神经生长因子促进兔骨髓间充质干细胞软骨分化并抑制肥大分化

背景:神经生长因子是一种诱导神经生长的蛋白质,能调节间充质干细胞的增殖、分化等生物学行为。目的:探讨神经生长因子对骨髓间充质干细胞成软骨分化的促进作用。方法:分离培养兔骨髓间充质干细胞,将神经生长因子通过慢病毒转染的方式转染到骨髓间充质干细胞,以转染空载病毒为对照,CCK-8法、细胞划痕实验、茜素红染色、Western blot检测神经生长因子对骨髓间充质干细胞增殖、迁移、肥大分化、成软骨分化的影响。为进一步探讨神经生长因子对骨髓间充质干细胞成软骨分化的促进作用,转染空载病毒和转染神经生长因子的骨髓间充质干细胞分别加入白细胞介素1β诱导培养14 d,Western blot检测成软骨分化、肥大分化相关蛋白的表达。结果与结论:(1)CCK-8检测结果表明神经生长因子对骨髓间充质干细胞增殖没有明显影响;(2)与对照组相比,过表达神经生长因子后细胞迁移能力增强,成软骨相关蛋白Ⅱ型胶原、SOX9的表达上调(P<0.05),肥大相关蛋白Ⅹ型胶原、RUNX2的表达下调(P<0.05);(3)与空载病毒+白细胞介素1β组相比,过表达神经生长因子+白细胞介素1β组成软骨相关蛋白Ⅱ型胶原、SOX9的表达上调(P<0.05),肥大相关蛋白Ⅹ型胶原、RUNX2的表达下调(P<0.05);(4)结果表明,神经生长因子可促进骨髓间充质干细胞成软骨分化。

颌骨来源骨髓间充质干细胞成骨分化的特点、优势与应用

背景:颌面部骨组织缺损修复是目前研究的热点与难点,而种子细胞的选择是关键。颌骨来源骨髓间充质干细胞是存在于颌骨内的成体间充质干细胞,在颌面部组织再生方面的应用更具优势。目的:综述颌骨来源骨髓间充质干细胞的生物学特性和成骨分化优势以及药物、体内环境、微小RNA对其成骨分化影响的相关研究进展。方法:利用计算机在PubMed和中国知网进行文献检索。中文检索词为“口腔,骨组织工程,干细胞”,英文检索词为“oral,bone tissue engineering,stem cells”。共检索下载文章405篇,根据纳入与排除标准对文章进行筛选,最终纳入70篇文献进行综述。结果与结论:颌骨来源骨髓间充质干细胞是口腔骨组织工程的优良种子细胞,与长骨骨髓间充质干细胞相比,颌骨来源骨髓间充质干细胞具有更强的增殖能力和成骨分化能力。药物、体内环境、微小RNA均可以调控颌骨来源骨髓间充质干细胞的成骨分化,但目前对颌骨来源骨髓间充质干细胞的研究尚处于初始阶段,因此需要更多论证力较强的研究来证实其在颌面部骨组织再生领域的应用更具优势。

骨髓间充质干细胞对骨关节炎大鼠软骨损伤的影响及机制研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)对骨关节炎(OA)大鼠软骨损伤的影响及其机制。方法大鼠膝关节腔内注射木瓜蛋白酶构建OA模型,将构建成功的20只OA大鼠按照随机数字表法分为OA组和治疗组,每组10只;同时将膝关节腔内注射等量生理盐水的10只大鼠作为对照组。HE染色观察大鼠膝关节软骨损伤,Mankin's评分法评估膝关节软骨病理损伤程度,缚线法检测大鼠膝关节肿胀度,医用测角尺检测大鼠膝关节被动活动度,流式细胞仪检测大鼠脾脏辅助性T细胞17(Th17)和调节性T细胞(Treg)比例,生化试剂盒检测大鼠血清中白细胞介素-17(IL-17)含量和软骨组织中丙二醛(MDA)、Fe2+含量,蛋白质印迹法检测软骨组织中乳酸脱氢酶A(LDHA)、己糖激酶2(HK2)、M2型丙酮酸激酶(PKM2)、长链脂酰辅酶A合成酶4(ACSL4)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)蛋白表达水平。结果与对照组比较,OA组和治疗组大鼠膝关节软骨组织Mankin's评分、膝关节肿胀度、Th17细胞比例、Th17/Treg比值、血清IL-17含量和软骨组织中Fe2+含量、MDA含量及LDHA、HK2、PKM2、ACSL4蛋白表达水平均明显升高(P<0.05);膝关节被动活动度、Treg细胞比例和软骨组织中GPX4蛋白表达水平明显降低(P<0.05);与OA组比较,治疗组大鼠膝关节软骨组织Mankin's评分、膝关节肿胀度、Th17细胞比例、Th17/Treg比值、血清IL-17含量和软骨组织中Fe2+含量、MDA含量及LDHA、HK2、PKM2、ACSL4蛋白表达水平均明显降低(P<0.05);膝关节被动活动度、Treg细胞比例和软骨组织中GPX4蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)。结论BMSCs治疗可明显改善OA大鼠软骨损伤,其作用机制可能与改善Th17/Treg细胞平衡和软骨糖酵解、铁死亡有关。

