促血小板生成素对骨髓c-Kit^+Lin^-细胞体外扩增的影响

目的探讨在无血清条件下,血小板生成素(TPO)对c-Kit+Lin-细胞增殖的影响。方法经免疫磁珠分离小鼠骨髓c-Kit+Lin-细胞,研究在干细胞因子(SCF)、FLt-3配基(FL)和白血病抑制因子(LIF)组合中添加不同浓度的TPO,7 d后检测细胞总数,c-Kit+Lin-细胞扩增倍数,并采用Annexin-V检测各组细胞凋亡率。结果各组均能显著扩增c-Kit+Lin-细胞,扩增倍数为4~7倍不等。当SCF+FL+LIF中加入50μg/L TPO时,c-Kit+Lin-细胞及细胞总数扩增为7.07倍和40.19倍,比未加时明显增多,而凋亡率无明显差异。但随剂量加大,c-Kit+Lin-细胞扩增下降,细胞凋亡率上升,200μg/L TPO组凋亡率为33.49%,c-Kit+Lin-细胞扩增倍数仅为4.11倍。结论TPO可协同SCF+FL+LIF使c-Kit+Lin-细胞增殖,但过高剂量会诱导其分化和凋亡,以50μg/L浓度扩增效果最佳。

小鼠c-Kit^+lin-骨髓细胞移植生成肝细胞的实验研究

目的评价小鼠c-Kit+Lin-骨髓细胞的肝干细胞潜能,为骨髓源性肝干细胞的临床运用提供可行性实验依据。方法供体为纯系BALB/C雄性小鼠,c-Kit+Lin-骨髓细胞采用免疫磁珠分选法分离细胞。受体为行35Gy全肝照射处理后的同龄同系BALB/C雌性小鼠,立即移植供体c-Kit+lin-骨髓细胞。接受c-Kit+lin-骨髓细胞移植1月后,活杀取肝做常规病理学检查、Y染色体的原位杂交检查、甲胎蛋白与白蛋白的免疫组化检测。结果移植1月后小鼠肝脏的组织结构已恢复正常,肝组织细胞中存在原位杂交和免疫组化均呈阳性反应的双阳性细胞。结论小鼠c-Kit+Lin-骨髓细胞具有肝干细胞潜能,移植后可以在肝内定居并分化形成肝细胞。可做为肝病细胞移植疗法的种子细胞。

肝细胞生长因子对c-kit^+Lin^-细胞的增殖作用

目的探讨在无血清无基质的条件下,肝细胞生长因子(HGF)和因子组合对扩增c-kit+Lin-细胞的影响。方法采用免疫磁珠法分离小鼠骨髓c-kit+Lin-细胞,研究在干细胞因子(SCF),FLt-3配基(FL),促血小板生成素(TPO)和白血病抑制因子(LIF)组合中添加不同浓度的HGF培养7d,检测细胞总数,c-kit+Lin-细胞扩增倍数及细胞凋亡率。结果各因子组均可显著扩增c-kit+Lin-细胞,扩增倍数2￣8倍不等。其中,10ng/mlHGF组扩增c-kit+Lin-细胞效果最为显著,为8.00倍,细胞总数扩增45.43倍,细胞凋亡率为17.42%。但随剂量加大,虽然细胞总数上升,c-kit+Lin-细胞扩增反而下降。40ng/ml组细胞总数扩增80.50倍,c-kit+Lin-细胞扩增效果不明显,仅为2.87倍,细胞凋亡率最低,为5.91%。结论10ng/ml的HGF能协同SCF+FL+TPO+LIF扩增c-kit+Lin-细胞,使细胞凋亡率降低,其表型并不受影响,但过高剂量会诱导其分化。

