与软骨细胞共培养和条件培养液诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的比较

背景:骨髓间充质干细胞体外转化很大程度上依赖于合适的培养条件。目的:比较与软骨细胞共培养和条件培养液2种不同的诱导方案诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的特点。方法:分离培养大鼠骨髓间充质干细胞和耳软骨细胞,采用骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养及条件培养液诱导成软骨的方法,诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。以MTT法及流式细胞仪检测细胞活性及周期,糖胺多糖、甲苯胺蓝以及免疫组化染色检测细胞生物学特性,以RT-PCR法检测诱导后的软骨细胞Ⅱ型胶原RNA表达情况。结果与结论:采用共培养方式诱导的软骨细胞,其生物学特性与采用条件培养液诱导的软骨细胞相比,前者优于后者,如分泌糖胺多糖的能力以及基质分泌量均较高。提示共培养方式诱导的软骨细胞更接近正常软骨细胞,更有利于作为组织工程软骨的种子细胞。

条件培养液体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

[目的]观察乳鼠心室肌成纤维细胞条件培养液干预体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的作用及其机制。[方法]分离培养及鉴定大鼠MSCs,对其进行分组诱导:单纯条件培养液组(TJ)、条件培养液1组(TJ-ZY)、条件培养液2组(TJ-XFK),诱导,24h后继续培养4周,免疫细胞化学法鉴定心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)的表达,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测心肌早期基因NKX2.5、GATA-4、Desmin和α-actinmRNA的表达。[结果]免疫细胞化学结果显示单纯条件培养液诱导后的MSCs不表达心肌特异性蛋白cTnT,心复康参与组则表达。实时荧光定量(RT-PCR)结果显示各组均表达心肌分化早期基因,心复康参与组诱导后的MSCs的心肌分化早期基因表达明显高于单纯条件培养液组。[结论]微环境在MSCs向心肌样细胞的分化过程中起了重要作用,心复康能够提高MSCs向心肌样细胞的分化和特化作用。

凋亡诱导因子基因敲减对骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的影响

背景:众多基础与临床试验证实:骨髓间充质干细胞移植后的低存活率严重制约着其发挥长期的治疗效果。课题组前期研究发现凋亡相关因子在骨髓间充质干细胞凋亡过程中发挥了重要作用,其中凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF)蛋白可能是其中一个关键因子。目的:将AIF敲减的骨髓间充质干细胞移植至小鼠梗死心肌中,验证低AIF表达骨髓间充质干细胞移植后的存活情况以及对进一步改善心功能的重要性。方法:首先,通过LV-AIF-shRNA慢病毒感染骨髓间充质干细胞下调AIF蛋白表达,应用流式细胞术及Western blot、RT-qPCR检测慢病毒的感染效率,CCK-8检测AIF敲减骨髓间充质干细胞在缺血缺氧条件下的细胞活力;然后,构建急性心肌梗死小鼠模型,分别将正常及AIF敲减的骨髓间充质干细胞移植至心肌梗死区域,免疫荧光检测AIF蛋白的表达,ELISA检测血清脑钠尿肽水平,心脏超声检测心功能,Masson染色观察心肌纤维化情况,RT-qPCR检测AIF敲减骨髓间充质干细胞移植后SRY基因表达反映细胞存活情况。结果与结论:①LV-AIF-shRNA慢病毒感染成功构建AIF基因敲减的骨髓间充质干细胞,感染效率为97.7%,且AIF表达有显著下降(P<0.001);②在缺血缺氧培养状态下,AIF基因敲减骨髓间充质干细胞较正常骨髓间充质干细胞的细胞活力显著增加;③与移植正常骨髓间充质干细胞相比,AIF基因敲减骨髓间充质干细胞移植后在梗死心肌中的存活数目显著升高至3.71倍(P<0.001),并且显著减少了梗死区域AIF蛋白表达、心肌纤维化程度;④与移植正常骨髓间充质干细胞相比,AIF基因敲减骨髓间充质干细胞移植后血清脑钠尿肽水平显著降低(P<0.05),左室射血分数、左室缩短分数均有显著改善(P<0.05);⑤结果表明:AIF基因敲减可通过增强骨髓间充质干细胞移植后的细胞活力、增加骨髓间充质干细胞在供体内的存活从而减少心肌纤维化,改善急性心肌梗死后心功能。

