共培养,观察抑制miR-21-5p表达后对大鼠肝细胞凋亡的影响。通过双荧光素酶报告基因检测验证外泌体中miR-21-5p和PIK3R1之间的靶向关系;TUNEL检测外泌体中miR-21-5p直接靶向PIK3R1激活PI3K/AKT信号通路对BRL大鼠肝细胞凋亡的影响。结果与结论:①双荧光素酶报告系统证实,PI3KR1野生型载体与miR-21-5p mimics共转染293T细胞时的荧光素酶活性显著低于PI3KR1突变型载体共转染组,表明miR-21-5p可靶向结合PIK3R1;②TUNEL检测结果显示:相比于(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos组,(BMSCs+miR-21-5p inhibitor)-Exos处理后BRL肝细胞凋亡率显著增加;与(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos组相比,加入AKT抑制剂LY294002之后,细胞凋亡率显著增加;③结果提示:外泌体可能通过miR-21-5p直接靶向PIK3R1激活PI3K/AKT信号通路抑制BRL大鼠肝细胞凋亡。

消脂化纤汤联合骨髓间充质干细胞移植对实验性非酒精性脂肪性肝炎肝硬化小鼠的干预作用及机制

目的观察消脂化纤汤联合骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)移植对实验性非酒精性脂肪性肝炎(NASH)肝硬化小鼠的干预作用及其可能机制。方法将40只健康SPF级C57BL/6小鼠随机分出8只作为空白组,其余32只小鼠采用蛋氨酸-胆碱缺乏(MCD)饮食联合10%四氯化碳(CCl4)腹腔注射诱导NASH肝硬化模型。造模成功后随机分为模型组、中药组、干细胞组、联合组,每组8只。其中中药组予消脂化纤汤灌胃,干细胞组行尾静脉注射BM-MSCs移植1次,联合组予消脂化纤汤灌胃的同时,行尾静脉注射BM-MSCs移植1次,空白组和模型组则不予任何干预。干预4周后取材,检测肝功能指标[丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)],酶联免疫吸附法测定肝组织维A酸相关孤儿受体γt(RORγt)、白细胞介素23(IL-23)、IL-21、IL-17含量,酶联免疫吸附法测定血清及肝组织肝细胞生长因子(HGF)含量,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测定肝脏淋巴细胞RORγt、IL-23、IL-21、IL-17 mRNA表达水平。结果(1)与空白组比较,模型组血清ALT、AST含量均升高,ALB含量降低(P<0.01),与模型组比较,不同干预组各指标均有不同程度改善,以联合组变化最显著(P<0.01)。(2)肝组织IL-23、IL-21、RORγt、IL-17水平比较:与模型组比较,各干预组小鼠肝组织各指标均降低,联合组优于各单纯干预组(P<0.01)。(3)RT-PCR结果显示:与模型组比较,各干预组小鼠肝脏淋巴细胞RORγt、IL-23、IL-21、IL-17 mRNA表达降低,联合组优于各单纯干预组(P<0.05)。(4)各组小鼠血清和肝组织HGF表达水平比较:联合组优于中药组与干细胞组(P<0.01)。结论消脂化纤汤联合BM-MSCs移植可抑制肝脏过度炎症反应,从而促进肝脏细胞再生,其作用机制可能与调节辅助性T细胞17(Th17)免疫学功能相关。