骨粘连蛋白促骨髓来源间充质干细胞成骨分化在青少年特发性脊柱侧凸中的作用

目的探究骨骼肌分泌的骨粘连蛋白(Osteonectin)促骨髓来源间充质干细胞(BMSC)成骨分化在青少年特发性脊柱侧凸(AIS)中的作用。方法纳入30例AIS患者,根据X射线片测量的Cobb角,将其分为轻度AIS组和重度AIS组。比较2组患者腰椎和骨骼肌骨密度(BMD)。收集2组患者BMSC,通过流式细胞术检测CD73和CD90蛋白表达,qRT-PCR检测Runx2、Osterix和Osteocalcin mRNAs表达水平,ELISA检测碱性磷酸酶(ALP)活性。收集2组患者骨骼肌,检测Osteonectin mRNA和蛋白表达水平。ELISA检测2组患者血清中Osteonectin水平。体外培养BMSC,分为BMSC组(无特殊处理)和BMSC+Osteonectin组(添加Osteonectin),检测Runx2、Osterix和Osteocalcin mRNAs表达水平及ALP活性。结果与轻度AIS组比较,重度AIS组患者腰椎和骨骼肌BMD降低(P<0.05),BMSC中Runx2、Osterix和Osteocalcin mRNAs表达水平降低(P<0.05),ALP活性降低(P<0.05);骨骼肌中Osteonectin mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05);血清中Osteonectin水平降低(P<0.05)。与BMSC组比较,BMSC+Osteonectin组细胞Runx2、Osterix和Osteocalcin mRNAs表达水平升高(P<0.05),ALP活性升高(P<0.05)。结论AIS患者骨骼肌分泌Osteonectin减少,BMSC的成骨分化能力降低。外源性补充Osteonectin可改善BMSC的成骨分化能力,可能有助于AIS病情的恢复。

Osteonectin促进骨髓来源间充质干细胞成骨分化的机制及其与青少年特发性脊柱侧凸的相关性研究

目的 探究Osteonectin在促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的分子机制,以及Osteonectin在青少年特发性脊柱侧凸(AIS)中的作用。方法 将2020年5月—2022年5月就诊的20例AIS及健康体检20例分别作为AIS组和健康组。使用qRT-PCR技术测定2组BMSCs中Osteonectin、BMP2以及Wnt/β-catenin信号通路相关基因(Tcf7、Lef1)和成骨分化相关基因(Runx2、Osteocalcin)的表达水平。通过X线检测AIS患者的Cobb角度,并分析上述基因表达水平与Cobb角度的相关性。在BMSCs中,加入Osteonectin和BMP2抑制剂Noggin,并分为对照组、Osteonectin组和Osteonectin+Noggin组。通过qRT-PCR检测BMSCs中BMP2、Tcf7、Lef1、Runx2和Osteocalcin mRNA表达水平。采用ChIP-qPCR检测β-catenin在Runx2和Osteocalcin基因转录起始位(TSS)的富集水平。结果 与健康组比较,AIS组BMSCs中Osteonectin、BMP2、Tcf7、Lef1、Runx2和Osteocalcin mRNA表达水平均降低(P<0.05);Osteonectin、BMP2、Tcf7、Lef1、Runx2和Osteocalcin mRNA表达水平与AIS患者Cobb角度呈负相关(r=-0.466 3、-0.369 1、-0.272 7、-0.543 4、-0.606 5、-0.343 3,P<0.05,P<0.01)。与对照组比较,Osteonectin组BMSCs中BMP2、Tcf7、Lef1、Runx2和Osteocalcin mRNA表达水平升高,且β-catenin在Runx2和Osteocalcin mRNA TSS富集水平增加(P<0.05)。相比Osteonectin组,Osteonectin+Noggin组BMSCs中Tcf7、Lef1、Runx2和Osteocalcin mRNA表达水平降低,β-catenin在Runx2和Osteocalcin mRNA TSS富集水平降低(P<0.05)。结论 在AIS患者中,BMSCs中Osteonectin、BMP2-Wnt/β-catenin的表达以及成骨分化水平与AIS疾病的发展呈负相关。Osteonectin通过激活BMP2-Wnt/β-catenin信号通路,促使β-catenin转录激活成骨分化相关基因,从而促进BMSCs的成骨分化。

