纤维粘连蛋白修饰的多孔PLGA对大鼠骨髓间充质干细胞粘附和增殖的影响

目的探讨经纤维粘连蛋白(Fn)修饰的聚乙醇酸乳酸共聚物(PLGA)对骨髓间充质干细胞(MSCs)粘附和增殖的影响。方法用密度梯度离心法和贴壁培养法相结合获得SD大鼠的骨髓间充质干细胞,培养后以不同的浓度分别接种于PLGA上。其中,预先包被纤维粘连蛋白的PLGA作为实验组,未经纤维粘连蛋白修饰的作为对照组。分别于3、6、9h和7、14、21d收获细胞,通过细胞记数法测定细胞数,反映细胞的粘附和增殖情况。并通过电镜观察细胞在材料上的形态和贴附情况。结果纤维粘连蛋白能明显促进MSCs在PLGA上的粘附和增殖:在6、9h和7、14、21d时间点上实验组与对照组相比细胞数差异均有显著意义(P<0.05和P<0.01)。电镜证实实验组细胞贴附良好,为多角或梭形;对照组细胞数少,细胞铺展差,多为圆形。结论纤维粘连蛋白能促进MSCs在高分子材料上的粘附和增殖。

KRSR多肽/TiO_2纳米管复合涂层对骨髓间充质干细胞粘附与成骨的影响

目的:本研究在二氧化钛纳米管层表面固定了KRSR序列短链多肽,对此材料的粘附和诱导成骨的能力进行了研究。方法:于二氧化钛纳米管层上共价连接固定多肽后,对材料进行表征,并在试件上接种大鼠骨髓间充质干细胞,使用各种技术对细胞的粘附和分化进行评价。结果:固定KRSR的二氧化钛纳米管层对细胞的粘附率无明显影响,但铺展、骨向分化程度均优于对照组。结论:固定KRSR的二氧化钛纳米管层能够较好地诱导细胞骨向分化,有一定的临床应用价值。

基因胜肽胶的促骨髓间充质干细胞粘附作用

目的 :了解PLGA经基因胜肽胶修饰后的促进骨髓间充质干细胞 (MSC)粘附作用。方法 :抽取成年兔骨髓 ,以密度梯度离心法获得间充质干细胞 ,置含 10 %小牛血清RPMI 164 0培养基培养。取第 3代MSC ,分别接种于 4块6孔培养板 ,其中 8孔预先放入包被PLGA膜的盖玻片作为对照组 ,8孔放入包被经基因胜肽胶处理的PLGA膜的盖玻片为实验组 ,剩余 8孔放入不做任何处理的盖玻片为空白对照组。分别于不同时间点检测细胞数 ,分析细胞的粘附情况。并采用免疫荧光技术观察细胞形态。结果 :结果显示基因胜肽胶能明显促进MSC在高分子材料上的粘附。 6h和8h时间点与对照组相比 ,有非常显著差异 (P <0 .0 1)。免疫荧光染色照片显示 ,实验组细胞以铺展型为主 ,对照组细胞明显皱缩。结论 :基因胜肽胶能促进MSC在高分子材料上的粘附。

氧化型低密度脂蛋白提高小鼠骨髓间充质干细胞粘附力

分别采用5、10和20μg/mL的氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)处理小鼠骨髓间充质干细胞(bmMSCs)6h,通过CellTracker预染小鼠单核细胞,检测单核与bmMSCs之间的粘附率,研究ox-LDL对bmMSCs粘附的影响.利用Western blot检测粘附分子VCAM-1和ICAM-1于ox-LDL处理后在bmMSCs内的表达情况.结果显示:bmMSCs阳性表达间充质干细胞特异性标记分子CD44和CD90;ox-LDL可显著提高bmMSC与单核细胞之间的粘附(P<0.05),增强粘附分子VCAM-1和ICAM-1的表达(P<0.05),且具有剂量效应.以上结果表明,ox-LDL通过增强粘附分子VCAM-1和ICAM-1的表达进而增强bmMSCs对单核细胞的粘附,其或许可作为一种提高间充质干细胞粘附和提高干细胞移植后存活率的诱导剂.