有氧运动预适应改善骨髓间充质干细胞治疗急性心肌梗死的效果

背景:干细胞疗法是急性心肌梗死后恢复受损心肌组织的替代治疗策略,运动预适应可诱导机体产生内源性心脏保护效应,然而两者联合应用的疗效及机制尚不清楚。目的:探讨运动预适应联合骨髓间充质干细胞对急性心肌梗死大鼠治疗效果的影响及其可能机制。方法:70只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、干细胞治疗组、运动预适应组和联合干预组。运动预适应组和联合干预组于造模前进行8周跑台有氧运动,然后通过结扎冠状动脉前降支制作急性心肌梗死模型,干细胞治疗组和联合干预组于造模后隔天尾静脉注射骨髓间充质干细胞(1×10^(9)L^(-1),1 mL),治疗4周后,利用递增负荷跑台运动实验评估运动能力,超声心动图检测心脏结构与功能;分离左心室,2,3,5-氯化三苯基四氮唑染色评估心肌梗死面积,Masson染色检测胶原容积分数,CD31免疫组织化学染色检测心肌毛细血管密度,TUNEL染色检测心肌细胞凋亡情况,免疫印迹法检测基质细胞衍生因子1、CXC趋化因子受体蛋白4、肿瘤坏死因子α、白细胞介素10和血管内皮生长因子蛋白表达量。结果与结论:①干预疗效:与假手术组比较,模型组运动能力、左心室射血分数、左心室缩短分数、CD31阳性细胞率下降(P<0.05),心肌梗死面积、胶原容积分数和心肌细胞凋亡率增加(P<0.05)。与模型组比较,干细胞治疗组运动能力无显著差异(P>0.05),运动预适应组和联合干预组运动能力提高(P<0.05);干细胞治疗组、运动预适应组、联合干预组左心室射血分数、左心室缩短分数、CD31阳性细胞率升高(P<0.05),心肌梗死面积、胶原容积分数、心肌细胞凋亡率降低(P<0.05)。与干细胞治疗组比较,联合干预组运动能力、左心室射血分数、左心室缩短分数、CD31阳性细胞率增加(P<0.05),心肌梗死面积、胶原容积分数、心肌细胞凋亡率降低(P<0.05)。②蛋白表达:与假手术组比较,模型组肿瘤坏死因子α表达升高(P<0.05),白细胞介素10和血管内皮生长因子表达下降(P<0.05)。与模型组比较,干细胞治疗组和联合干预组CXC趋化因子受体蛋白4表达升高(P<0.05),干细胞治疗组、运动预适应组和联合干预组肿瘤坏死因子α表达下降(P<0.05),白细胞介素10和血管内皮生长因子表达增加(P<0.05)。与干细胞治疗组比较,联合干预组肿瘤坏死因子α表达降低(P<0.05),CXC趋化因子受体蛋白4、白细胞介素10和血管内皮生长因子表达升高(P<0.05)。结果表明:运动预适应可增强急性心肌梗死大鼠骨髓间充质干细胞治疗的效果(抑制心脏重塑、改善心功能、延缓心力衰竭进程),其机制与促进干细胞归巢、抑制炎症反应以及促进血管新生有关。

补骨脂素对环磷酰胺抑制小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的恢复作用

背景:补骨脂素具有很强的抗骨质疏松活性,可能对化疗导致的骨质疏松具有恢复作用。目的:探讨补骨脂素对环磷酰胺抑制小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的恢复作用及机制。方法:分离培养C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,以MTT法检测补骨脂素对骨髓间充质干细胞活力的影响,以成骨诱导结合碱性磷酸酶染色确定补骨脂素对环磷酰胺抑制骨髓间充质干细胞成骨分化恢复作用的最佳剂量。采用RT-qPCR法检测补骨脂素干预不同时间点成骨分化标志基因Runx2、ALP、Osteocalcin、骨保护素及Wnt/β-catenin信号通路相关基因Wnt1、Wnt4、Wnt10b、β-catenin、c-MYC的mRNA表达;采用Western blot法检测补骨脂素干预不同时间点成骨特异性转录因子Runx2及Wnt/β-catenin信号通路相关基因Activeβ-catenin、DKK1、c-MYC、Cyclin D1的蛋白表达。结果与结论:(1)不同浓度补骨脂素对骨髓间充质干细胞活力没有显著影响;200μmol/L补骨脂素干预后对环磷酰胺诱导骨髓间充质干细胞成骨分化抑制的恢复作用最佳;(2)补骨脂素可以逆转环磷酰胺条件培养基导致的骨髓间充质干细胞成骨标志基因Runx2、ALP、Osteocalcin、骨保护素mRNA表达和Runx2蛋白表达的降低;(3)补骨脂素可以逆转环磷酰胺条件培养基导致的骨髓间充质干细胞Wnt/β-catenin通路相关基因Wnt4、β-catenin、c-MYC mRNA表达和Activeβ-catenin、c-MYC、Cyclin D1蛋白表达的降低以及DKK1蛋白表达的升高;(4)结果表明,环磷酰胺能抑制小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化,补骨脂素对其具有恢复作用,且200μmol/L补骨脂素干预效果最佳,而这种保护作用可能与补骨脂素激活Wnt4/β-catenin信号通路有关。