补肾痹通方联合骨髓间充质干细胞对损伤软骨细胞的保护机制及SOX9、MMP-13表达的影响

目的:探讨补肾痹通方(BSBT)联合骨髓间充质干细胞(BMSCs)对白介素(IL)-1β诱导的损伤软骨细胞的保护机制及性别决定区Y框蛋白9(SOX9)、基质金属蛋白酶13(MMP-13)表达的影响。方法:使用10 ng/ml的IL-1β建立损伤软骨细胞模型,实验分为对照组、模型组(IL-1β)、中药组(IL-1β+BSBT)、干细胞组(IL-1β+BMSCs)和联合组(IL-1β+BSBT+BMSCs);CCK-8法检测各组软骨细胞增殖情况;RT-qPCR法和Western blot法分别检测软骨细胞内SOX9、MMP-13、Ⅱ型胶原α1重组蛋白(COL2A1)、IL-10的基因和蛋白表达;ELISA检测各组细胞培养上清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的水平。结果:与模型组比较,各组软骨细胞活性显著增强(P<0.01),软骨细胞中的SOX9、COL2A1、IL-10的基因和蛋白水平显著升高(P<0.01),MMP-13的基因和蛋白水平明显降低(P<0.01),软骨细胞培养上清中TNF-α、IL-6的含量显著降低(P<0.01),IGF-1、bFGF的水平升高(P<0.01),其中联合组变化最明显(P<0.05)。结论:BSBT联合BMSCs可有效保护损伤软骨细胞,其机制可能是通过上调SOX9,下调MMP-13,抑制炎症,改善软骨细胞微环境,促进关节软骨的修复与再生。

生长分化因子5诱导兔骨髓间充质干细胞的软骨分化

背景:生长分化因子5属于转化生长因子超家族成员之一,也是关节发育的最早标志之一,对软骨修复具有重要作用。目的:探讨生长分化因子5诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化的作用机制。方法:分离培养兔骨髓间充质干细胞,CCK-8法检测不同质量浓度生长分化因子5对骨髓间充质干细胞增殖活性的影响,RT-PCR检测不同质量浓度生长分化因子5诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化相关基因的表达;为进一步探讨生长分化因子5诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化的作用机制,加入Wnt/β-catenin信号通路抑制剂XAV-939和激活剂Laduviglusib诱导培养14 d,RT-PCR和Western blot检测软骨相关基因和Wnt/β-catenin信号通路中相关蛋白的表达。结果与结论:①CCK-8结果表明生长分化因子5对骨髓间充质干细胞增殖没有明显影响;②生长分化因子5促进了软骨相关基因Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、Sox9的表达,其中以50 ng/mL组软骨相关基因上调明显;③加入Wnt/β-catenin信号通路激活剂Laduviglusib之后,Sox9、β-catenin和Ⅱ型胶原表达上调(P<0.05),加入Wnt/β-catenin信号通路抑制剂XAV939之后,Sox9、β-catenin和Ⅱ型胶原表达下调(P<0.05);④综上,生长分化因子5诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。

