过表达CXCR4促进小鼠骨髓间充质干细胞的归巢和增殖

目的研究过表达CXC趋化因子受体4(CXCR4)对小鼠骨髓间充质干细胞(BMMSC)体内外归巢特性和细胞增殖活性的影响。方法利用慢病毒载体介导小鼠BMMSC过表达CXCR4,构建过表达CXCR4的细胞(CXCR4-BMMSC)。TranswellTM小室实验检测基质细胞衍生因子1(SDF-1)对BMMSC迁移能力的影响;噻唑蓝(MTT)法检测BMMSC的增殖能力。BALB/c小鼠接受全身照射(TBI)后,随机分为2组,每组10只。BMMSC对照组:小鼠经TBI后,输注5×10^5个绿色荧光蛋白标记的BMMSC(GFP-BMMSC);CXCR4-BMMSC组:小鼠经TBI后,回输5×10^5个携带GFP的CXCR4-BMMSC。尾静脉回输细胞后,取小鼠胸腺进行冰冻切片,荧光显微镜下观察回输的细胞归巢至胸腺组织的情况;流式细胞术检测BMMSC归巢至受鼠体内胸腺的效率。结果 TranswellTM小室实验证实CXCR4可促进SDF诱导的BMMSC的跨膜迁移;与BMMSC对照组相比,CXCR4-BMMSC的增殖活性显著升高。与BMMSC对照组相比,过表达CXCR4可明显提高BMMSC归巢至胸腺组织的效率;流式细胞术检测结果提示BMMSC归巢至胸腺数量高于对照组。结论过表达CXCR4可增强SDF-1对BMMSC的迁移募集,体内可促进BMMSC归巢至损伤胸腺。CXCR4还可促进小鼠BMMSC的增殖。

静脉输注骨髓间充质干细胞的归巢路径

背景:间充质干细胞被认为是最有希望用于治疗多种疾病的一种非造血组织的多能干细胞,但是其靶向组织器官归巢率偏低,影响了其作为干细胞疗法的效果。目的:通过对国内外相关文献的综合分析,探讨静脉输注骨髓间充质干细胞的归巢现象。方法:利用计算机检索清华同方数据库、万方数据库、Pubmed数据库,检索英文关键词为"Bone marrow mesenchymal stemcells,homing",中文关键词为"骨髓间充质干细胞,归巢",主要筛选出近10年内最具代表性的文献资料。经查阅、整理出33篇可支持本综述的文献。结果与结论:研究发现,静脉输注的骨髓间充质干细胞与血管壁接触并穿过内皮细胞从而归巢至多个脏器,特别是损伤、炎症及肿瘤部位。文章从静脉输注骨髓间充质干细胞的归巢特点,输注回输骨髓间充质干细胞迁移与归巢的可能机制等方面进行了相关论述。归巢的机制与参与调控的信号分子及其受体,如趋化因子、生长因子和黏附分子等有关。

剖宫产手术不影响孕鼠体内骨髓间充质干细胞的归巢

背景:剖宫产术后远期并发症(前置胎盘、胎盘植入、瘢痕处妊娠、子宫破裂)危及孕产妇生命,剖宫产术切口瘢痕处的子宫内膜及平滑肌缺损、蜕膜形成不良可能是主要病因。间充质干细胞具有修复组织损伤的功能,归巢于损伤部位的细胞量有可能影响组织修复的效果。目的:在大鼠剖宫产手术模型中探讨间充质干细胞输入后在体内的分布、归巢情况。方法:体外分离雄性大鼠骨髓间充质干细胞并鉴定。取雌性Wistar大鼠随机分为2组:剖宫产手术组大鼠于受孕第21天进行剖宫产术,术后即时经尾静脉注射制备好的雄性大鼠间充质干细胞;对照组大鼠自然分娩后即注射等量雄性大鼠间充质干细胞。分别于注射后第7,28天处死大鼠,通过SRY-PCR技术检测其心、肺、肝、肾、以及子宫瘢痕组织中SRY基因含量,间接反映组织中雄性大鼠骨髓间充质干细胞的存留量及相对分布水平。结果与结论:剖宫产手术组细胞注射后第7天,SRY基因在肺组织中含量最高,其次是肝,在肾组织中也有一定量的分布,而在心脏和子宫瘢痕处的SRY基因含量较少;注射后第28天SRY基因在肺、肝和肾中的含量均有一定程度的下降(P<0.05),而在心脏和子宫瘢痕处,SRY基因的含量未见显著变化(P>0.05)。非手术对照组注射后第7,28天SRY基因的检测结果和剖宫产手术组基本一致,心脏和子宫组织的SRY基因含量均较低。结果提示:异体骨髓间充质干细胞进入大鼠体内主要分部于血流丰富的肺、肝、肾组织,并且随着时间干细胞量逐渐减少;心脏和子宫组织中的骨髓间充质干细胞数量较少,随时间变化不明显。剖宫产手术损伤并没有影响骨髓间充质干细胞在孕鼠体内的分布,也没有增加骨髓间充质干细胞在子宫手术瘢痕处的归巢和定植。