麝香黄芪复方滴丸含药血清促进骨髓间充质干细胞增殖分化

背景:骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)已被广泛用于治疗神经系统疾病,但由于血脑屏障的限制以及干细胞在受损部位存活率、分化率低,导致治疗效果有限。目的:探讨麝香黄芪复方滴丸含药血清对BMSCs增殖、迁移和向星形胶质细胞分化的影响。方法:SD雄性大鼠连续灌胃麝香黄芪复方滴丸5 d后进行腹主动脉取血,分离血清备用。采用CCK-8法检测体积分数5%,10%,20%含药血清对BMSCs增殖的影响;划痕实验观察体积分数10%含药血清对BMSCs横向迁移的影响;Transwell小室培养BMSCs,用结晶紫染色和DAPI核染色观察体积分数10%含药血清对BMSCs纵向迁移的影响;用含体积分数10%含药血清的诱导液或与星形胶质细胞共培养观察BMSCs向星形胶质细胞分化情况。结果与结论:①体积分数10%和20%含药血清在第2,3天促进细胞增殖更明显,且两种体积分数无统计学差异;②在划痕30,48 h时,10%含药血清组BMSCs迁移量显著高于对照组;③10%含药血清组BMSCs穿过Transwell小室滤过膜的数量高于对照组;④体积分数10%含药血清可能促进BMSCs向星形胶质细胞方向分化,但分化作用较弱,星形胶质细胞能进一步促进含药血清诱导BMSCs向星形胶质细胞方向分化;⑤结果表明,体积分数10%含药血清能促进BMSCs体外增殖、迁移;与星形胶质细胞共培养可能促进BMSCs向星形胶质细胞方向分化。

颌骨来源骨髓间充质干细胞成骨分化的特点、优势与应用

背景:颌面部骨组织缺损修复是目前研究的热点与难点,而种子细胞的选择是关键。颌骨来源骨髓间充质干细胞是存在于颌骨内的成体间充质干细胞,在颌面部组织再生方面的应用更具优势。目的:综述颌骨来源骨髓间充质干细胞的生物学特性和成骨分化优势以及药物、体内环境、微小RNA对其成骨分化影响的相关研究进展。方法:利用计算机在PubMed和中国知网进行文献检索。中文检索词为“口腔,骨组织工程,干细胞”,英文检索词为“oral,bone tissue engineering,stem cells”。共检索下载文章405篇,根据纳入与排除标准对文章进行筛选,最终纳入70篇文献进行综述。结果与结论:颌骨来源骨髓间充质干细胞是口腔骨组织工程的优良种子细胞,与长骨骨髓间充质干细胞相比,颌骨来源骨髓间充质干细胞具有更强的增殖能力和成骨分化能力。药物、体内环境、微小RNA均可以调控颌骨来源骨髓间充质干细胞的成骨分化,但目前对颌骨来源骨髓间充质干细胞的研究尚处于初始阶段,因此需要更多论证力较强的研究来证实其在颌面部骨组织再生领域的应用更具优势。

骨髓间充质干细胞来源的miR-199a-5p通过抑制ZIK1/MAP3K11调节肾细胞癌细胞的增殖和侵袭

目的:研究骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)来源的外泌体(exsome)中miR-199a-5p对肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)细胞增殖和侵袭的影响。方法:分离骨髓间充质干细胞来源的外泌体(BM-MSCs-Exo),电子显微镜观察外泌体形态,Western blot方法检测外泌体标志蛋白CD9和CD63。CCK-8法检测RCC细胞在不同条件下的增殖速度,Transwell法检测RCC细胞的侵袭能力,q-PCR法检测miR-199a-5p以及ZIK1和MAP3K11的mRNA表达,双荧光素酶实验验证miR-199a-5p以及ZIK1和MAP3K11基因的3’UTR区域靶向结合。结果:BM-MSCs-Exo电镜下呈圆形囊泡状,直径约100 nm,且高表达CD9和CD63,RCC细胞摄取BM-MSCs-Exo后增殖和侵袭能力均被抑制,过表达miR-199a-5p的BM-MSCs-Exo能显著抑制RCC细胞的增殖和侵袭能力,抑制BM-MSCs-Exo中的miR-199a-5p后能缓解BM-MSCs-Exo对RCC的抑制作用,且发现过表达miR-199a-5p的BM-MSCs-Exo能显著降低ZIK1和MAP3K11的mRNA表达,而在BM-MSCs-Exo中抑制miR-199a-5p有相反作用。结论:BM-MSCs-Exo通过向RCC细胞转运miR-199a-5p抑制ZIK1和MAP3K11的表达,进而抑制RCC细胞的增殖和侵袭。