不同细胞因子组合对c-kit^+Lin^-细胞的体外扩增研究

目的探讨在无血清无基质条件下,不同细胞因子组合对c-kit+Lin-细胞增殖效应以及最佳扩增时间。方法采用免疫磁珠法分离小鼠骨髓c-kit+Lin-细胞,将干细胞因子(stem cell factor,SCF),FLt-3配基(FLt-3 ligand,FL),血小板生成素(thrombopoietin,TPO),白细胞介素-3(interleukin,IL-3),肝细胞生长因子(hepatocyte graoth factor,HGF)等细胞因子进行不同组合,体外扩增干细胞14d,于不同时间检测细胞总数和c-kit+Lin-细胞数及比例,并在第10天通过细胞凋亡早期膜变化标记FIFT-Annexin-V,检测细胞凋亡率。结果各组细胞因子均能显著扩增c-kit+Lin-细胞,扩增倍数3～19倍不等。在SCF+FL+TPO中加入IL-3或HGF,其效果更明显,c-kit+Lin-细胞在第6天分别扩增4.71和5.15倍,当同时加入时,两者有协同作用。其中SCF+FL+TPO+IL-3+HGF在第10天扩增程度最为显著,并且凋亡率最低为6.59%。结论在体外短期培养过程中上SCF+FL+TPO+IL-3+HGF组合能产生大量的c-kit+Lin-细胞,并且最佳培养时期为第10天,为肝干细胞提供种子细胞。

白细胞介素3对c-kit^+Lin^-细胞的增殖作用

目的探讨在无血清无基质的条件下,白细胞介素3(IL-3)和因子组合的不同浓度对扩增c-kit+Lin-细胞的影响。方法采用免疫磁珠法分离小鼠骨髓c-kit+Lin-细胞,在干细胞因子(SCF)、肝细胞生长因子(HGF)、FLt-3配基(FL)、促血小板生成素(TPO)和白血病抑制因子(LIF)组合中添加不同浓度的IL-3培养7d,检测细胞总数、c-kit+Lin-细胞扩增倍数及细胞凋亡率。结果未加IL-3(A组),10ng/mlIL-3(B组),20ng/mlIL-3(C组)和40ng/mlIL-3组(D组)均可显著扩增c-kit+Lin-细胞,扩增倍数7～19倍不等。随剂量加大,虽然细胞总数上升,但是超过一定浓度后c-kit+Lin--细胞扩增反而不明显。D组细胞总数扩增245.41倍,但c-kit+Lin-细胞扩增仅为15.80倍,明显低于C组(扩增c-kit+Lin-细胞为18.75倍)(P<0.05)。但D组细胞凋亡率最低,仅为4.66%。结论IL-3能协同SCF+HGF+FL+TPO+LIF有效的扩增c-kit+Lin-细胞,其表型并不受影响;但过高剂量反而促使干细胞分化。

利用c-kit^+骨髓间充质干细胞与心脏脱细胞骨架共培育心肌组织

背景:研究发现c-kit阳性骨髓间充质干细胞可特异分化为心肌细胞,可能成为理想的种子细胞。目的:验证利用c-kit+骨髓间充质干细胞及心脏脱细胞骨架培育心肌组织的可行性。方法:取成年大鼠心脏脱细胞后备用。取大鼠骨髓间充质干细胞,培养至第8代后行c-kit富集,采用5μmol/L的5氮杂胞苷诱导2周后行二氢吡啶受体α2富集,然后继续培养行心肌分化鉴定或种植于心脏脱细胞骨架内行心肌组织培养。6周后,利用心肌细胞特异性蛋白表达及动作电位鉴定心肌细胞分化,利用免疫荧光染色分析新生心肌组织结构。结果与结论:第2次富集6周后,约60%的骨髓间充质干细胞表达心肌肌钙蛋白T、GATA结合蛋白4、连接蛋白43,电生理分析显示这些细胞可产生心肌细胞样动作电位,证实c-kit+骨髓间充质干细胞可特异分化为心肌细胞,种植于脱细胞心脏骨架后可形成排列有序的心肌组织。