有氧运动预适应改善骨髓间充质干细胞治疗急性心肌梗死的效果

背景:干细胞疗法是急性心肌梗死后恢复受损心肌组织的替代治疗策略,运动预适应可诱导机体产生内源性心脏保护效应,然而两者联合应用的疗效及机制尚不清楚。目的:探讨运动预适应联合骨髓间充质干细胞对急性心肌梗死大鼠治疗效果的影响及其可能机制。方法:70只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、干细胞治疗组、运动预适应组和联合干预组。运动预适应组和联合干预组于造模前进行8周跑台有氧运动,然后通过结扎冠状动脉前降支制作急性心肌梗死模型,干细胞治疗组和联合干预组于造模后隔天尾静脉注射骨髓间充质干细胞(1×10^(9)L^(-1),1 mL),治疗4周后,利用递增负荷跑台运动实验评估运动能力,超声心动图检测心脏结构与功能;分离左心室,2,3,5-氯化三苯基四氮唑染色评估心肌梗死面积,Masson染色检测胶原容积分数,CD31免疫组织化学染色检测心肌毛细血管密度,TUNEL染色检测心肌细胞凋亡情况,免疫印迹法检测基质细胞衍生因子1、CXC趋化因子受体蛋白4、肿瘤坏死因子α、白细胞介素10和血管内皮生长因子蛋白表达量。结果与结论:①干预疗效:与假手术组比较,模型组运动能力、左心室射血分数、左心室缩短分数、CD31阳性细胞率下降(P<0.05),心肌梗死面积、胶原容积分数和心肌细胞凋亡率增加(P<0.05)。与模型组比较,干细胞治疗组运动能力无显著差异(P>0.05),运动预适应组和联合干预组运动能力提高(P<0.05);干细胞治疗组、运动预适应组、联合干预组左心室射血分数、左心室缩短分数、CD31阳性细胞率升高(P<0.05),心肌梗死面积、胶原容积分数、心肌细胞凋亡率降低(P<0.05)。与干细胞治疗组比较,联合干预组运动能力、左心室射血分数、左心室缩短分数、CD31阳性细胞率增加(P<0.05),心肌梗死面积、胶原容积分数、心肌细胞凋亡率降低(P<0.05)。②蛋白表达:与假手术组比较,模型组肿瘤坏死因子α表达升高(P<0.05),白细胞介素10和血管内皮生长因子表达下降(P<0.05)。与模型组比较,干细胞治疗组和联合干预组CXC趋化因子受体蛋白4表达升高(P<0.05),干细胞治疗组、运动预适应组和联合干预组肿瘤坏死因子α表达下降(P<0.05),白细胞介素10和血管内皮生长因子表达增加(P<0.05)。与干细胞治疗组比较,联合干预组肿瘤坏死因子α表达降低(P<0.05),CXC趋化因子受体蛋白4、白细胞介素10和血管内皮生长因子表达升高(P<0.05)。结果表明:运动预适应可增强急性心肌梗死大鼠骨髓间充质干细胞治疗的效果(抑制心脏重塑、改善心功能、延缓心力衰竭进程),其机制与促进干细胞归巢、抑制炎症反应以及促进血管新生有关。