骨髓间充质干细胞移植联合自拟中药治疗失代偿期肝硬化患者效果研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植术联合自拟中药治疗失代偿期肝硬化患者的效果。方法2017年6月~2022年10月我院收治的93例失代偿期肝硬化患者,随机分为A组、B组和C组,每组31例。给予A组常规内科综合治疗,在此基础上,给予B组自体BMSCs移植术治疗,C组在BMSCs移植术后,给予自拟中药治疗,三组均治疗观察6个月。采用放射免疫分析法检测血清透明质酸(HA)、IV型胶原(CIV)、层粘连蛋白(LN)和III型前胶原(PIIIP)水平;采用ELISA法检测血清白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;分别采用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥法检测血清超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平。结果在治疗6个月末,C组Child-Pugh评分和肝硬度测量(LSM)分别为(7.2±1.2)分和(9.0±0.6)kPa,显著低于B组【分别为(8.0±1.1)分和(9.3±0.5)kPa,P<0.05】或A组【分别为(8.9±1.4)分和(9.6±0.6)kPa,P<0.05】,而血清ALB水平为(34.6±3.1)g/L,显著高于B组【(32.0±1.9)g/L,P<0.05】或A组【(30.8±2.4)g/L,P<0.05】;C组血清HA和LN水平分别为(123.8±31.8)ng/mL和(112.9±27.5)ng/mL,显著低于B组【分别为(141.7±29.5)ng/mL和(129.3±30.3)ng/mL,P<0.05】或A组【分别为(186.2±36.7)ng/mL和(161.1±36.5)ng/mL,P<0.05】;C组血清IL-6、TNF-α和MDA水平分别为(104.6±16.7)ng/L、(192.7±19.8)ng/L和(4.1±0.9)μmol/L,显著低于B组【分别为(114.3±15.3)ng/L、(210.9±22.8)ng/L和(5.0±1.3)μmol/L,P<0.05】或A组【分别为(132.8±19.5)ng/L、(230.2±27.1)ng/L和(6.2±1.5)μmol/L,P<0.05】,而血清SOD水平为(143.9±14.5)U/mL,显著高于B组【(134.2±13.3)U/mL,P<0.05】或A组【(122.1±11.7)U/mL,P<0.05】。结论采用BMSCs移植术联合自拟中药治疗失代偿期肝硬化患者可改善肝功能指标,可能与抑制了炎性反应和缓解了氧化应激反应有关。

骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠心肌梗死:急性和慢性运动的影响

背景:干细胞移植对治疗心肌梗死具有可观的治疗前景,但移植细胞向心脏归巢效率及在心脏内的滞留率和存活率较低限制了干细胞疗效。运动疗法是心肌梗死患者心脏康复的重要有机组成部分,然而运动在干细胞移植治疗心肌梗死中的作用尚未明确。目的:探讨运动(包括急性和慢性运动)对骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠心肌梗死的影响。方法:取80只雌性SD大鼠,采用随机数字表法分为假手术组、模型组、移植组或联合组,每组20只。模型组、移植组或联合组大鼠通过冠状动脉结扎术制作心肌梗死模型,造模24 h后,联合组进行8周有氧运动(慢性运动,30 min/d,每周运动5 d),于首次运动(急性运动)后5 min内,移植组和联合组尾静脉输注绿色荧光蛋白标记的SD大鼠骨髓间充质干细胞,首次运动后24 h取部分大鼠,检测大鼠心肌内移植的干细胞存活率、Y染色体性别决定区mRNA表达、归巢因子蛋白表达以及氧化应激和炎症反应参数;末次运动后72 h取剩余大鼠,检测心脏结构与功能、心肌组织学变化和Ki67^(+)细胞数量。结果与结论:(1)急性运动后:与假手术组比较,模型组心肌活性氧、丙二醛、肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β水平升高(P <0.05),超氧化物歧化酶活性降低(P <0.05);与模型组比较,移植组和联合组活性氧、丙二醛水平及肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β蛋白表达降低(P <0.05),超氧化物歧化酶活性及基质细胞衍生因子1α、CXC趋化因子受体4蛋白表达升高(P <0.05);与移植组比较,联合组活性氧、丙二醛水平及肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β蛋白表达降低(P <0.05),干细胞存活率、Y染色体性别决定区mRNA表达、超氧化物歧化酶活性及基质细胞衍生因子1α和CXC趋化因子受体4蛋白表达升高(P <0.05)。(2)慢性运动后:与假手术组比较,模型组心肌细胞横截面积、胶原含量增加(P <0.05),左心室射血分数、左心室短轴缩短率下降(P <0.05);与模型组比较,移植组心肌细胞横截面积与胶原含量降低(P <0.05),Ki67+细胞升高(P <0.05);与移植组比较,联合组胶原含量降低(P <0.05),心肌细胞横截面积、左心室射血分数、左心室短轴缩短率、Ki67+细胞升高(P <0.05)。(3)急性运动通过促进干细胞归巢、改善心肌微环境提高外源性干细胞存活率,慢性运动可刺激干细胞移植后心肌细胞增殖、抑制心脏重塑并增强心功能,提示运动有助于优化大鼠心肌梗死后干细胞移植疗效。

基于间充质干细胞的小鼠急性移植物抗宿主病骨髓微环境损伤体外细胞模型的建立与评价策略研究

目的:建立小鼠急性移植物抗宿主病(aGVHD)骨髓微环境损伤的体外细胞模型并进行评价。方法:以6-8周龄雌性C57BL/6N小鼠作为骨髓和淋巴细胞的供体,6-8周龄雌性BALB/c小鼠作为aGVHD模型的受鼠。受鼠接受致死剂量(8.0 Gy,72.76 cGy/min)γ射线全身照射后6-8 h内,尾静脉输注供鼠来源骨髓细胞(1×10^(7)/只),建立骨髓移植(BMT)组小鼠模型(n=20);尾静脉输注供鼠来源骨髓细胞(1×10^(7)/只)及脾脏淋巴细胞(2×10^(6)/只),建立小鼠aGVHD模型(n=20)。造模后d 7麻醉小鼠,摘取眼球取血,静置离心后吸取血清。分离小鼠间充质干细胞(MSC),分别用添加了2%、5%和10%的BMT组血清和相同浓度的aGVHD组血清的培养基进行培养。通过成纤维细胞集落形成实验(CFU-F)评价两组血清对MSC集落形成能力的影响;通过CD29和CD105免疫荧光染色评价两组MSC表面分子表达的差异;通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测MSC自我更新相关基因Oct-4、Sox-2和Nanog的表达情况。结果:成功建立起可以模拟小鼠aGVHD骨髓微环境损伤的体外细胞模型。CFU-F实验表明,在培养后d 7,与BMT组相比,aGVHD血清浓度为2%和5%时,MSC集落形成能力显著降低(P<0.05);在培养后d 14,与BMT组相比,不同aGVHD血清浓度组MSC集落形成能力均显著降低(P<0.05)。免疫荧光染色实验表明,MSC表面分子CD29^(+)和CD105^(+)细胞百分比在不同aGVHD血清浓度组较BMT组均降低,在aGVHD血清浓度为10%时差异最为显著(P<0.001,P<0.01)。RT-qPCR检测结果显示,aGVHD血清浓度组MSC自我更新相关基因Oct-4、Sox-2和Nanog表达下降,在aGVHD血清浓度为10%时差异最为显著(P<0.01,P<0.001,P<0.001)。结论:不同浓度的小鼠aGVHD血清和小鼠MSC共同培养,发现添加不同浓度的小鼠aGVHD血清MSC的自我更新能力受损程度不同,为开展aGVHD骨髓微环境损伤领域研究提供了新的工具。