骨髓间充质干细胞条件培养液对H_2O_2诱导PC12细胞损伤的保护

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSC)条件培养液(CM)对氧化应激损伤神经细胞的保护作用。方法采用密度梯度离心联合贴壁法分离SD大鼠BMSC,采用流式细胞术,成骨、成脂诱导分化鉴定BMSC,提取骨髓间充质干细胞条件培养液。制作过氧化氢损伤PC12细胞模型,实验分为对照组、H2O2损伤组以及共培养组。MTT检测BMSC-CM对损伤PC12细胞活性的影响,流式细胞术检测各组凋亡率的变化,免疫印迹法分别检测硫氧还蛋白(Trx)、B淋巴细胞瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白、Bcl-2相关X蛋白(Bax)水平的变化。结果分离提取的BMSC高表达CD29,CD44,不表达CD31,CD45。BMSC-CM能提高H2O2损伤PCI2细胞的活力,使细胞凋亡率下降,Trx和Bcl-2的蛋白量增加,Bax蛋白水平下降。结论 BMSC-CM通过提高受损细胞内Trx、Bcl-2水平,降低Bax蛋白水平,一定程度上抑制了过氧化氢致PC12细胞氧化应激和凋亡。

急性髓系白血病细胞条件培养液对间充质干细胞的生物学影响

背景:目前,关于急性髓系白血病骨髓微环境中的骨髓间充质干细胞生物学功能及分子改变尚不完全清楚。目的:综合生物信息学和细胞实验探究急性髓系白血病患者来源骨髓间充质干细胞的生物学功能改变,并探讨急性髓系白血病细胞条件培养液在其中的作用。方法:从GEO数据集中筛选差异基因进行富集分析,并构建蛋白质互作网络和获取Hub基因。培养急性髓系白血病患者和健康供者的骨髓间充质干细胞,使用急性髓系白血病细胞条件培养液处理健康供者的骨髓间充质干细胞,对各组细胞进行成脂诱导分化、成骨诱导分化、β-半乳糖苷酶染色、细胞周期检测和Hub基因的验证。结果与结论:①从GSE84881中获取急性髓系白血病患者和健康供者的骨髓间充质干细胞基因表达数据,筛选出184个上调基因和140个下调基因。②富集的生物学功能主要包括细胞周期、脂肪细胞分化、细胞代谢过程和MYC通路。根据Degree算法筛选出上调的10个Hub基因和下调的10个Hub基因。③通过体外细胞实验发现,与健康供者的骨髓间充质干细胞相比,急性髓系白血病患者骨髓间充质干细胞表面抗原未发生改变,但其成脂分化能力增强、成骨分化能力减弱、β-半乳糖苷酶阳性细胞数增多、细胞形态改变、细胞周期停滞、LGALS3表达增加以及MYC表达降低。经急性髓系白血病细胞条件培养液培养后,健康供者骨髓间充质干细胞出现相似改变。④结果表明,急性髓系白血病患者骨髓微环境中的间充质干细胞生物学功能发生改变,这为骨髓间充质干细胞与肿瘤的交互作用提供新的见解。