骨髓间充质干细胞来源外泌体调节大鼠肝细胞凋亡的机制

背景:骨髓间充质干细胞可释放大量外泌体,关于骨髓间充质干细胞来源外泌体对肝细胞凋亡的影响以及具体机制还没有完全阐明。目的:探索骨髓间充质干细胞来源外泌体所携带的miR-21-5p对大鼠肝脏细胞凋亡的影响及其作用机制。方法:分离大鼠骨髓间充质干细胞,将miR-21-5p NC或miR-21-5p inhibitor转染到骨髓间充质干细胞中,采用超速离心法提取外泌体,命名为(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos,(BMSCs+miR-21-5p inhibitor)-Exos,将外泌体与BRL大鼠肝细胞共培养,观察抑制miR-21-5p表达后对大鼠肝细胞凋亡的影响。通过双荧光素酶报告基因检测验证外泌体中miR-21-5p和PIK3R1之间的靶向关系;TUNEL检测外泌体中miR-21-5p直接靶向PIK3R1激活PI3K/AKT信号通路对BRL大鼠肝细胞凋亡的影响。结果与结论:①双荧光素酶报告系统证实,PI3KR1野生型载体与miR-21-5p mimics共转染293T细胞时的荧光素酶活性显著低于PI3KR1突变型载体共转染组,表明miR-21-5p可靶向结合PIK3R1;②TUNEL检测结果显示:相比于(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos组,(BMSCs+miR-21-5p inhibitor)-Exos处理后BRL肝细胞凋亡率显著增加;与(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos组相比,加入AKT抑制剂LY294002之后,细胞凋亡率显著增加;③结果提示:外泌体可能通过miR-21-5p直接靶向PIK3R1激活PI3K/AKT信号通路抑制BRL大鼠肝细胞凋亡。

补骨脂素对环磷酰胺抑制小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的恢复作用

背景:补骨脂素具有很强的抗骨质疏松活性,可能对化疗导致的骨质疏松具有恢复作用。目的:探讨补骨脂素对环磷酰胺抑制小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的恢复作用及机制。方法:分离培养C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,以MTT法检测补骨脂素对骨髓间充质干细胞活力的影响,以成骨诱导结合碱性磷酸酶染色确定补骨脂素对环磷酰胺抑制骨髓间充质干细胞成骨分化恢复作用的最佳剂量。采用RT-qPCR法检测补骨脂素干预不同时间点成骨分化标志基因Runx2、ALP、Osteocalcin、骨保护素及Wnt/β-catenin信号通路相关基因Wnt1、Wnt4、Wnt10b、β-catenin、c-MYC的mRNA表达;采用Western blot法检测补骨脂素干预不同时间点成骨特异性转录因子Runx2及Wnt/β-catenin信号通路相关基因Activeβ-catenin、DKK1、c-MYC、Cyclin D1的蛋白表达。结果与结论:(1)不同浓度补骨脂素对骨髓间充质干细胞活力没有显著影响;200μmol/L补骨脂素干预后对环磷酰胺诱导骨髓间充质干细胞成骨分化抑制的恢复作用最佳;(2)补骨脂素可以逆转环磷酰胺条件培养基导致的骨髓间充质干细胞成骨标志基因Runx2、ALP、Osteocalcin、骨保护素mRNA表达和Runx2蛋白表达的降低;(3)补骨脂素可以逆转环磷酰胺条件培养基导致的骨髓间充质干细胞Wnt/β-catenin通路相关基因Wnt4、β-catenin、c-MYC mRNA表达和Activeβ-catenin、c-MYC、Cyclin D1蛋白表达的降低以及DKK1蛋白表达的升高;(4)结果表明,环磷酰胺能抑制小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化,补骨脂素对其具有恢复作用,且200μmol/L补骨脂素干预效果最佳,而这种保护作用可能与补骨脂素激活Wnt4/β-catenin信号通路有关。

麝香黄芪复方滴丸含药血清促进骨髓间充质干细胞增殖分化

背景:骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)已被广泛用于治疗神经系统疾病,但由于血脑屏障的限制以及干细胞在受损部位存活率、分化率低,导致治疗效果有限。目的:探讨麝香黄芪复方滴丸含药血清对BMSCs增殖、迁移和向星形胶质细胞分化的影响。方法:SD雄性大鼠连续灌胃麝香黄芪复方滴丸5 d后进行腹主动脉取血,分离血清备用。采用CCK-8法检测体积分数5%,10%,20%含药血清对BMSCs增殖的影响;划痕实验观察体积分数10%含药血清对BMSCs横向迁移的影响;Transwell小室培养BMSCs,用结晶紫染色和DAPI核染色观察体积分数10%含药血清对BMSCs纵向迁移的影响;用含体积分数10%含药血清的诱导液或与星形胶质细胞共培养观察BMSCs向星形胶质细胞分化情况。结果与结论:①体积分数10%和20%含药血清在第2,3天促进细胞增殖更明显,且两种体积分数无统计学差异;②在划痕30,48 h时,10%含药血清组BMSCs迁移量显著高于对照组;③10%含药血清组BMSCs穿过Transwell小室滤过膜的数量高于对照组;④体积分数10%含药血清可能促进BMSCs向星形胶质细胞方向分化,但分化作用较弱,星形胶质细胞能进一步促进含药血清诱导BMSCs向星形胶质细胞方向分化;⑤结果表明,体积分数10%含药血清能促进BMSCs体外增殖、迁移;与星形胶质细胞共培养可能促进BMSCs向星形胶质细胞方向分化。