乳腺癌细胞条件培养基对骨髓间充质干细胞生物学行为的影响

目的探讨MCF-7乳腺癌细胞条件培养基对骨髓间充质干细胞(BMSC)增殖、凋亡和迁移的影响及分子机制。方法正常环境下培养的BMSC为对照组,以MCF-7细胞条件培养基培养的BMSC为MCF-7条件培养基组,向MCF-7条件培养基组添加10 nmol/L GSK690693(Akt抑制剂)为Akt抑制剂组,向MCF-7条件培养基组添加10µmol/L Reparixin(CXCR1/2抑制剂)为CXCR1/2抑制剂组。MTT实验检测各组BMSC增殖情况,Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞凋亡实验检测各组BMSC凋亡率,Transwell细胞迁移实验检测各组BMSC的迁移能力,酶联免疫吸附试验检测两种细胞培养上清液和MCF-7细胞条件培养基中白细胞介素(IL)-8蛋白含量,Western blot检测各组BMSC的蛋白激酶B(Akt)/磷酸化Akt(p-Akt)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/磷酸化mTOR(p-mTOR)蛋白表达。结果与对照组相比,MCF-7条件培养基组BMSC的细胞增殖水平、迁移数目以及p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量均增高,细胞凋亡率降低(P<0.05);与MCF-7条件培养基组相比,CXCR1/2抑制剂组和Akt抑制剂组BMSC的细胞增殖水平、迁移数目以及p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量均降低,细胞凋亡率增加(P<0.05);MCF-7细胞条件培养基和MCF-7培养上清液中IL-8蛋白含量均较BMSC培养上清液中IL-8蛋白含量高(P<0.05)。结论MCF-7细胞条件培养基通过激活Akt-mTOR信号通路促进BMSC增殖和迁移,抑制BMSC凋亡,其中IL-8-CXCR1/2轴发挥关键作用。

骨髓间充质干细胞来源的外泌体静脉移植对脊髓损伤的修复作用研究

目的:分析骨髓间充质干细胞来源的外泌体静脉移植对脊髓损伤的修复作用。方法:选择2013年10月—2014年3月河南省洛阳正骨医院实验室试验的78例大鼠为研究对象,应用随机抛球法将大鼠分为手术组(n=26)、对照组(n=26)、外泌体组(n=26)。通过脊髓法建立大鼠脊髓损伤模型后,对照组不作处理,手术组在对照组的基础上实施切开减压术,而外泌体组在对照组的基础上实施全骨髓培养法培养大鼠BMSCs,收集P2代细胞上清,应用ExoQuickPrecipitation提取法分离并纯化外泌体,通过透射电镜观察鉴定外泌体形态,采用Westernblot鉴定外泌体表面标志蛋白CD9、CD63,在造模1 h后尾静脉给予外泌体移植500μL。分别采用BBB评分、斜板实验在术后1、3、7、14、21、28 d评价大鼠的运动功能恢复情况,并于术后28 d处死试验大鼠,采用苏木精-伊红(HE)染色、髓鞘(LFB)染色观察各组脊髓组织形态学改变,尼氏(Nissl)染色观察神经元存活数目。结果:术后各时间点手术组大鼠BBB评分高于对照组和外泌体组,术后7、14、21、28 d外泌体组大鼠BBB评分高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。手术组术后各时间点斜板评分高于对照组及外泌体组,差异有统计学意义(P<0.05)。造模后28 d,手术组的脊髓组织HE染色体等均正常,神经元数目减少。结论:BMSCs外泌体静脉移植对脊髓损伤有明显的改善作用,可以提高患者的运动能力,减轻脊髓损伤,加速脊髓损伤的恢复。