低氧对大鼠骨髓间充质干细胞粘附能力的影响

目的探讨低氧对大鼠骨髓间充质干细胞粘附能力的影响。方法采用SD大鼠20只，年龄6～8周、雌雄不限、体质量100～120g，获取骨髓间充质干细胞。流式细胞鉴定实验细胞CD54、CD29、CD90、CIM5表达。根据细胞培养及冲涮实验时的细胞氧环境，实验分组为4组：A组（20％O2培养20％O2冲涮组）；B组（1％O2培养1％O2冲涮组）；C组（20％O2培养1％O2冲涮组）和D组（1％O2培养20％O：粘附冲涮组），比较不同组下剪切力冲涮细胞的残留率。研究不同氧浓度变化对骨髓间充质干细胞表达缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor，HIF-1α）和血管细胞粘附分子（vascularcell adhesion molecule，VCAM-1）的影响。结果骨髓间充质干细胞在1％O2环境下（B、C组）粘附能力增强，在20％O2环境下（A、D组）粘附能力减弱（P〈0．05）；HIF-1α表达水平在1％O2环境下（B、C组）增强（P〈0．05）。结论骨髓间充质干细胞随着粘附时问越长，细胞粘附能力也逐渐增强，经过低氧处理细胞的粘附力提高时间快于常氧环境。

掺钽羟基磷灰石涂层对骨髓间充质干细胞粘附和增殖的影响

目的:评价掺钽羟基磷灰石涂层对骨髓间充质干细胞粘附和增殖的影响,为新型种植体表面涂层的设计及应用奠定实验基础。方法:采用大气等离子喷涂技术在纯钛表面制备掺钽羟基磷灰石涂层复合涂层,利用扫描电镜、X线衍射仪和接触角测量仪表征其表面特性,通过细胞计数、细胞形态及MTT法考察大鼠骨髓间充质干细胞在涂层表面的粘附和增殖情况。结果:掺钽羟基磷灰石复合涂层呈多孔隙结构,具有较高的粗糙度和亲水性。钽的掺杂显著提高了羟基磷灰石与钛基体的结合强度。与钛相比,掺钽羟基磷灰石涂层表面粘附的细胞数目更多,细胞伸展良好,且具有较高的增殖活性。结论:等离子喷涂掺钽羟基磷灰石复合涂层具有良好的细胞相容性,能够促进骨髓间充质干细胞的粘附和增殖。

Ⅰ型胶原修饰微球对骨髓间充质干细胞粘附增殖及成骨行为的影响

目的研究不同浓度Ⅰ型胶原(COLⅠ)修饰的聚己内酯(Polycaprolactone,PCL)微球的结构性能及细胞学行为的差异,以指导制备出更利于骨组织再生的支架材料。方法以PCL制备微球,作为对照组;并用不同浓度(0.1%、0.5%、2.0%)COLⅠ对其进行表面修饰,作为实验组。通过场发射扫描电镜观察微球表面形貌;干湿质量法检测材料的吸水率;CCK-8法检测大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖情况;激光共聚焦显微镜评价细胞在材料表面的粘附情况;检测第3、7天细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性。结果扫描电镜观察到胶原修饰组胶原交叉排列呈网状覆盖于微球表面;胶原修饰组的吸水率高于对照组(P<0.05);CCK-8结果显示四组微球上的BMSCs细胞在第1、3、5、7天均持续增殖,0.1%COLⅠ胶原修饰组较其他组细胞增殖能力高(P<0.05);激光共聚焦显微镜观察到0.1%COLⅠ和0.5%COLⅠ组细胞在粘附6 h后的铺展形态较另外两组好;ALP活性检测显示0.1%COLⅠ胶原修饰组的ALP活性高于其他组(P<0.05)。结论本实验制备的0.1%COLⅠ修饰的微球能促进BMSCs细胞在体外的粘附增殖及早期成骨分化。