颌骨来源骨髓间充质干细胞成骨分化的特点、优势与应用

背景:颌面部骨组织缺损修复是目前研究的热点与难点,而种子细胞的选择是关键。颌骨来源骨髓间充质干细胞是存在于颌骨内的成体间充质干细胞,在颌面部组织再生方面的应用更具优势。目的:综述颌骨来源骨髓间充质干细胞的生物学特性和成骨分化优势以及药物、体内环境、微小RNA对其成骨分化影响的相关研究进展。方法:利用计算机在PubMed和中国知网进行文献检索。中文检索词为“口腔,骨组织工程,干细胞”,英文检索词为“oral,bone tissue engineering,stem cells”。共检索下载文章405篇,根据纳入与排除标准对文章进行筛选,最终纳入70篇文献进行综述。结果与结论:颌骨来源骨髓间充质干细胞是口腔骨组织工程的优良种子细胞,与长骨骨髓间充质干细胞相比,颌骨来源骨髓间充质干细胞具有更强的增殖能力和成骨分化能力。药物、体内环境、微小RNA均可以调控颌骨来源骨髓间充质干细胞的成骨分化,但目前对颌骨来源骨髓间充质干细胞的研究尚处于初始阶段,因此需要更多论证力较强的研究来证实其在颌面部骨组织再生领域的应用更具优势。

骨髓间充质干细胞来源的miR-199a-5p通过抑制ZIK1/MAP3K11调节肾细胞癌细胞的增殖和侵袭

目的:研究骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)来源的外泌体(exsome)中miR-199a-5p对肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)细胞增殖和侵袭的影响。方法:分离骨髓间充质干细胞来源的外泌体(BM-MSCs-Exo),电子显微镜观察外泌体形态,Western blot方法检测外泌体标志蛋白CD9和CD63。CCK-8法检测RCC细胞在不同条件下的增殖速度,Transwell法检测RCC细胞的侵袭能力,q-PCR法检测miR-199a-5p以及ZIK1和MAP3K11的mRNA表达,双荧光素酶实验验证miR-199a-5p以及ZIK1和MAP3K11基因的3’UTR区域靶向结合。结果:BM-MSCs-Exo电镜下呈圆形囊泡状,直径约100 nm,且高表达CD9和CD63,RCC细胞摄取BM-MSCs-Exo后增殖和侵袭能力均被抑制,过表达miR-199a-5p的BM-MSCs-Exo能显著抑制RCC细胞的增殖和侵袭能力,抑制BM-MSCs-Exo中的miR-199a-5p后能缓解BM-MSCs-Exo对RCC的抑制作用,且发现过表达miR-199a-5p的BM-MSCs-Exo能显著降低ZIK1和MAP3K11的mRNA表达,而在BM-MSCs-Exo中抑制miR-199a-5p有相反作用。结论:BM-MSCs-Exo通过向RCC细胞转运miR-199a-5p抑制ZIK1和MAP3K11的表达,进而抑制RCC细胞的增殖和侵袭。

乳腺癌细胞条件培养基对骨髓间充质干细胞生物学行为的影响

目的探讨MCF-7乳腺癌细胞条件培养基对骨髓间充质干细胞(BMSC)增殖、凋亡和迁移的影响及分子机制。方法正常环境下培养的BMSC为对照组,以MCF-7细胞条件培养基培养的BMSC为MCF-7条件培养基组,向MCF-7条件培养基组添加10 nmol/L GSK690693(Akt抑制剂)为Akt抑制剂组,向MCF-7条件培养基组添加10µmol/L Reparixin(CXCR1/2抑制剂)为CXCR1/2抑制剂组。MTT实验检测各组BMSC增殖情况,Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞凋亡实验检测各组BMSC凋亡率,Transwell细胞迁移实验检测各组BMSC的迁移能力,酶联免疫吸附试验检测两种细胞培养上清液和MCF-7细胞条件培养基中白细胞介素(IL)-8蛋白含量,Western blot检测各组BMSC的蛋白激酶B(Akt)/磷酸化Akt(p-Akt)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/磷酸化mTOR(p-mTOR)蛋白表达。结果与对照组相比,MCF-7条件培养基组BMSC的细胞增殖水平、迁移数目以及p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量均增高,细胞凋亡率降低(P<0.05);与MCF-7条件培养基组相比,CXCR1/2抑制剂组和Akt抑制剂组BMSC的细胞增殖水平、迁移数目以及p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量均降低,细胞凋亡率增加(P<0.05);MCF-7细胞条件培养基和MCF-7培养上清液中IL-8蛋白含量均较BMSC培养上清液中IL-8蛋白含量高(P<0.05)。结论MCF-7细胞条件培养基通过激活Akt-mTOR信号通路促进BMSC增殖和迁移,抑制BMSC凋亡,其中IL-8-CXCR1/2轴发挥关键作用。