骨髓间充质干细胞定向诱导条件下向脂肪细胞和成骨细胞诱导分化的关系

目的:观察骨髓间充质干细胞在定向诱导分化条件下向成骨细胞、脂肪细胞分化的特征及相互关系。方法:实验于2004-10/2005-04在泸州医学院心肌电细胞实验室完成。日本大耳兔10只,经兔髂嵴无菌抽取骨髓,采用Percoll液进行梯度离心法和体外细胞贴壁分离培养法相结合对兔骨髓间充质干细胞进行分离、纯化,将获得的原代和传代培养的骨髓间充质干细胞,分别用含成脂诱导剂和含成骨诱导剂的改良的伊格尔培养基进行实验组(向脂肪细胞和成骨细胞的定向诱导培养,对诱导培养后的细胞进行生长形态学特征观察)照组(采用不加成脂、成骨诱导剂的伊格尔培养基),两组,对进行成脂及成骨诱导后的苏丹脂肪染色、碱性磷酸酶活性检测、胞外矿化基质测定,并进行细胞成脂和成骨率比较。结果:从10只实验动物中均成功提取到骨髓间充质干细胞,其中有2只动物的骨髓间充质干细胞在原代培养时出现污染,8只获得成功进入结果分析。①在经过21d成脂诱导培养后实验组的许多细胞胞浆内均出现较多的高折光性的脂滴,苏丹脂肪染色呈橘红色,同时Kossa法也检测出少许成骨分化,其比例为70%(28/40)干细胞可转化为含有脂滴的脂肪细胞;10%(4/40)干细胞转化为含有钙结节的成骨细胞。②经过21d向成骨诱导培养后实验组出现一些细胞基质逐渐堆积、并出现基质矿盐沉积,VonKossa法测定形成的钙结节,同时苏丹脂肪染色也检测出少许向脂肪细胞分化,其比例为40%(16/40)细胞可转化为成骨细胞,20%干(8/40)骨髓间充质干细胞可转化为脂肪细胞。③对照组用苏丹脂肪染色后显示5%(2/40)骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞,用VonKossa法测定矿化结节形成比例和碱性磷酸酶活性测定结果成骨率10%(4/40)。结论:在适当诱导条件下骨髓间充质干细胞可一部分转化为脂肪细胞,另一部分转化为成骨细胞,两者分化存在一定关系:分化的脂肪细胞多,则成骨细胞少;分化的成骨细胞多,则脂肪细胞少。

心肌组织裂解液诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:干细胞具有"环境依赖性分化"特性,以心肌组织裂解液模拟心肌微环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞方向分化的研究甚少。目的:观察心肌组织裂解液对大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞方向分化的影响。方法:选用生长良好的第2代骨髓间充质干细胞,加入诱导液连续培养5周,连续观察细胞形态学特征的变化规律,采用α-Actin进行免疫细胞化学染色观察干细胞是否向肌细胞方向分化,收集诱导后的细胞行苏木精-伊红染色观察是否存在闰盘,并通过电镜观察其超微结构。结果与结论:加入诱导液后大部分细胞呈"竹节样",α-Actin免疫细胞化学染色阳性,表明间充质干细胞向肌细胞方向分化;苏木精-伊红染色可见闰盘,透射电镜下见排列整齐明暗相间的肌丝,扫描电镜下可见胞浆内有纤维状结构,说明"竹节样"细胞具有心肌细胞的典型形态结构特点。连续诱导12d多个区域出现成片的、具有自律性搏动的多核肌管结构。心肌组织裂解液可模拟心肌细胞的微环境,诱导骨髓间充质干细胞分化为具有典型形态结构特征和相应功能活动的心肌样细胞。

丹参注射液诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的:探讨丹参注射液在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(rM SC s)向神经元样细胞分化的作用。方法:采用贴壁筛选法分离rM SC s,并通过不断传代进行纯化和扩增培养。采用含丹参注射液的无血清Du lbecco改良E ag le培养基(DM EM)/F 12培养液诱导rM SC s分化为神经元样细胞,观察不同浓度丹参注射液对rM SC s诱导分化为神经元样细胞的影响。通过观察rM SC s经诱导后细胞的形态变化和采用免疫组化方法检测神经元特异性核蛋白(N euN)、神经丝蛋白(NF M)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达来鉴定神经元样细胞。结果:经丹参注射液诱导后,rM SC s胞体收缩,突起伸出,形似神经元;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞N euN、NF M表达阳性,GFAP阴性。丹参注射液在浓度为10 m l/L时的诱导作用最为显著。结论:丹参注射液可以在体外诱导rM SC s分化为神经元样细胞,其诱导分化率与丹参注射液的浓度有关。