多孔TiO2修饰钛植体对骨髓间充质干细胞粘附和成骨分化的影响

目的:探讨微弧氧化制备的多孔TiO_2涂层修饰的钛植体对骨髓间充质干细胞(BMSCs)粘附和成骨分化的影响。方法:采用微弧氧化技术在纯钛表面制备涂层,运用扫描电子显微镜(SEM)和X射线衍射仪(XRD)检测涂层表面形貌、晶相。与BMSCs共培养,采用免疫荧光染色检测粘附相关蛋白整合素β1表达,活死细胞染色和MTT法检测材料细胞毒性。碱性磷酸酶(ALP)和茜素红(ARS)染色以及RT-PCR检测涂层对BMSCs成骨分化的影响。结果:采用微弧氧化技术处理后的钛板(MAO组)涂层表面是微米级多孔TiO_2,并且涂层无明显细胞毒性,另外还促进了BMSCs中整合素β1表达。ALP和ARS染色及半定量结果显示,与未处理的钛板(Ti组)相比,MAO组BMSCs的ALP和ARS染色结果更深,显著高于Ti组(P<0.05)。RT-PCR结果表明,随着时间的延长,MAO组BMSCs ALP和Osterix表达水平逐渐升高。结论:纯钛表面通过微弧氧化制备的多孔TiO_2涂层促进了BMSCs粘附和成骨分化,并且没有明显细胞毒性。

骨髓间充质干细胞来源外泌体调节大鼠肝细胞凋亡的机制

背景:骨髓间充质干细胞可释放大量外泌体,关于骨髓间充质干细胞来源外泌体对肝细胞凋亡的影响以及具体机制还没有完全阐明。目的:探索骨髓间充质干细胞来源外泌体所携带的miR-21-5p对大鼠肝脏细胞凋亡的影响及其作用机制。方法:分离大鼠骨髓间充质干细胞,将miR-21-5p NC或miR-21-5p inhibitor转染到骨髓间充质干细胞中,采用超速离心法提取外泌体,命名为(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos,(BMSCs+miR-21-5p inhibitor)-Exos,将外泌体与BRL大鼠肝细胞共培养,观察抑制miR-21-5p表达后对大鼠肝细胞凋亡的影响。通过双荧光素酶报告基因检测验证外泌体中miR-21-5p和PIK3R1之间的靶向关系;TUNEL检测外泌体中miR-21-5p直接靶向PIK3R1激活PI3K/AKT信号通路对BRL大鼠肝细胞凋亡的影响。结果与结论:①双荧光素酶报告系统证实,PI3KR1野生型载体与miR-21-5p mimics共转染293T细胞时的荧光素酶活性显著低于PI3KR1突变型载体共转染组,表明miR-21-5p可靶向结合PIK3R1;②TUNEL检测结果显示:相比于(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos组,(BMSCs+miR-21-5p inhibitor)-Exos处理后BRL肝细胞凋亡率显著增加;与(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos组相比,加入AKT抑制剂LY294002之后,细胞凋亡率显著增加;③结果提示:外泌体可能通过miR-21-5p直接靶向PIK3R1激活PI3K/AKT信号通路抑制BRL大鼠肝细胞凋亡。