西达本胺对骨髓增生异常综合征患者骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的:探索西达本胺对骨髓增生异常综合征(MDS)患者骨髓间充质干细胞(MSC)成骨分化的作用及机制。方法:分离培养正常对照者及MDS患者的骨髓MSC,CCK-8法检测西达本胺对MSC增殖活性的影响,组蛋白去乙酰化酶(HDAC)活性荧光检测试剂盒及Western blot检测西达本胺对MSC中HDAC的影响。对MSC成骨诱导分化,在d 3进行碱性磷酸酶活性检测,d 21进行茜素红染色观察钙结节形成情况,在d 7和21分别检测成骨相关早期及后期基因的mRNA表达变化。RT-PCR及Western blot分别检测西达本胺对MSC成骨关键转录因子Runt相关转录因子2(RUNX2)mRNA及蛋白表达的影响。结果:随着西达本胺浓度的增加,MSC增殖受到抑制,但低浓度(1μmol/L)西达本胺对MSC无显著的增殖抑制作用,但可显著抑制HDAC活性。在正常对照组及MDS患者的骨髓MSC中,西达本胺(1μmol/L)可以显著增加碱性磷酸酶活性、促进钙结节形成及上调成骨基因的mRNA表达,从而恢复MDS患者MSC较正常对照组MSC减弱的成骨分化能力。机制研究结果显示,西达本胺促成骨作用可能与RUNX2表达的上调有关。结论:西达本胺可以抑制MDS-MSC的HDAC活性,上调成骨转录因子RUNX2表达,促进MDS-MSC的成骨分化。

补阳还五汤对急性心肌梗死大鼠移植骨髓间充质干细胞归巢作用的实验研究

目的:观察补阳还五汤对急性心肌梗死大鼠移植骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)归巢的影响及补阳还五汤与BMSCs联合对心肌损伤的防护作用。方法:取7~8周龄SPF级Sprague-Dawley(SD)大鼠48只,雌雄各半,体质量(220±20)g,随机分为4组:假手术组、模型组、BMSCs移植组、补阳还五汤+BMSCs移植组。各组大鼠灌胃3 d后随机取6只采集血清,采用生化法检测心肌酶[磷酸肌酸同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白I(Cardiac Troponin I,cTnI)]水平;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测炎症因子白细胞介素(Interleukin,IL)-6、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)表达情况;取心肌梗死及边缘区心肌组织,镜下观察移植BMSCs归巢情况。其余大鼠继续灌胃,4周后运用多普勒超声心动图分析心功能变化。结果:与模型组比较,补阳还五汤+BMSCs移植组CK-MB、cTnI含量降低明显,差异有显著统计学意义(P <0.01)。与模型组、BMSCs移植组比较,补阳还五汤+BMSCs移植组IL-6、TNF-α水平下降,差异有统计学意义(P <0.05)。荧光显微镜下示补阳还五汤+BMSCs移植组的荧光细胞表达数量高于单纯BMSCs移植组(P <0.05)。与模型组比较,补阳还五汤+BMSCs移植组左室射血分数升高明显,差异有统计学意义(P <0.05)。结论:补阳还五汤可以促进移植BMSCs归巢,发挥心肌损伤的防护作用,其机制可能与补阳还五汤抑制心肌梗死后局部炎症、祛瘀生新、改善心肌局部代谢环境有关。

“脾肾相赞”理论探讨不同治法对大鼠骨髓间充质干细胞成肌分化中TNF-α、JNK含量影响

目的在“脾肾相赞”理论指导下,比较不同中医治法对大鼠BMSCs成肌分化及过程中TNF-α、JNK蛋白表达的影响,分析中医治疗骨质疏松症的机制。方法将大鼠分为正常组、诱导组、补肾组、健脾组、补肾健脾组(随机数字表法),制备含药血清,选取第4代BMSCs进行实验,运用免疫荧光法分析各组成肌分化情况,酶联免疫吸附法检测TNF-α、JNK蛋白表达量。结果①BMSCs经诱导15d后,通过免疫荧光化学染色法检测MyoG荧光平均强度,结果显示:各组均显著高于正常组(P<0.01),补肾健脾组最高。②TNF-α蛋白检测:补肾组、补肾健脾组显著低于正常组(P<0.01)。③JNK蛋白检测:各组显著低于正常组(P<0.01)。结论①各治法中,补肾健脾法对大鼠BMSCs成肌分化的促进效果最佳,为通过脾肾、肌骨双方向治疗OP提供可能。②各中医治法均对大鼠BMSCs的成肌分化存在促进作用,这可能与降低TNF-α、JNK水平有关。