犬骨髓间充质干细胞分离纯化和成骨诱导分化：Ficoll液密度梯度离心法体外分离的可行性

背景:目前骨髓间充质干细胞较经典的分离方法是Percoll密度梯度离心法,以去除血细胞成分,但该法操作较为复杂,分离犬骨髓时需要配制密度,且离心次数较多,对细胞损伤大。目的:拟建立可靠、高纯度的犬骨髓间充质干细胞体外分离纯化方法,并观察其在体外扩增、成骨诱导分化的能力。方法:于犬髂后上棘抽取骨髓液10mL,肝素抗凝,Hanks液稀释后,加入1.077g/mL Ficoll液3mL,2000r/min离心20min,吸取有核细胞形成白色云雾状的分层界面,用含胎牛血清的DMEM离心2遍,按12×104/cm2密度接种,于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱内培养。细胞传代后,加入含地塞米松、β-磷酸甘油钠、L-2-磷酸抗坏血酸的DMEM成骨条件培养液进行诱导。免疫细胞化学染色和免疫荧光染色检测成骨细胞特征性分泌蛋白骨钙素、骨桥蛋白的表达,以及Ⅰ型胶原的表达,并进行碱性磷酸酶染色与茜素红染色。结果与结论:1.077g/mLFicoll液密度梯度离心法分离所得的有核细胞层相对于Percoll液分层明显,可获得纯度较高的骨髓间充质干细胞,接种细胞生长良好,平均倍增时间为24h。犬骨髓间充质干细胞体外成骨诱导培养后,骨钙素、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原均呈阳性表达,碱性磷酸酶染色后细胞胞浆呈蓝绿色,茜素红染色后细胞外基质中出现散在的红色结节,可在体外定向分化为成骨细胞。

心肌组织裂解液诱导骨髓间充质干细胞向心肌组织样结构的分化

背景:体内实验提示骨髓间充质干细胞所处的微环境对其分化的方向有着重要的影响。目的:体外诱导骨髓间充质干细胞分化形成心肌组织样结构。方法:选用生长良好的第3代骨髓间充质干细胞,以心肌组织裂解液连续培养4周,倒置显微镜下连续观察细胞形态特征的变化规律,收集诱导后的组织行苏木精-伊红染色,电镜观察其超微结构。采用波形蛋白、Ⅷ因子相关抗原进行免疫组织化学染色。结果与结论:以心肌组织裂解液连续诱导培养4周。第12天部分"竹节样"细胞融合形成多核肌管样结构,第14天肌管样结构出现有节律性的收缩,搏动频率为90～110次/min;透射电镜下细胞内可见肌节样结构,部分肌细胞具自律性搏动的功能特点;苏木精-伊红染色可见大量肌束样结构。提示心肌组织裂解液可模拟心肌组织微环境,有效促使骨髓间充质干细胞分化为具有典型形态结构特征和相应功能活动的心肌细胞,同时诱导部分骨髓间充质干细胞分化为结缔组织细胞、内皮样细胞,与心肌细胞共同形成心肌组织样结构。显示在特定微环境的适宜条件下,骨髓间充质干细胞具有多向分化、发育形成多种功能上密切相关的细胞,形成组织样结构的趋势。

人类心肌匀浆上清液对骨髓间充质干细胞诱导分化及相关基因时序表达的影响

背景:大量有关动物的体内外研究表明,骨髓间充质干细胞在心肌微环境或模拟心肌微环境的作用下可分化为心肌细胞。然而,类似的人类研究报道较少,同时相关的分化机制也不甚清楚。目的:探讨人类心肌匀浆上清液对骨髓间充质干细胞诱导分化的影响及相关基因的时序表达。方法:体外分离培养人类骨髓间充质干细胞,传至第4代加入自体心肌匀浆上清液诱导骨髓间充质干细胞,持续作用2周。相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态变化,免疫荧光方法鉴定心肌特征性肌动蛋白α和肌钙蛋白的表达,应用半定量RT-PCR技术分析Nkx-2.5、GATA-4、MEF-2C、α-MHC、肌钙蛋白等相关基因在分化过程中的动态时序表达。结果与结论:经心肌匀浆上清液诱导后,骨髓间充质干细胞体积变大,立体感增强,形态近似棒状。诱导2周时肌动蛋白α及肌钙蛋白阳性细胞比例分别为25.53%和23.48%。Nkx-2.5、GATA-4、MEF-2C基因在诱导后3d表达开始增强,其中GATA-4、MEF-2C诱导后5d达高峰,以后维持在较高水平,Nkx-2.5则随诱导时间逐渐增强;α-MHC、肌钙蛋白基因诱导前无表达,于诱导第3天出现表达,以后维持在高水平。结果提示,心肌匀浆上清液对骨髓间充质干细胞具有定向诱导作用,在此过程中,伴随着Nkx-2.5、GATA-4、MEF-2C、α-MHC和肌钙蛋白基因的时序表达变化。