麝香黄芪复方滴丸含药血清促进骨髓间充质干细胞增殖分化

背景:骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)已被广泛用于治疗神经系统疾病,但由于血脑屏障的限制以及干细胞在受损部位存活率、分化率低,导致治疗效果有限。目的:探讨麝香黄芪复方滴丸含药血清对BMSCs增殖、迁移和向星形胶质细胞分化的影响。方法:SD雄性大鼠连续灌胃麝香黄芪复方滴丸5 d后进行腹主动脉取血,分离血清备用。采用CCK-8法检测体积分数5%,10%,20%含药血清对BMSCs增殖的影响;划痕实验观察体积分数10%含药血清对BMSCs横向迁移的影响;Transwell小室培养BMSCs,用结晶紫染色和DAPI核染色观察体积分数10%含药血清对BMSCs纵向迁移的影响;用含体积分数10%含药血清的诱导液或与星形胶质细胞共培养观察BMSCs向星形胶质细胞分化情况。结果与结论:①体积分数10%和20%含药血清在第2,3天促进细胞增殖更明显,且两种体积分数无统计学差异;②在划痕30,48 h时,10%含药血清组BMSCs迁移量显著高于对照组;③10%含药血清组BMSCs穿过Transwell小室滤过膜的数量高于对照组;④体积分数10%含药血清可能促进BMSCs向星形胶质细胞方向分化,但分化作用较弱,星形胶质细胞能进一步促进含药血清诱导BMSCs向星形胶质细胞方向分化;⑤结果表明,体积分数10%含药血清能促进BMSCs体外增殖、迁移;与星形胶质细胞共培养可能促进BMSCs向星形胶质细胞方向分化。

颌骨来源骨髓间充质干细胞成骨分化的特点、优势与应用

背景:颌面部骨组织缺损修复是目前研究的热点与难点,而种子细胞的选择是关键。颌骨来源骨髓间充质干细胞是存在于颌骨内的成体间充质干细胞,在颌面部组织再生方面的应用更具优势。目的:综述颌骨来源骨髓间充质干细胞的生物学特性和成骨分化优势以及药物、体内环境、微小RNA对其成骨分化影响的相关研究进展。方法:利用计算机在PubMed和中国知网进行文献检索。中文检索词为“口腔,骨组织工程,干细胞”,英文检索词为“oral,bone tissue engineering,stem cells”。共检索下载文章405篇,根据纳入与排除标准对文章进行筛选,最终纳入70篇文献进行综述。结果与结论:颌骨来源骨髓间充质干细胞是口腔骨组织工程的优良种子细胞,与长骨骨髓间充质干细胞相比,颌骨来源骨髓间充质干细胞具有更强的增殖能力和成骨分化能力。药物、体内环境、微小RNA均可以调控颌骨来源骨髓间充质干细胞的成骨分化,但目前对颌骨来源骨髓间充质干细胞的研究尚处于初始阶段,因此需要更多论证力较强的研究来证实其在颌面部骨组织再生领域的应用更具优势。

乳腺癌细胞条件培养基对骨髓间充质干细胞生物学行为的影响

目的探讨MCF-7乳腺癌细胞条件培养基对骨髓间充质干细胞(BMSC)增殖、凋亡和迁移的影响及分子机制。方法正常环境下培养的BMSC为对照组,以MCF-7细胞条件培养基培养的BMSC为MCF-7条件培养基组,向MCF-7条件培养基组添加10 nmol/L GSK690693(Akt抑制剂)为Akt抑制剂组,向MCF-7条件培养基组添加10µmol/L Reparixin(CXCR1/2抑制剂)为CXCR1/2抑制剂组。MTT实验检测各组BMSC增殖情况,Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞凋亡实验检测各组BMSC凋亡率,Transwell细胞迁移实验检测各组BMSC的迁移能力,酶联免疫吸附试验检测两种细胞培养上清液和MCF-7细胞条件培养基中白细胞介素(IL)-8蛋白含量,Western blot检测各组BMSC的蛋白激酶B(Akt)/磷酸化Akt(p-Akt)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/磷酸化mTOR(p-mTOR)蛋白表达。结果与对照组相比,MCF-7条件培养基组BMSC的细胞增殖水平、迁移数目以及p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量均增高,细胞凋亡率降低(P<0.05);与MCF-7条件培养基组相比,CXCR1/2抑制剂组和Akt抑制剂组BMSC的细胞增殖水平、迁移数目以及p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量均降低,细胞凋亡率增加(P<0.05);MCF-7细胞条件培养基和MCF-7培养上清液中IL-8蛋白含量均较BMSC培养上清液中IL-8蛋白含量高(P<0.05)。结论MCF-7细胞条件培养基通过激活Akt-mTOR信号通路促进BMSC增殖和迁移,抑制BMSC凋亡,其中IL-8-CXCR1/2轴发挥关键作用。