西达本胺对骨髓增生异常综合征患者骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的:探索西达本胺对骨髓增生异常综合征(MDS)患者骨髓间充质干细胞(MSC)成骨分化的作用及机制。方法:分离培养正常对照者及MDS患者的骨髓MSC,CCK-8法检测西达本胺对MSC增殖活性的影响,组蛋白去乙酰化酶(HDAC)活性荧光检测试剂盒及Western blot检测西达本胺对MSC中HDAC的影响。对MSC成骨诱导分化,在d 3进行碱性磷酸酶活性检测,d 21进行茜素红染色观察钙结节形成情况,在d 7和21分别检测成骨相关早期及后期基因的mRNA表达变化。RT-PCR及Western blot分别检测西达本胺对MSC成骨关键转录因子Runt相关转录因子2(RUNX2)mRNA及蛋白表达的影响。结果:随着西达本胺浓度的增加,MSC增殖受到抑制,但低浓度(1μmol/L)西达本胺对MSC无显著的增殖抑制作用,但可显著抑制HDAC活性。在正常对照组及MDS患者的骨髓MSC中,西达本胺(1μmol/L)可以显著增加碱性磷酸酶活性、促进钙结节形成及上调成骨基因的mRNA表达,从而恢复MDS患者MSC较正常对照组MSC减弱的成骨分化能力。机制研究结果显示,西达本胺促成骨作用可能与RUNX2表达的上调有关。结论:西达本胺可以抑制MDS-MSC的HDAC活性,上调成骨转录因子RUNX2表达,促进MDS-MSC的成骨分化。

补阳还五汤对急性心肌梗死大鼠移植骨髓间充质干细胞归巢作用的实验研究

目的:观察补阳还五汤对急性心肌梗死大鼠移植骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)归巢的影响及补阳还五汤与BMSCs联合对心肌损伤的防护作用。方法:取7~8周龄SPF级Sprague-Dawley(SD)大鼠48只,雌雄各半,体质量(220±20)g,随机分为4组:假手术组、模型组、BMSCs移植组、补阳还五汤+BMSCs移植组。各组大鼠灌胃3 d后随机取6只采集血清,采用生化法检测心肌酶[磷酸肌酸同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白I(Cardiac Troponin I,cTnI)]水平;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测炎症因子白细胞介素(Interleukin,IL)-6、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)表达情况;取心肌梗死及边缘区心肌组织,镜下观察移植BMSCs归巢情况。其余大鼠继续灌胃,4周后运用多普勒超声心动图分析心功能变化。结果:与模型组比较,补阳还五汤+BMSCs移植组CK-MB、cTnI含量降低明显,差异有显著统计学意义(P <0.01)。与模型组、BMSCs移植组比较,补阳还五汤+BMSCs移植组IL-6、TNF-α水平下降,差异有统计学意义(P <0.05)。荧光显微镜下示补阳还五汤+BMSCs移植组的荧光细胞表达数量高于单纯BMSCs移植组(P <0.05)。与模型组比较,补阳还五汤+BMSCs移植组左室射血分数升高明显,差异有统计学意义(P <0.05)。结论:补阳还五汤可以促进移植BMSCs归巢,发挥心肌损伤的防护作用,其机制可能与补阳还五汤抑制心肌梗死后局部炎症、祛瘀生新、改善心肌局部代谢环境有关。

“脾肾相赞”理论探讨不同治法对大鼠骨髓间充质干细胞成肌分化中TNF-α、JNK含量影响

目的在“脾肾相赞”理论指导下,比较不同中医治法对大鼠BMSCs成肌分化及过程中TNF-α、JNK蛋白表达的影响,分析中医治疗骨质疏松症的机制。方法将大鼠分为正常组、诱导组、补肾组、健脾组、补肾健脾组(随机数字表法),制备含药血清,选取第4代BMSCs进行实验,运用免疫荧光法分析各组成肌分化情况,酶联免疫吸附法检测TNF-α、JNK蛋白表达量。结果①BMSCs经诱导15d后,通过免疫荧光化学染色法检测MyoG荧光平均强度,结果显示:各组均显著高于正常组(P<0.01),补肾健脾组最高。②TNF-α蛋白检测:补肾组、补肾健脾组显著低于正常组(P<0.01)。③JNK蛋白检测:各组显著低于正常组(P<0.01)。结论①各治法中,补肾健脾法对大鼠BMSCs成肌分化的促进效果最佳,为通过脾肾、肌骨双方向治疗OP提供可能。②各中医治法均对大鼠BMSCs的成肌分化存在促进作用,这可能与降低TNF-α、JNK水平有关。