Ghrelin通过ERK1/2信号通路促进大鼠骨髓间充质干细胞向软骨分化机制研究

目的研究Ghrelin通过ERK1/2信号通路促进大鼠骨髓间充质干细胞向软骨分化的机制。方法骨髓间充质干细胞(BMSCs)在适当的刺激下可分化为软骨母细胞、脂肪细胞或软骨细胞。生长激素释放肽(Ghrelin)是生长激素促分泌肽受体的内源性配体,能够刺激生长激素的分泌。为研究能够触发BMSCs向软骨高效分化机制,寻找治疗异位骨化的新型治疗方案。本文采用600 ng/mLGhrelin培养r BMSCs,通过免疫蛋白印记法检测磷酸化状态ERK1/2、p38、JNK以及Ⅱ型胶原的变化。结果使用600 ng/mL Ghrelin作用于BMSCs 24 h,Ⅱ型胶原的表达达到最高水平;Ghrelin主要通过ERK1/2信号通路诱导r BMSCs向软骨分化。结论本研究可为揭示ERK1/2信号通路在Ghrelin诱导的r BMSCs生长中的潜力提供医学参考意义。

胰岛素样生长因子1对骨髓间充质干细胞软骨分化及基质金属蛋白酶表达的影响

背景:以往促进骨髓间充质干细胞软骨分化的研究,多将胰岛素样生长因子1作为辅助因子与其他细胞因子联合应用,而胰岛素样生长因子1单独应用能否促进骨髓间充质干细胞分泌软骨特异性胶原仍存在争议,其对骨髓间充质干细胞软骨分化及软骨胶原纤维稳定性的影响尚不清楚。目的:观察胰岛素样生长因子1对骨髓间充质干细胞软骨分化以及基质金属蛋白酶表达的影响。方法:构建含有胰岛素样生长因子1基因完整编码区的表达载体,稳定转染至大鼠骨髓间充质干细胞,设为胰岛素样生长因子1稳定转染组,同时设未转染组作对照。结果与结论:MTT检测结果显示,实验成功筛选得到胰岛素样生长因子1稳定过表达的骨髓间充质干细胞,转染后4d,细胞增殖能力显著增强(P<0.05)。RT-PCR,Westernblot法及免疫细胞化学检测结果显示,与未转染组相比,胰岛素样生长因子1稳定转染组细胞胰岛素样生长因子1,Ⅱ型胶原mRNA和蛋白的表达水平均显著升高(P<0.01),基质金属蛋白酶1,2,3mRNA表达显著降低(P<0.01)。结果证实,单独应用胰岛素样生长因子1能够有效促进骨髓间充质干细胞的增殖以及软骨分化,并维持软骨胶原纤维的稳定性。

胰岛素样生长因子1基因转染骨髓间充质干细胞对骨折愈合及血管形成的作用研究

目的探究胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF1)基因转染骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)对大鼠骨折愈合及血管形成的影响。方法建立大鼠股骨骨折模型,采用BMSC、含IGF1基因慢病毒转染的BMSC分别处理模型大鼠。X线影像系统、micro-CT扫描仪观察骨折愈合情况,HE染色观察股骨组织病理学变化,免疫荧光染色观察血管内皮标记物CD31表达,蛋白质印迹检测骨形态发生蛋白2(BMP-2)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OCN)与血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素-1(Ang-1)表达。结果与模型组比较,BMSC组与IGF1-BMSC组大鼠的骨折线模糊,有愈合性骨痂形成,BMD、BV/TV升高(P<0.05),Tb.N增加(P<0.05),Tb.Sp降低(P<0.05),CD31荧光表达增强,BMP-2、OPN、OCN及VEGF、Ang-1蛋白相对表达量均上调(P<0.05)。与BMSC组比较,IGF1-BMSC组大鼠骨折线几乎消失,愈合效果更佳,BMD、BV/TV升高(P<0.05),Tb.N增加(P<0.05),Tb.Sp降低(P<0.05),CD31荧光表达更强,BMP-2、OPN、OCN及VEGF、Ang-1蛋白相对表达量也进一步上调(P<0.05)。结论IGF1基因转染BMSC能够有效促进大鼠股骨骨折愈合,加速血管形成,且效果优于BMSC单独作用。

体外诱导骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞:转化生长因子β1、胰岛素样生长因子1的协同刺激作用