c-Kit^+Lin^-细胞移植改善急性肝损伤的实验研究

目的探讨骨髓c-Kit+Lin-(CD117)细胞移植治疗小鼠急性肝损伤的效果以及机制,为骨髓源性肝干细胞的临床应用提供实验依据。方法 18只成年BALB/c小鼠随机分为正常组、实验组和干细胞移植组,正常组不予任何处理,模型组小鼠腹腔注射CCl4后仅输入生理盐水,移植组小鼠在腹腔注射CCl4后尾静脉输注骨髓CD117细胞(1×106),48 h后观察各组小鼠肝功能水平变化,苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色分析肝脏病理学改变,免疫组化检测肝脏细胞增殖情况。结果模型组腹腔注射CCl4后肝功能严重受损,血清谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(glutamic oxalacetic transaminase,AST)、胆红素(bilirubin)等升高,肝脏的HE染色可见片状坏死,炎症细胞浸润;移植组小鼠移植干细胞48 h后小鼠肝功能有所恢复,病理提示肝脏坏死区域有所减小,Ki67免疫组化提示干细胞可促进肝脏再生。结论经尾静脉注入的骨髓来源的CD117干细胞能改善急性肝损伤肝功能以及修复受损肝脏,是治疗急性肝损伤的一种安全有效的方法。

大鼠CD90^+Lin^-骨髓细胞诱导分化为肝细胞过程中Klf4、Nanog基因的表达及启动子区甲基化观察

目的观察大鼠CD90^+Lin^-骨髓细胞诱导分化为肝细胞过程中Klf4、Nanog基因表达及启动子区CpG位点的甲基化变化。方法大鼠CD90^+Lin^-骨髓细胞在体外用25μg/L重组人肝细胞生长因子和0.1 nmol/L地塞米松诱导其分化,在诱导第0、7、14天分别提取细胞DNA和RNA。采用实时荧光定量PCR法检测Klf4、Nanog基因mRNA,甲基化特异性PCR法观察Klf4、Nanog基因启动子区CpG位点甲基化。结果与诱导第0天比较,第7、14天Klf4 mRNA相对表达量降低(P均<0.05);与诱导第0天比较,第7、14天Nanog mRNA相对表达量均降低(P均<0.05)。与诱导第0天比较,诱导第7天Klf4启动子区第1、2个CpG位点甲基化频率升高(P均<0.05);与诱导第7天比较,诱导第14天Klf4启动子区第1个CpG位点甲基化频率升高,第2、3个CpG位点甲基化频率降低,P均<0.05。与诱导第0天比较,诱导第7天Nanog启动子区第1个CpG位点甲基化频率降低,第2个CpG位点甲基化频率升高,P均<0.05;与诱导第7天比较,诱导第14天Nanog启动子区第1个CpG位点甲基化频率升高,第2个CpG位点甲基化频率降低,P均<0.05。结论大鼠CD90^+Lin^-骨髓细胞在体外诱导向肝细胞分化过程中,Klf4、Nanog基因表达随诱导时间增加呈现先下降后回升趋势,两者启动子区CpG位点甲基化程度随诱导时间增加出现不同程度变化;Klf4和Nanog基因启动子区CpG位点的甲基化变化不仅会影响Klf4、Nanog基因的表达,而且起到重要的调控作用。

复合心肌补片对小鼠梗死心肌的修复效果观察

目的探讨以人心脏瓣膜组织脱细胞基质作为支架的复合骨髓c-kit+干细胞心肌补片(以下称复合心肌补片)对小鼠梗死心肌的修复效果。方法制作复合心肌补片。采用结扎左冠状动脉前降支法制作30只心肌梗死小鼠模型并随机分为复合补片组、补片组及对照组各10只。造模成功3 d时各组小鼠予异氟烷麻醉、固定,开胸暴露心脏。复合补片组将复合心肌补片移植于梗死心肌周边;补片组采用同样方法将脱细胞基质移植于梗死心肌周边;对照组不采取修复措施。采用心脏超声检测移植4周时三组心移植左室射血分数、左室短轴缩短率、心梗面积。结果移植4周时,复合补片组左室射血分数、左室短轴缩短率明显高于补片组及对照组,心梗面积明显小于补片组及对照组,P均<0.05。结论复合心肌补片用于修复梗死心肌效果满意。