人骨髓间充质干细胞通过YAP影响人脂肪肉瘤SW872细胞的生物学行为

目的:观察人骨髓间充质干细胞(hMSCs)条件培养基(CM)与人脂肪肉瘤SW872细胞共培养后对肿瘤细胞增殖和迁移能力的影响,探讨hMSCs CM对脂肪肉瘤细胞的作用及可能的作用机制。方法:体外培养hMSCs,采用慢病毒方法分别转染慢病毒空载体shNS(对照组)和慢病毒shRNA Yes相关蛋白(YAP)(shYAP-hMSCs组),采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测各组hMSCs中YAP mRNA和蛋白表达水平,提取CM。体外培养SW872细胞,分为对照组(正常培养)、hMSCs CM组和shYAP-hMSCs CM组。采用CCK-8法检测各组细胞增殖活性,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,细胞划痕实验检测各组细胞划痕愈合率,Western blotting法检测各组细胞中YAP、基质金属蛋白酶9(MMP-9)和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)蛋白表达水平。结果:与对照组比较,shYAP-hMSCs组hMSCs中YAP mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.01),表明成功构建了shYAP-hMSCs稳定转染细胞株。CCK-8法,与对照组比较,hMSCs CM组SW872细胞增殖活性升高(P<0.05),shYAP-hMSCs CM组SW872细胞增殖活性降低(P<0.01);流式细胞术,与对照组比较,hMSCs CM组SW872细胞凋亡率无明显变化(P>0.05),shYAP-hMSCs CM组SW872细胞凋亡率升高(P<0.01);细胞划痕实验,与对照组比较,hMSCs CM组SW872细胞划痕愈合率升高(P<0.05),shYAP-hMSCs CM组SW872细胞划痕愈合率降低(P<0.01);Western blotting法,与对照组比较,hMSCs CM组SW872细胞中YAP、MMP-9和cyclin D1蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05),shYAP-hMSCs组SW872细胞中YAP、MMP-9和cyclin D1蛋白表达水平降低(P<0.05或P<0.01)。结论:hMSCs参与调控人脂肪肉瘤SW872细胞增殖和迁移,其机制可能与YAP表达有关。

人甲床来源的脱细胞支架搭载骨髓间充质干细胞向指甲干细胞分化的研究

目的探究人甲床来源的脱细胞支架搭载骨髓间充质干细胞向指甲干细胞分化的作用。方法收集2022年至2023年在承德医学院附属医院手足外科进行截指术的15例患者的临床废弃甲床组织,制备成脱细胞甲床支架,使用试剂盒检测参照组(未脱细胞组)与脱细胞组(脱细胞甲床支架组)中总胶原蛋白含量、残留DNA含量;将脱细胞甲床支架与人骨髓间充质干细胞(hMSCs)进行共培养14 d。比较对照组(hMSCs组)与共培养组(脱细胞甲床支架+hMSCs组)体外细胞分化能力及指甲干细胞标志物[角蛋白15,角蛋白17,G蛋白偶联受体6(Lgr6)以及β-联蛋白(β-catenin)蛋白]含量。结果脱细胞组总胶原蛋白含量为(189.62±45.45)μg/mg,低于参照组[(196.02±41.93)μg/mg],但两组相比差异无统计学意义(P>0.05);脱细胞组中DNA含量为(0.41±0.15)μg/mg,明显低于参照组[(0.87±0.13)μg/mg],差异有统计学意义(P<0.05)。培养14 d后,共培养组吸光度值为1.09±0.07,对照组吸光度值为1.10±0.5,两组相比差异无统计学意义(P>0.05)。培养14 d后,共培养组角蛋白15、角蛋白17、Lgr6、β-catenin含量分别为(39.56±5.09)、(45.83±4.01)、(5.74±0.99)、(146.79±5.34)pg/mL,均明显高于对照组[(12.10±4.28)、(10.47±3.19)、(0.93±0.67)、(67.28±7.41)pg/mL],差异均有统计学意义(P<0.05)。结论脱细胞甲床支架中的DNA有被清除、保留胶原蛋白,与hMSCs共培养后细胞增殖能力正常,且可诱导hMSCs向指甲干细胞分化,为临床上治疗甲床缺损提供新思路。