背景:目前诱导骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞主要以使用诱导因子的方法为主。目的:分析转化生长因子β1、胰岛素样生长因子1体外诱导骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞的协同刺激作用,以求获得最佳的诱导效应。方法:取SD大鼠骨髓,采用全骨髓培养+贴壁纯化法分离培养骨髓间充质干细胞。按添加诱导因子不同分4组:转化生长因子β1+胰岛素样生长因子1组、转化生长因子β1组、胰岛素样生长因子1组、对照组。在基础诱导液基础上添加相应诱导因子诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。诱导21 d后行Ⅱ型胶原免疫荧光染色,诱导7,14,21 d后行免疫细胞化学染色检测Ⅱ型胶原表达。结果与结论:(1)诱导21 d后,转化生长因子β1+胰岛素样生长因子1组、转化生长因子β1组免疫荧光显示胞浆呈棕红色,高度表达Ⅱ型胶原,而胰岛素样生长因子1组和对照组结果呈阴性;(2)免疫细胞化学染色显示,转化生长因子β1+胰岛素样生长因子1组在各个时间段的Ⅱ型胶原表达量明显高于转化生长因子β1组(P<0.01),且随着时间的延长,表达量逐渐增加。胰岛素样生长因子1组和对照组免疫细胞化学染色呈阴性;(3)结果表明,体外诱导骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞时,转化生长因子β1与胰岛素样生长因子1具有协同刺激作用,二者联合使用可获得较佳的诱导效应。

骨髓间充质干细胞来源外泌体保护软骨细胞延缓骨关节炎的发生发展

背景:骨关节炎是最常见的关节退行性疾病,目前骨髓间充质干细胞已应用于骨关节炎治疗中,但与骨髓间充质干细胞相比,骨髓间充质干细胞来源外泌体移植具有更多优势,例如非免疫原性、非致瘤性以及储存和运输方便。目的:探索骨髓间充质干细胞来源外泌体对骨关节炎的保护作用。方法:①提取SD大鼠骨髓间充质干细胞并通过细胞形态及流式细胞学进行鉴定,利用超速离心法提取细胞上清液中的外泌体并通过透射电镜、粒径及western blot进行鉴定;②提取原代乳鼠肋软骨细胞,与荧光标记外泌体共培养12 h,观察软骨细胞吞噬情况。体外通过白细胞介素1β诱导软骨细胞损伤,加入含有50μg外泌体的PBS溶液100μL干预24 h,采用免疫荧光检测基质金属蛋白酶13及Ⅱ型胶原纤维α1蛋白表达,评估外泌体对于损伤软骨细胞的保护作用;③体内通过碘乙酸诱导大鼠骨关节炎模型,关节腔内注射外泌体,通过苏木精-伊红染色及番红-固绿染色观察骨关节炎关节结构变化,通过免疫组织化学染色检测基质金属蛋白酶13及Ⅱ型胶原纤维α1蛋白表达,评估外泌体对体内软骨损伤的保护作用。结果与结论:①原代骨髓间充质干细胞呈现典型的梭形,放射状排列,表达CD73和CD105而几乎不表达CD45、CD34和CD3;透射电镜显示外泌体呈现典型茶托样形态,粒径小于100 nm,ALIX及HRS蛋白呈阳性表达;②软骨细胞内可观察到典型的红染颗粒证实外泌体可以被软骨细胞摄取,同时外泌体可以促进软骨细胞Ⅱ型胶原纤维α1蛋白表达及抑制基质金属蛋白酶13表达,证实外泌体可以减弱白细胞介素1β对软骨细胞的损伤作用;③外泌体可以促进损伤关节软骨形态恢复及Ⅱ型胶原纤维α1表达,抑制基质金属蛋白酶13表达,同样证实外泌体可以缓解碘乙酸对骨关节软骨的破坏作用;④上述结果表明,骨髓间充质干细胞外泌体通过软骨保护机制延缓骨关节炎的发生与发展。