补骨脂素对环磷酰胺抑制小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的恢复作用

背景:补骨脂素具有很强的抗骨质疏松活性,可能对化疗导致的骨质疏松具有恢复作用。目的:探讨补骨脂素对环磷酰胺抑制小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的恢复作用及机制。方法:分离培养C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,以MTT法检测补骨脂素对骨髓间充质干细胞活力的影响,以成骨诱导结合碱性磷酸酶染色确定补骨脂素对环磷酰胺抑制骨髓间充质干细胞成骨分化恢复作用的最佳剂量。采用RT-qPCR法检测补骨脂素干预不同时间点成骨分化标志基因Runx2、ALP、Osteocalcin、骨保护素及Wnt/β-catenin信号通路相关基因Wnt1、Wnt4、Wnt10b、β-catenin、c-MYC的mRNA表达;采用Western blot法检测补骨脂素干预不同时间点成骨特异性转录因子Runx2及Wnt/β-catenin信号通路相关基因Activeβ-catenin、DKK1、c-MYC、Cyclin D1的蛋白表达。结果与结论:(1)不同浓度补骨脂素对骨髓间充质干细胞活力没有显著影响;200μmol/L补骨脂素干预后对环磷酰胺诱导骨髓间充质干细胞成骨分化抑制的恢复作用最佳;(2)补骨脂素可以逆转环磷酰胺条件培养基导致的骨髓间充质干细胞成骨标志基因Runx2、ALP、Osteocalcin、骨保护素mRNA表达和Runx2蛋白表达的降低;(3)补骨脂素可以逆转环磷酰胺条件培养基导致的骨髓间充质干细胞Wnt/β-catenin通路相关基因Wnt4、β-catenin、c-MYC mRNA表达和Activeβ-catenin、c-MYC、Cyclin D1蛋白表达的降低以及DKK1蛋白表达的升高;(4)结果表明,环磷酰胺能抑制小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化,补骨脂素对其具有恢复作用,且200μmol/L补骨脂素干预效果最佳,而这种保护作用可能与补骨脂素激活Wnt4/β-catenin信号通路有关。

西达本胺对骨髓增生异常综合征患者骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的:探索西达本胺对骨髓增生异常综合征(MDS)患者骨髓间充质干细胞(MSC)成骨分化的作用及机制。方法:分离培养正常对照者及MDS患者的骨髓MSC,CCK-8法检测西达本胺对MSC增殖活性的影响,组蛋白去乙酰化酶(HDAC)活性荧光检测试剂盒及Western blot检测西达本胺对MSC中HDAC的影响。对MSC成骨诱导分化,在d 3进行碱性磷酸酶活性检测,d 21进行茜素红染色观察钙结节形成情况,在d 7和21分别检测成骨相关早期及后期基因的mRNA表达变化。RT-PCR及Western blot分别检测西达本胺对MSC成骨关键转录因子Runt相关转录因子2(RUNX2)mRNA及蛋白表达的影响。结果:随着西达本胺浓度的增加,MSC增殖受到抑制,但低浓度(1μmol/L)西达本胺对MSC无显著的增殖抑制作用,但可显著抑制HDAC活性。在正常对照组及MDS患者的骨髓MSC中,西达本胺(1μmol/L)可以显著增加碱性磷酸酶活性、促进钙结节形成及上调成骨基因的mRNA表达,从而恢复MDS患者MSC较正常对照组MSC减弱的成骨分化能力。机制研究结果显示,西达本胺促成骨作用可能与RUNX2表达的上调有关。结论:西达本胺可以抑制MDS-MSC的HDAC活性,上调成骨转录因子RUNX2表达,促进MDS-MSC的成骨分化。