光固化水凝胶负载骨髓间充质干细胞修复大鼠颅骨缺损

目的探讨新型甲基丙烯酸酐化明胶(gelatin methacryloyl,GelMA)/骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)复合水凝胶应用于大鼠颅骨缺损区的成骨性能,为骨再生生物材料的应用提供实验依据。方法本研究经南京大学动物伦理委员会批准。通过组合光引发剂苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂[lthium phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate,LAP]、GelMA、BMSCs构建光固化复合生物水凝胶GelMA/BMSCs,扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)和能量色散X射线光谱仪(energy disper-sive X-ray spectroscopy,EDX)检测GelMA凝胶表面微观形态及元素构成,电子万能试验机测试凝胶压缩强度。将GelMA/BMSCs水凝胶在体外培养1、2、5 d后,通过CCK-8检测水凝胶包封的BMSCs细胞增殖活性,利用共聚焦显微成像技术观察其存活情况和细胞形态;在大鼠颅骨制备5 mm临界骨缺模型,经复合水凝胶治疗的为GelMA/BMSCs组,不做任何处理的为对照组。分别于术后第4、8周拍摄Micro-CT测算骨缺损面积和新生骨指标,第8周处死大鼠取缺损区颅骨样本进行H&E染色、Van Gieson染色和Goldner染色评价新生骨的质量。结果SEM观察到固化的GelMA内部呈现3D海绵状大孔凝胶网络,大孔形貌均匀,孔隙率为73.41%,孔径为(28.75±7.13)μm;EDX结果显示C和O均匀分布在水凝胶的网状大孔结构上;水凝胶压缩强度为152 kPa,GelMA/BMSCs培养第5天,镜下细胞形态铺展,从卵圆形变为梭形,CCK-8检测结果显示细胞增殖159.4%。术后第4周,Micro-CT三维重建图像显示对照组的骨缺损范围未见明显缩小,GelMA/BMSCs组骨缺损内部可见大量新骨生成;术后第8周,对照组骨缺损仍无明显变化,仅可见少量新生骨,GelMA/BMSCs组颅骨缺损基本愈合;第4周与第8周的定量分析发现,GelMA/BMSCs组大鼠颅骨缺损处新生骨量(new bone vol-ume,BV)、骨体积分数(new bone volume/total bone volume,BV/TV)、骨表面积(bone surface,BS)、骨表面积组织体积比(bone surface/total bone volume,BS/TV)均优于对照组(P<0.05)。第8周组织学染色结果显示GelMA/BMSCs组骨缺损处形成连续且致密的骨组织,而对照组仅在缺损边缘可见少量不连续新骨生成,缺损处主要为纤维结缔组织。结论光固化水凝胶的干细胞疗法具有良好生物安全性,在诱导大鼠颅骨缺损区新骨形成的同时促进骨成熟,具有潜在的临床转化前景。

芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞氧化应激损伤的保护作用

背景:间充质干细胞移植治疗脊髓损伤有一定效果,但仍存在局部氧化应激环境导致移植细胞存活率低、细胞移植效率不佳等问题。目的:探究芒果苷在氧化应激状态下对骨髓间充质干细胞的保护作用。方法:取第3代大鼠骨髓间充质干细胞,按浓度梯度0,20,40,80,160μmol/L加入芒果苷孵育2 h,然后加入含400μmol/L H_(2)O_(2)的无血清L-DMEM培养基及相应浓度的芒果苷继续培养12 h及24 h,以常规培养的大鼠骨髓间充质干细胞为正常对照组。MTT法检测各组细胞存活情况,按照试剂盒操作方法检测细胞培养液中超氧化物歧化酶、丙二醛及过氧化氢酶水平。结果与结论:与正常对照组相比,H_(2)O_(2)组细胞的存活能力显著降低(P<0.01),超氧化物歧化酶、过氧化氢酶水平显著降低(P<0.01),丙二醛水平显著升高(P<0.01);与H_(2)O_(2)组相比,芒果苷组细胞的存活能力显著升高(P<0.01),超氧化物歧化酶、过氧化氢酶水平显著升高(P<0.01),丙二醛水平显著降低(P<0.01)。芒果苷在20μmol/L浓度以上表现出浓度依赖性的抗氧化应激保护活性,且在160μmol/L以下无细胞毒性。结果表明,抗氧化剂芒果苷可增加骨髓间充质干细胞的抗氧化活性,为骨髓间充质干细胞移植提供一种新的预处理策略。