人骨髓间充质干细胞的扩增培养及向成软骨样细胞的定向诱导分化

从人骨髓中分离和培养间充质干细胞(MSCs),在原代和传代培养中其形态学上均为贴壁、纤维状的细胞,随着代次的增加细胞形态更加趋于一致.流式细胞仪鉴定CD45、CD34、CD117、HLA-DR阴性,CD29、CD166阳性,并随着培养代次的增加,阳性比率和阴性比率出现相应的上升和降低,说明细胞中MSCs纯度增加.第三代细胞大约有80%处于G0/G1期,S+G2+M期约20%,说明MSCs有强大的增殖潜能.在传代培养中的最适接种密度为5000个/cm2左右.MSCs在体外经历了滞缓期、对数生长期、平稳期3个时期,传代培养的MSCs生长速度比原代的MSCs明显快很多.采用程序降温法对MSCs进行冻存,60～90d后对冻存的MSCs进行复苏,发现MSCs仍可在体外良好生长4～6代,特定的MSCs样本可以扩增10代,说明经过冻存的细胞仍具有良好的增殖能力.对4例标本的前三代MSCs在体外利用TGF-β1和维生素C诱导两周后,用RT-PCR证明MSCs表达软骨特异性的II型前胶原的mRNA,说明培养的细胞具有向成软骨样细胞分化的潜能,由此进一步证实其为MSCs.

巢式PCR扩增性别决定基因序列检测兔骨髓间充质干细胞移植治疗关节软骨缺损的修复组织来源

目的:明确骨髓间充质干细胞移植到关节软骨损伤处后,该处修复组织的细胞来源,以了解组织修复的过程。方法:实验于2006-01/2007-01在浙江省医学科学院生物工程所完成。①实验材料:3月龄新西兰大白兔,清洁级,体质量约2kg,由浙江省实验动物中心提供。②实验方法:利用兔性别决定基因序列设计两对PCR引物。取雄性新西兰大白兔进行骨髓间充质干细胞的分离培养与扩增。取雌性新西兰大白兔,暴露其膝关节软骨,用电钻钻孔造成膝关节软骨内侧直径4.5mm深3.5mm的全层关节软骨缺损,达软骨下骨。一侧植入骨髓间充质干细胞/胶原海绵,另一侧仅植入胶原海绵。③实验评估:于术后1,2,3,4,5个月取兔关节软骨缺损修复处组织提取总DNA,进行PCR扩增,鉴定移植物中是否存在性别决定基因,以明确细胞来源。结果:移植后1,2,3,4,5个月移植雄兔骨髓间充质干细胞及胶原海绵的关节修复处组织提取的DNA,用设计的引物通过PCR扩增出一条约200bp大小的条带,大小与阳性对照一致;而另一侧仅移植胶原海绵的关节软骨修复处组织提取的DNA,用设计的引物通过PCR扩增后未发现有条带。PCR扩增阳性样本测序分析显示,每个样本碱基序列一致,与GenBank上性别决定区Y基因组gb|AY785433.1|比较,扩增的样本序列与标准序列完全一致,序列同源性达100%。结论:雌兔关节骨髓间充质干细胞/胶原海绵复合物移植处的新生组织中含有雄性组织,提示新生软骨中有移植的雄性骨髓间充质干细胞分化来的软骨细胞。

转化生长因子β及周期性拉伸应变条件下骨髓间充质干细胞向软骨样细胞的分化

背景:研究表明转化生长因子β对骨髓间充质干细胞的软骨方向分化具有显著的诱导作用。周期性拉伸应变可以模拟软骨细胞在体内的力学环境,对细胞的增殖和分化起着重要的调节作用。目的:探讨转化生长因子β及周期性拉伸应变在诱导骨髓间充质干细胞向软骨样细胞分化过程中是否具有协同作用。方法:取2月龄新西兰大白兔10只,骨穿针穿入股骨髓腔内,抽取骨髓3.0-4.0 mL并分离培养骨髓间充质干细胞,传至3代后随机分为4组,分别为空白组、转化生长因子β组、周期性拉伸应变组以及周期性拉伸应变+转化生长因子β组,作用1,3,6 d后取出相应细胞,番红O染色观察大体形态,阿尔新蓝染色检测糖胺聚糖水平,ELISA检测上清液基质金属蛋白酶13及基质金属蛋白酶组织抑制剂1水平,RT-PCR检测Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶13及基质金属蛋白酶组织抑制剂1 mRNA相对表达量。结果与结论:番红O染色可见细胞呈长梭形或不规则三角形样改变,各实验组较空白组细胞数量及基质分泌增多。作用第3天时转化生长因子β组、周期性拉伸应变+转化生长因子β组上清液糖胺聚糖水平较空白组均升高(P<0.05),周期性拉伸应变+转化生长因子β组Ⅱ型胶原mRNA相对表达量较空白组增高(P<0.05)。结果提示转化生长因子β及周期性拉伸应变均可诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化,二者具有明显的协同作用。