“脾肾相赞”理论探讨不同治法对大鼠骨髓间充质干细胞成肌分化中TNF-α、JNK含量影响

目的在“脾肾相赞”理论指导下,比较不同中医治法对大鼠BMSCs成肌分化及过程中TNF-α、JNK蛋白表达的影响,分析中医治疗骨质疏松症的机制。方法将大鼠分为正常组、诱导组、补肾组、健脾组、补肾健脾组(随机数字表法),制备含药血清,选取第4代BMSCs进行实验,运用免疫荧光法分析各组成肌分化情况,酶联免疫吸附法检测TNF-α、JNK蛋白表达量。结果①BMSCs经诱导15d后,通过免疫荧光化学染色法检测MyoG荧光平均强度,结果显示:各组均显著高于正常组(P<0.01),补肾健脾组最高。②TNF-α蛋白检测:补肾组、补肾健脾组显著低于正常组(P<0.01)。③JNK蛋白检测:各组显著低于正常组(P<0.01)。结论①各治法中,补肾健脾法对大鼠BMSCs成肌分化的促进效果最佳,为通过脾肾、肌骨双方向治疗OP提供可能。②各中医治法均对大鼠BMSCs的成肌分化存在促进作用,这可能与降低TNF-α、JNK水平有关。

有氧运动预适应改善骨髓间充质干细胞治疗急性心肌梗死的效果

背景:干细胞疗法是急性心肌梗死后恢复受损心肌组织的替代治疗策略,运动预适应可诱导机体产生内源性心脏保护效应,然而两者联合应用的疗效及机制尚不清楚。目的:探讨运动预适应联合骨髓间充质干细胞对急性心肌梗死大鼠治疗效果的影响及其可能机制。方法:70只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、干细胞治疗组、运动预适应组和联合干预组。运动预适应组和联合干预组于造模前进行8周跑台有氧运动,然后通过结扎冠状动脉前降支制作急性心肌梗死模型,干细胞治疗组和联合干预组于造模后隔天尾静脉注射骨髓间充质干细胞(1×10^(9)L^(-1),1 mL),治疗4周后,利用递增负荷跑台运动实验评估运动能力,超声心动图检测心脏结构与功能;分离左心室,2,3,5-氯化三苯基四氮唑染色评估心肌梗死面积,Masson染色检测胶原容积分数,CD31免疫组织化学染色检测心肌毛细血管密度,TUNEL染色检测心肌细胞凋亡情况,免疫印迹法检测基质细胞衍生因子1、CXC趋化因子受体蛋白4、肿瘤坏死因子α、白细胞介素10和血管内皮生长因子蛋白表达量。结果与结论:①干预疗效:与假手术组比较,模型组运动能力、左心室射血分数、左心室缩短分数、CD31阳性细胞率下降(P<0.05),心肌梗死面积、胶原容积分数和心肌细胞凋亡率增加(P<0.05)。与模型组比较,干细胞治疗组运动能力无显著差异(P>0.05),运动预适应组和联合干预组运动能力提高(P<0.05);干细胞治疗组、运动预适应组、联合干预组左心室射血分数、左心室缩短分数、CD31阳性细胞率升高(P<0.05),心肌梗死面积、胶原容积分数、心肌细胞凋亡率降低(P<0.05)。与干细胞治疗组比较,联合干预组运动能力、左心室射血分数、左心室缩短分数、CD31阳性细胞率增加(P<0.05),心肌梗死面积、胶原容积分数、心肌细胞凋亡率降低(P<0.05)。②蛋白表达:与假手术组比较,模型组肿瘤坏死因子α表达升高(P<0.05),白细胞介素10和血管内皮生长因子表达下降(P<0.05)。与模型组比较,干细胞治疗组和联合干预组CXC趋化因子受体蛋白4表达升高(P<0.05),干细胞治疗组、运动预适应组和联合干预组肿瘤坏死因子α表达下降(P<0.05),白细胞介素10和血管内皮生长因子表达增加(P<0.05)。与干细胞治疗组比较,联合干预组肿瘤坏死因子α表达降低(P<0.05),CXC趋化因子受体蛋白4、白细胞介素10和血管内皮生长因子表达升高(P<0.05)。结果表明:运动预适应可增强急性心肌梗死大鼠骨髓间充质干细胞治疗的效果(抑制心脏重塑、改善心功能、延缓心力衰竭进程),其机制与促进干细胞归巢、抑制炎症反应以及促进血管新生有关。