大鼠脊髓匀浆上清液对骨髓间充质干细胞的诱导分化作用

目的探讨大鼠脊髓匀浆上清液对骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经样细胞的作用。方法分离得到的MSCs在体外扩增、传代。用碱性成纤维生长因子(bFGF)预诱导后加入不同时间的臂丛神经损伤大鼠脊髓匀浆上清液诱导。免疫细胞化学染色检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,以鉴定分化细胞的表型特征。结果细胞诱导后具有神经元或胶质细胞样细胞的形态,相应细胞表面标志NSE或GFAP阳性,以损伤后7d脊髓匀浆上清液诱导组NSE阳性和GFAP阳性率最高(P<0.05)。结论臂丛根性撕脱伤大鼠脊髓匀浆上清液在体外能够有效地诱导骨髓MSCs分化为神经样细胞,伤后1w可以作为MSCs移植的最佳时间。

人胎儿骨髓间充质干细胞体外向类肝细胞诱导分化条件的优化

目的 :建立和优化骨髓间充质干细胞 (marrowmesen chymalstemcells,MMSCs)向类肝细胞诱导分化的条件及分化过程观察、鉴定 .方法 :采用体外分离培养的MMSCs为研究对象 ,设计不同的诱导分化条件进行体外诱导 ,观察细胞诱导分化过程中形态结构变化及细胞生物学特性 ,应用免疫组化检测肝细胞标志ALB和CK18的表达 ,建立人胎儿MMSCs向类肝细胞分化的优化条件 .结果 :未进行诱导的对照组细胞保持长梭型 ,形状因子 4 .5± 1.0 ,面积较小 ,增生较快 ,呈典型成纤维细胞的漩涡状或火焰状生长 ,培养后期可见 5～ 7个分支 ,无细胞变圆 ,双核细胞率小于 0 .1% ,逐渐老化 ,颗粒增多 .组化染色未见表达ALB和CK18.所有诱导组细胞在培养中细胞分支均减少 ,多为 1～ 3个分支 ,未用基质的细胞仍保持长梭形生长 ,给予基质的诱导细胞部分形态由长变圆 ,形状因子下降 ,给予 5 氮胞苷 (5 azacitidine,AZA)预处理可抑制细胞过度增生 ,细胞形态由长梭型逐渐变短 ,PDGF BB预处理对细胞增生无明显抑制作用 ,细胞容易出现分支 .诱导各组组化染色显示 ,第 2 1日时均有ALB和CK18阳性表达 .诱导 2组～诱导 5组的细胞转圆率、双核细胞比率及ALB ,CK18阳性细胞比例均显著高于对照组及诱导 1组 (P <0 .0 5 ) .结论 :在无血清培养条件下 ,

特定微环境条件下人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为脂肪细胞

背景：目前研究主要是利用大鼠等动物模型来探讨如伺生成脂肪细胞，对于体外分离培养的人骨髓间充质干细胞向脂肪细胞表型转化的实验报道不多。目的：拟在体外建立人骨髓间充质干细胞向脂肪细胞诱导分化的实验方法。设计、时间及地点：细胞形态学体外观察，于2006-12／2007-11在山东省青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。材料：骨髓来源于青岛大学医学院附属医院行自体干细胞移植治疗糖尿病患者的骨髓血，IBMX，地塞米松，吲哚美辛，胰岛素等诱导剂为Sigma公司产品。方法：无菌条件下抽取骨髓血，联合应用密度梯度离心法及贴壁筛选法，以单克隆形式分离培养人骨髓间充质干细胞，当细胞汇合至90％时胰蛋白酶消化传代。取第3代骨髓间充质干细胞，加入含10％胎牛血清、100U／mL青霉素、100mg／L链霉素、1μmol／L地寒米松、10mg／L胰岛素、0．5mmol／LIBMX、50μmol／L吲哚美辛的低糖DMEM培养基，作为体外特定微环境向脂肪细胞方向诱导分化，以单纯加入低糖DMEM培养基的细胞作为对照组。诱导3周后行油红O染色。主要观察指标：骨髓间充质于细胞的形态变化及细胞表面标志鉴定，脂滴形成及脂肪细胞分化率。结果：接种后第2-3天骨髓间充质干细胞开始贴壁，两端有较长突起，呈克隆样生长，形成大小不一的集落；传代后骨髓间充质干细胞呈长梭形，漩涡样生长；第3代细胞CD44呈阳性，不表达CD34,由克隆扩增出的骨髓间充质干细胞具有高度的同源性。诱导第3周油红O染色示胞核呈蓝色，脂滴呈橙红色，脂肪细胞分化率为（86．0±5．6）％，对照组未见脂滴形成。结论：含有地塞米松、IBMX及胰岛素等诱导剂的体外特定做环境对骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞具有诱导促进作用。