转化生长因子β3诱导藻酸钠微球内骨髓间充质干细胞向软骨细胞定向分化过程中胰岛素样生长因子Ⅰ的协同效应

背景:近年来利用藻酸盐微球包被骨髓间充质干细胞进行软骨细胞定向诱导逐渐开展。目的:采用体外藻酸钠微球三维立体培养骨髓间充质干细胞,观察转化生长因子β3在诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化过程中胰岛素样生长因子I的作用。设计、时间及地点:细胞组织工程体外实验,于2007-03/10在武汉大学口腔医学院口腔生物医学工程教育部重点实验室完成。材料:SPF级1月龄雄性Wistar大鼠7只用于制备骨髓间充质干细胞。藻酸钠盐、胰岛素样生长因子I,转化生长因子β3均为Sigma公司产品。方法:第5代骨髓间充质干细胞以3×109L-1密度重悬于1.2%藻酸钠盐溶液中,用22号针头将该溶液缓慢滴加在100mmol/L氯化钙溶液中使其聚合形成凝胶,10min后洗涤微球2次,即为包被骨髓间充质干细胞的藻酸盐微球。联合组加入含100μg/L胰岛素样生长因子I、10μg/L转化生长因子β3的软骨诱导培养基,诱导3周。同时设立胰岛素样生长因子I组、转化生长因子β3组、空白对照组。主要观察指标:甲苯胺蓝染色检测细胞外基质的形成,RT-PCR法及免疫组织化学法检测Ⅱ型胶原和Aggrecan的表达,Western blot检测Sox9蛋白表达及其与PCR产物的相关性。结果:包被于藻酸盐微球的骨髓间充质干细胞经胰岛素样生长因子I、转化生长因子β3联合诱导3周,细胞周围有大量均质蓝染物质。联合组II型胶原和Aggrecan mRNA及蛋白表达水平最高,转化生长因子β3组表达居中,胰岛素样生长因子I组表达较弱,空白对照组几乎无表达(F=10.52,P<0.01)。各组Sox9蛋白表达水平与上述指标类似(F=7.95,P<0.05),Sox9与II型胶原、aggrecan的相关系数分别为0.95和0.91。结论:体外定向诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的过程中,胰岛素样生长因子I可能通过促进Sox-9的表达来起到与转化生长因子β3的协同效应。

微小RNA可在人骨髓间充质干细胞分化来源的心肌样细胞中表达

目的研究人骨髓间充质干细胞(hMSCs)分化来源的心肌样细胞中代表性微小RNA(miRNAs)的表达。方法利用FITC-偶联的CD29、CD34和CD11b抗体在流式细胞仪上检测分离的hMSCs的抗原表型。分别用5-氮胞苷(5-aza)和乳鼠心肌非接触共培养法诱导传至3代的hMSCs分化为心肌样细胞。用免疫化学法检测hMSCs分化来源的心肌样细胞中心肌特异的α-肌节辅肌动蛋白和心肌肌钙蛋白(cTnI)的表达。利用逆转录PCR和DNA测序鉴定5个代表性的心脏特异的初级微小RNA(pri-miRNAs)的表达。结果hMSC标志分子CD29表达率为98.87%,而造血细胞标志分子CD34和CD11b的表达率只是5%和0.4%。免疫化学分析显示,分别经5-aza和乳鼠心肌非接触共培养诱导的hMSC均可表达α-肌节辅肌动蛋白和cTnI,而在未分化的hMSCs中无表达。miRNA-143,-181可在5-aza诱导的hMSCs中表达,miRNA-143,-181,-206,-208可在乳鼠心肌非接触共培养的hMSCs中表达,而两种诱导方法均未能诱导miRNA-1-2在hMSCs中表达。结论利用5-aza和乳鼠心肌非接触共培养法诱导hMSCs分化的心肌样细胞中可以表达不同的心脏特异的pri-miRNAs。