人甲床来源的脱细胞支架搭载骨髓间充质干细胞向指甲干细胞分化的研究

目的探究人甲床来源的脱细胞支架搭载骨髓间充质干细胞向指甲干细胞分化的作用。方法收集2022年至2023年在承德医学院附属医院手足外科进行截指术的15例患者的临床废弃甲床组织,制备成脱细胞甲床支架,使用试剂盒检测参照组(未脱细胞组)与脱细胞组(脱细胞甲床支架组)中总胶原蛋白含量、残留DNA含量;将脱细胞甲床支架与人骨髓间充质干细胞(hMSCs)进行共培养14 d。比较对照组(hMSCs组)与共培养组(脱细胞甲床支架+hMSCs组)体外细胞分化能力及指甲干细胞标志物[角蛋白15,角蛋白17,G蛋白偶联受体6(Lgr6)以及β-联蛋白(β-catenin)蛋白]含量。结果脱细胞组总胶原蛋白含量为(189.62±45.45)μg/mg,低于参照组[(196.02±41.93)μg/mg],但两组相比差异无统计学意义(P>0.05);脱细胞组中DNA含量为(0.41±0.15)μg/mg,明显低于参照组[(0.87±0.13)μg/mg],差异有统计学意义(P<0.05)。培养14 d后,共培养组吸光度值为1.09±0.07,对照组吸光度值为1.10±0.5,两组相比差异无统计学意义(P>0.05)。培养14 d后,共培养组角蛋白15、角蛋白17、Lgr6、β-catenin含量分别为(39.56±5.09)、(45.83±4.01)、(5.74±0.99)、(146.79±5.34)pg/mL,均明显高于对照组[(12.10±4.28)、(10.47±3.19)、(0.93±0.67)、(67.28±7.41)pg/mL],差异均有统计学意义(P<0.05)。结论脱细胞甲床支架中的DNA有被清除、保留胶原蛋白,与hMSCs共培养后细胞增殖能力正常,且可诱导hMSCs向指甲干细胞分化,为临床上治疗甲床缺损提供新思路。

光固化水凝胶负载骨髓间充质干细胞修复大鼠颅骨缺损

目的探讨新型甲基丙烯酸酐化明胶(gelatin methacryloyl,GelMA)/骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)复合水凝胶应用于大鼠颅骨缺损区的成骨性能,为骨再生生物材料的应用提供实验依据。方法本研究经南京大学动物伦理委员会批准。通过组合光引发剂苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂[lthium phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate,LAP]、GelMA、BMSCs构建光固化复合生物水凝胶GelMA/BMSCs,扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)和能量色散X射线光谱仪(energy disper-sive X-ray spectroscopy,EDX)检测GelMA凝胶表面微观形态及元素构成,电子万能试验机测试凝胶压缩强度。将GelMA/BMSCs水凝胶在体外培养1、2、5 d后,通过CCK-8检测水凝胶包封的BMSCs细胞增殖活性,利用共聚焦显微成像技术观察其存活情况和细胞形态;在大鼠颅骨制备5 mm临界骨缺模型,经复合水凝胶治疗的为GelMA/BMSCs组,不做任何处理的为对照组。分别于术后第4、8周拍摄Micro-CT测算骨缺损面积和新生骨指标,第8周处死大鼠取缺损区颅骨样本进行H&E染色、Van Gieson染色和Goldner染色评价新生骨的质量。结果SEM观察到固化的GelMA内部呈现3D海绵状大孔凝胶网络,大孔形貌均匀,孔隙率为73.41%,孔径为(28.75±7.13)μm;EDX结果显示C和O均匀分布在水凝胶的网状大孔结构上;水凝胶压缩强度为152 kPa,GelMA/BMSCs培养第5天,镜下细胞形态铺展,从卵圆形变为梭形,CCK-8检测结果显示细胞增殖159.4%。术后第4周,Micro-CT三维重建图像显示对照组的骨缺损范围未见明显缩小,GelMA/BMSCs组骨缺损内部可见大量新骨生成;术后第8周,对照组骨缺损仍无明显变化,仅可见少量新生骨,GelMA/BMSCs组颅骨缺损基本愈合;第4周与第8周的定量分析发现,GelMA/BMSCs组大鼠颅骨缺损处新生骨量(new bone vol-ume,BV)、骨体积分数(new bone volume/total bone volume,BV/TV)、骨表面积(bone surface,BS)、骨表面积组织体积比(bone surface/total bone volume,BS/TV)均优于对照组(P<0.05)。第8周组织学染色结果显示GelMA/BMSCs组骨缺损处形成连续且致密的骨组织,而对照组仅在缺损边缘可见少量不连续新骨生成,缺损处主要为纤维结缔组织。结论光固化水凝胶的干细胞疗法具有良好生物安全性,在诱导大鼠颅骨缺损区新骨形成的同时促进骨成熟,具有潜在的临床转化前景。