当归多糖对低氧环境中骨髓间充质干细胞成骨分化潜能的影响

目的探讨当归多糖对低氧环境中骨髓间充质干细胞(BMSC)成骨分化潜能的影响。方法将BMSC随机分为空白组、低氧组、当归多糖组。使用OriCellTM成人BMSC成骨诱导分化完全培养基对3组细胞进行培养,其中当归多糖组的培养基含有50μg/mL的当归多糖。对空白组BMSC进行常规培养(21%氧浓度),将低氧组与当归多糖组BMSC置于6%氧浓度环境中进行培养。培养14 d后,观察3组的BMSC形态学变化和钙盐沉积情况,检测3组BMSC的成骨分化相关蛋白(骨桥蛋白和骨钙素)表达水平,以及成骨分化关键转录因子RUNT相关转录因子2(RUNX2)表达情况。结果与空白组相比,低氧组BMSC的骨钙素、骨桥蛋白、RUNX2的表达水平均降低(P<0.05),高密度钙结节及钙盐沉积减少。与低氧组相比,当归多糖组BMSC骨钙素、骨桥蛋白、RUNX2的表达升高(P<0.05),高密度钙结节及钙盐沉积增多。结论低氧环境可以抑制BMSC的成骨分化潜能,而当归多糖能够有效维持低氧环境中BMSC成骨分化潜能的稳定。

TGF-β1通过组蛋白修饰酶调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的表观基因学研究

目的研究骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化过程中转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)/Smad信号通路与组蛋白甲基化酶和去甲基化酶的相关性。方法BMSCs成骨诱导培养,用TGF-β1、SB431542和TGF-β1+SB431542干预。分为4组:BMSCsCtrl-3d组(A组),BMSCs-Ctrl-ost3d组(B组),BMSCs-TGF-β1-ost3d组(C组),BMSCs-TGF-β1-SB1UMost3d组(D组)。用qRT-PCR方法检测各组甲基化酶和去甲基化酶mRNA表达量。结果(1)与A组比较,B组DM3B、KDM4A、KDM4B、KDM4C、KDM4D、KDM5A、KDM5B、KDM5C、KDM6A、KDM6B、EZH1的mRNA表达明显增强(P<0.05)。(2)与B组比较,C组KDM3B、KDM4A、KDM4C、KDM4D、KDM5C、EZH1的mRNA表达明显降低(P<0.05);KDM5B、KDM6A、KDM6B的mRNA表达明显增强(P<0.05);而KDM4B、KDM5A表达无明显改变(P>0.05)。(3)与C组比较,D组KDM3B、KDM6A、KDM6B的mRNA表达发生明显改变(P<0.05);KDM4C、KDM4D、KDM5C和EZH1的mRNA改变不显著(P>0.05),KDM4A的mRNA发生非特异性改变(P<0.05)。结论TGF-β1通过TGF-β1/Smad信号通路和TGF-β1/非Smad信号调控部分相关组蛋白甲基化转移酶/去甲化酶的表达,从而促进了BMSCs成骨分化。

黄芪影响缺氧微环境中骨髓间充质干细胞增殖活性的PI3K-AKT信号通路分析

基于PI3K/AKT信号通路研究黄芪对缺氧环境中骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的细胞活性的影响。分别以黄芪冻干粉溶液低、中、高剂量(100、200和300μg·mL^(-1))干预低氧浓度(10%)环境中成骨分化培养的BMSCs,通过高内涵实时成像系统观察BMSCs动态增殖情况及分化代数;进行无标记示踪模拟细胞运动轨迹,分析各组细胞运动速度、位移距离和路程的情况;通过激光共聚焦显微镜观察细胞线粒体膜电位,通过免疫荧光和RT-PCR检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白和基因表达水平的变化。结果显示:与对照组相比,10%低氧浓度条件下BMSCs增殖减慢、分化代数减少,运动速度减慢,位移距离和路程减少,线粒体膜电位活性降低,p-PI3K、p-AKT蛋白表达降低,PI3K和AKT基因表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.01);与低氧组相比,黄芪冻干粉溶液干预后,能显著维持缺氧环境中BMSCs增殖和分化活性,运动活力升高,线粒体膜电位活性提高,p-JAK2、p-STAT3蛋白和PI3K、AKT基因表达升高,差异有统计学意义(P<0.05或0.01)。黄芪可能通过激活PI3K/AKT信号通路维持缺氧条件下BMSCs的增殖活性。