大鼠骨髓间充质干细胞向软骨、脂肪和神经元样细胞分化的研究

目的 :探讨体外大鼠骨髓间充质干细胞 (r MSCs)多向分化潜能。方法 :从大鼠骨髓中获得间充质干细胞 ,体外培养传代。通过地塞米松、 TGF-β1和维生素 C诱导 r MSCs向软骨细胞分化 ,甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学检测 型胶原进行鉴定。通过地塞米松和胰岛素诱导 r MSCs向脂肪细胞分化 ,采用苏丹 染色鉴定。在含IBMX、 GDNF和 IL - 1β的培养基中诱导 r MSCs向神经元样细胞分化 ,免疫细胞化学方法检测神经细胞特异标志NSE和 MAP- 2 a,b。结果 :r MSCs被诱导 7d后 ,分化成软骨细胞 ,甲苯胺蓝异染阳性、 型胶原阳性。被诱导10 d后 ,分化成脂肪细胞 ,苏丹 染色阳性。被诱导 7d和 15 d后 ,分化成神经元样细胞 ,表达 NSE和 MAP- 2 a,b,15 d后 NSE阳性率是 (2 0 .0 6 0± 0 .790 ) % ,MAP- 2 a,b阳性率是 (17.36 4± 5 .738) %。结论 :体外 r MSCs被诱导分化成软骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞 ,证明其具有多向分化潜能 ,是组织工程研究中最有前途的种子细胞之一。

不同来源骨髓间充质干细胞的体内成软骨

背景:骨髓间充质干细胞经体外诱导后可修复软骨缺损,但目前采用的种子细胞多来源于自体或同种异体。目的:观察同种异体及异种来源的骨髓间充质干细胞诱导成软骨后修复喉软骨缺损的效果。方法:分别取人胚胎骨髓间充质干细胞和刚出生兔骨髓间充质干细胞的第3代细胞种植于聚乳酸-羟基乙酸共聚物生物支架上,并加入转化生长因子β1和软骨形态发生蛋白诱导成软骨细胞。将两种细胞体系植入新西兰白兔体内,并于植入后4,8周取材行大体、组织学观察。结果与结论:植入后4,8周人胚胎骨髓间充质干细胞和兔骨髓间充质干细胞均有新生组织填充,经组织学观察大部分为软骨细胞,分泌软骨细胞基质糖胺聚糖和Ⅱ型胶原,且两种细胞支架复合物所生成的软骨细胞数大致相同,并无明显的免疫排斥反应。提示异种来源的骨髓间充质干细胞复合聚乳酸-羟基乙酸共聚物在转化生长因子β1和软骨形态发生蛋白联合诱导下所得的组织工程化软骨,与同种来源的骨髓间充质干细胞所获得的组织工程化软骨修复喉软骨缺损具有可比性。

同种异体和异种来源骨髓间充质干细胞诱导成软骨修复喉软骨缺损

背景:由于软骨细胞缺乏再生能力,选择合适的种子细胞是修复软骨缺损需首要解决的问题。目的:探讨同种异体和异种来源骨髓间充质干细胞成软骨诱导后修复喉软骨缺损的效果。方法:取第3代人骨髓间充质干细胞和兔骨髓间充质干细胞加入软骨定向诱导液(含转化生长因子β1和骨形态发生蛋白)进行成软骨诱导,并滴加于聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架上。取30只新西兰大白兔随机分为3组:空白对照组、人骨髓间充质干细胞修复组和兔骨髓间充质干细胞修复组,制备喉软骨缺损动物模型,分别植入生理盐水浸湿的聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架,人骨髓间充质干细胞复合聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架,兔骨髓间充质干细胞复合聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架。术后4周和8周,免疫组化法检测喉部组织Ⅱ型胶原的表达。结果与结论:各组动物均呼吸通畅、正常,未出现喘鸣等,进食和活动情况良好,未出现化脓或者感染现象。术后4周和8周,人骨髓间充质干细胞修复组和兔骨髓间充质干细胞修复组的Ⅱ型胶原阳性率均显著高于空白对照组(P<0.05)。人骨髓间充质干细胞修复组和兔骨髓间充质干细胞修复组间比较,差异无显著性意义(P>0.05)。结果表明同种异体和异种来源的骨髓间充质干细胞成软骨诱导后进行兔喉软骨缺损修复均可以获得良好的效果,二者修复效果无显著差异。