TGF-β1通过组蛋白修饰酶调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的表观基因学研究

目的研究骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化过程中转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)/Smad信号通路与组蛋白甲基化酶和去甲基化酶的相关性。方法BMSCs成骨诱导培养,用TGF-β1、SB431542和TGF-β1+SB431542干预。分为4组:BMSCsCtrl-3d组(A组),BMSCs-Ctrl-ost3d组(B组),BMSCs-TGF-β1-ost3d组(C组),BMSCs-TGF-β1-SB1UMost3d组(D组)。用qRT-PCR方法检测各组甲基化酶和去甲基化酶mRNA表达量。结果(1)与A组比较,B组DM3B、KDM4A、KDM4B、KDM4C、KDM4D、KDM5A、KDM5B、KDM5C、KDM6A、KDM6B、EZH1的mRNA表达明显增强(P<0.05)。(2)与B组比较,C组KDM3B、KDM4A、KDM4C、KDM4D、KDM5C、EZH1的mRNA表达明显降低(P<0.05);KDM5B、KDM6A、KDM6B的mRNA表达明显增强(P<0.05);而KDM4B、KDM5A表达无明显改变(P>0.05)。(3)与C组比较,D组KDM3B、KDM6A、KDM6B的mRNA表达发生明显改变(P<0.05);KDM4C、KDM4D、KDM5C和EZH1的mRNA改变不显著(P>0.05),KDM4A的mRNA发生非特异性改变(P<0.05)。结论TGF-β1通过TGF-β1/Smad信号通路和TGF-β1/非Smad信号调控部分相关组蛋白甲基化转移酶/去甲化酶的表达,从而促进了BMSCs成骨分化。

黄芪影响缺氧微环境中骨髓间充质干细胞增殖活性的PI3K-AKT信号通路分析

基于PI3K/AKT信号通路研究黄芪对缺氧环境中骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的细胞活性的影响。分别以黄芪冻干粉溶液低、中、高剂量(100、200和300μg·mL^(-1))干预低氧浓度(10%)环境中成骨分化培养的BMSCs,通过高内涵实时成像系统观察BMSCs动态增殖情况及分化代数;进行无标记示踪模拟细胞运动轨迹,分析各组细胞运动速度、位移距离和路程的情况;通过激光共聚焦显微镜观察细胞线粒体膜电位,通过免疫荧光和RT-PCR检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白和基因表达水平的变化。结果显示:与对照组相比,10%低氧浓度条件下BMSCs增殖减慢、分化代数减少,运动速度减慢,位移距离和路程减少,线粒体膜电位活性降低,p-PI3K、p-AKT蛋白表达降低,PI3K和AKT基因表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.01);与低氧组相比,黄芪冻干粉溶液干预后,能显著维持缺氧环境中BMSCs增殖和分化活性,运动活力升高,线粒体膜电位活性提高,p-JAK2、p-STAT3蛋白和PI3K、AKT基因表达升高,差异有统计学意义(P<0.05或0.01)。黄芪可能通过激活PI3K/AKT信号通路维持缺氧条件下BMSCs的增殖活性。