参附注射液预处理对5-氟胞苷体外诱导兔骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的实验研究

目的观察参附注射液预处理对5-氟胞苷体外兔骨髓间充质干细胞(MSCs)定向分化为心肌样细胞的作用。方法将18只新西兰大耳白兔,随机分为3组,即参附注射液高、低剂量组,对照组,每组6只,先给予参附注射液(5 m L和1 m L)预处理,对照组给予生理盐水3 m L,兔耳缘静脉注射1周后,经兔双侧骼后上棘抽取兔自体骨髓,并在体外对骨髓间充质干细胞进行分离、培养、扩增。各组细胞均分为两个亚组(A组和B组),每组各3例,细胞接种后24 h,进行诱导分化,参附注射液高、低剂量组中,A亚组分别在常规培养液中加入不同浓度的参附注射液(250,50μL·m L-1),同时加用5-氟胞苷(5-aza),B亚组分别在常规培养液中加用5-aza,但不加参附注射液;对照组A亚组加用5-aza,B亚组不加任何药物。诱导24 h后连续培养28d。通过细胞形态学、心肌细胞特异性蛋白(α-肌动蛋白、肌钙蛋白-T)以鉴定诱导分化的效果。结果培养28 d后细胞爬片经HE染色,光学显微镜下观察培养细胞形态与心肌细胞接近程度,由好到差顺序依次为:参附注射液高剂量A组>参附注射液高剂量B组>参附注射液低剂量A组>参附注射液低剂量B组>对照组A组>对照组B组。培养细胞肌钙蛋白T检测显示:同时加入参附注射液及5-aza诱导者骨髓间充质干细胞转化为心肌细胞的阳性强度高于单纯5-aza诱导者,且与剂量有一定的关系,剂量越高,转化为心肌细胞的阳性强度越高;α-肌动蛋白检测显示,同时加入参附注射液诱导者骨髓间充质干细胞转化为心肌细胞的阳性强度高于单纯5-aza诱导,与剂量有一定的关系,剂量越高,转化为心肌细胞的阳性强度越高,但相关性较差,可能与α-肌动蛋白非心肌所特有有关,也可能与样本量较少有关。结论参附注射液与5-氟胞苷联用时对骨髓间充质干细胞向心肌细胞定向分化产生协同促进效应,提高心肌样细胞阳性转化率。

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导条件下的成骨特性

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)在诱导条件下的成骨特性。方法:使用密度梯度法分离成年大鼠骨髓MSCs,以地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C为成骨诱导剂。结果:形态学表明,MSCs贴壁细胞呈集落生长,有成纤维细胞外观。地塞米松低剂量组诱导7d后碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)表达明显升高,阳性细胞数为(15.1±2.6)个,而对照组ALP表达较弱,阳性细胞数为(12.0±3.5)个,两组比较P<0.01。地塞米松成骨诱导剂低剂量组促进MSC成骨,在诱导7d时即出现钙化结节,而对照组未出现;地塞米松低剂量组诱导21d钙化结节为(9.0±1.7)个,而对照组为(2.0±1.8)个,两组比较P<0.01。结论:低剂量地塞米松成骨诱导剂能诱导MSC向成骨细胞分化,可以为体内骨组织工程提供种子细胞。

缺氧诱导骨髓间充质干细胞条件培养基体外修复辐射损伤小肠上皮细胞变化

背景:间充质干细胞条件培养基含有丰富的间充质干细胞旁分泌物质,被认为是干细胞移植理想的替代方案。然而,正常状态的间充质干细胞条件培养基可能由于旁分泌活性不足,常无法有效修复损伤组织。目的:观察缺氧诱导的骨髓间充质干细胞条件培养基(MSC-CM^(Hyp))对大鼠小肠隐窝上皮IEC-6细胞辐射损伤后增殖和凋亡的影响,并进一步探讨其修复小肠上皮细胞的旁分泌机制。方法:IEC-6细胞接受10 Gy X射线照射后分别加入MSC-CM^(Hyp)、正常培养的骨髓间充质干细胞条件培养基(MSC-CM^(Nor)组)及DMEM-F12培养基(DMEM-F12组)培养。结果与结论:锥虫蓝染色、流式细胞仪、Western blot检测结果显示,与DMEM-F12组相比,MSC-CM^(Hyp)组IEC-6细胞存活数和增殖率明显增加(P<0.05),凋亡率和凋亡相关因子Caspases-3/8表达明显下降(P<0.05),而MSC-CM^(Nor)组的各项指标与DMEM-F12组比较差异无显著性意义(P>0.05)。EILSA检测结果显示,与MSC-CM^(Nor)相比,MSC-CM^(Hyp)中血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、和白细胞介素10的含量明显升高(P<0.05)。结果表明,缺氧诱导的骨髓间充质干细胞条件培养基中细胞因子含量明显升高,显著促进辐射损伤IEC-6细胞的增殖,同时下调细胞凋亡信号,从而进一步促进损伤细胞的修复。

窦房结细胞裂解液对大鼠骨髓间充质干细胞的诱导分化作用

目的:观察不同浓度的窦房结细胞裂解液对骨髓间充质干细胞(MSCs)的诱导分化作用。方法:体外分离乳鼠窦房结细胞并制备窦房结细胞裂解液。密度梯度离心法分离成年SD大鼠骨髓MSCs,分别加入含1、2、4和8倍浓度的窦房结细胞裂解液培养基诱导培养,普通培养基培养作对照,观察细胞形态变化,并通过免疫荧光染色法检测MSCs心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)的表达,免疫细胞化学染色检测超极化激活的环核苷酸门控的离子通道蛋白HCN2和HCN4的表达。结果:经1、2、4和8倍浓度窦房结细胞裂解液诱导1周后的骨髓MSCs均表达cTnI和HCN2;5组间HCN2阳性细胞率比较,差异有统计学意义(F=93.113,P<0.001),且在一定浓度下随着裂解液浓度的升高而增高(P<0.05)。结论:窦房结细胞裂解液能够体外诱导骨髓MSCs分化为具有起搏功能的心肌样细胞。

胎肝滤液诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化

目的探讨胚胎肝组织滤液定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为肝细胞的诱导条件,为肝组织工程提供新的种子细胞来源。方法在体外培养体系中加入胎肝滤液,模拟体内肝脏微环境,诱导BMSCs向肝细胞定向分化,以免疫细胞化学检测肝细胞标志物;PAS检测糖原表达;靛青绿染色检测转化细胞的分化程度;测定细胞培养上清液中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)的含量以检测其功能状态。结果BMSCs经胎肝滤液诱导14d时细胞呈现多角形、卵圆形或圆形细胞的特征性改变;甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(ALB)免疫反应、PAS反应和吲哚靛青绿(ICG)摄入实验及上清液中ALT、AST、ALP等酶均在诱导的第7天开始出现,AFP和ALB免疫反应在21d时达高峰;PAS反应和ICG摄入实验随着时间的延长而增强;上清液中的各个酶在14d达高峰,之后呈下降趋势。结论胎肝滤液可诱导BMSCs形成具有肝细胞形态和功能特点的细胞。

剪切应力与心肌细胞裂解液联合诱导骨髓间充质干细胞向心肌分化的研究

目的研究剪切应力与心肌细胞裂解液联合应用对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)心肌向分化的影响。方法分离新生乳鼠的心肌细胞并制成心肌细胞裂解液,自成年大鼠骨髓中分离培养BMSCs,分为对照组(A组)、剪切应力组(B组)、心肌细胞裂解液组(C组)和剪切应力+心肌细胞裂解液组(D组)。用RT-RCR、免疫细胞化学染色和Western blotting检测诱导后BMSCs心肌细胞相关因子的表达。结果 B、C、D组均表达心肌细胞相关因子的mRNA和蛋白,D组表达明显高于B组或C组。结论剪切应力与心肌细胞裂解液联合应用可以更好地诱导BMSCs分化为心肌样细胞,为科研和临床应用提供种子细胞,有助于生物反应器的合理设计。