骺板细胞外基质源性仿生支架的制备及性能评估

背景:骺板细胞外基质具有丰富的胶原、蛋白多糖及信号分子,其成分和特征最接近天然骺板组织,是构建织工程骺板的最理想原料之一。目的:采用骺板细胞外基质构建取向柱状仿生支架材料,并对其进行性能评估。方法:取胎牛膝关节标本,采用超湿法粉碎、差速离心及有机溶剂分离等技术联合处理获得细胞外基质微丝,利用定向结晶、冷冻干燥技术及物理/化学交联方法制备出骺板细胞外基质源性仿生柱状支架材料,扫描电镜观察支架的内部结构及孔径,检测支架的孔隙率及吸水膨胀率,同时对支架进行组织学观察。结果与结论:(1)苏木精-伊红染色显示,细胞外基质微丝呈纤维状,形状规则,均匀一致;甲苯胺蓝、番红O及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性,说明保留了天然骺板细胞外基质的有效成分;(2)显微镜显示支架横截面呈多孔蜂窝状结构,孔径均匀一致,形状规则,纵切面显示平行排列的柱状结构,均匀一致,孔径分布均匀,相互连通好,支架外壁纤维呈纵向取向排列,类似于天然骺板软骨的柱状分布结构。扫描电镜显示支架横切面呈多孔蜂窝状,均匀分布,形状规则,支架的横向孔径为(117.5±15.37)μm。支架孔隙率为(92.05±1.54)%,吸水膨胀率为(95.95±1.07)%;(3)结果表明,骺板细胞外基质源性仿生柱状组织工程支架材料在成分来源和结构特征方面均达到了模仿天然骺板软骨的特点。

骺板软骨细胞的冻存及复苏

目的 研究骺板软骨细胞冻存的方法。方法 取对数生长期的骺板软骨细胞 ,加入配制好的冻存液 (冻存液A :培养液与DMSO ;冻存液B :含 5 %小牛血清的培养液与DMSO ;冻存液C :含 2 0 %小牛血清的培养液与DMSO ;冻存液D :小牛血清与DMSO混合 ;其中DMSO终浓度均为 10 %。) ,冻存。细胞复苏后用台盼蓝拒染试验检测细胞存活率。然后接种于培养皿中 ,采用苏木 伊红染色和甲苯胺蓝染色 ,观察细胞形态及合成糖胺多糖的能力。结果 细胞活率为 :A冻存液 70 % ,B冻存液 75 % ,C、D两种冻存液无明显差别 ,分别为 89%和 92 %。复苏的细胞贴壁时间延迟 ,但培养 72小时以后 ,细胞活力明显增强。甲苯胺蓝异染提示 ,经冷冻保存后软骨细胞仍能保持合成异染基质 (糖胺多糖 )的能力。结论 本实验冻存、复苏的方法结果稳定 ,可用于保存骺板软骨细胞。

大鼠胫骨骺板软骨细胞P物质的表达

目的 研究P物质 (SP)在大鼠胫骨骺板软骨细胞中的表达及其在长骨纵向生长中的意义。方法 应用免疫组化技术检测 8周龄大鼠胫骨骺板不同组织学层次软骨细胞的SP表达状况。结果 骺板静止及增殖期软骨细胞未见SP免疫阳性染色 ,肥大区及钙化区软骨细胞可见SP免疫组化阳性染色。结论 骺板肥大区及钙化区软骨细胞可以表达SP 。

可注射型骺板软骨水凝胶的制作及特性研究

目的构建具有良好可塑性和生物特性的组织工程化骺软骨。方法制备胎牛骺软骨细胞外基质(cattlearticular cartilage extracellular matrix,CACECM),复合藻酸钙(加10%葡萄糖酸钙)制备成可注射性水凝胶材料,行DNA及糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)定量检测。再与体外扩增的2周龄新西兰白兔第二代骺软骨细胞复合培养,并植于实验兔背部脊柱两旁皮下,8周后取材进行形态学观察及组织学检测。结果制备的可注射型水凝胶材料有较好的生物性能,培养出的组织工程化骺软骨组织细胞生长良好,具有分泌软骨基质功能。结论将异体脱细胞骺软骨细胞外基质与藻酸钙及葡萄糖酸钙结合,可以作为良好的可注射型水凝胶材料应用于组织工程化骺软骨的构建。

原代骺板软骨细胞的高效分离和体外培养观察

目的 设计原代骺板软骨细胞的高效分离法 ,并对骺板软骨细胞的体外培养进行初步观察。 方法 改良设计以 1g L的胰蛋白酶 / 1g L的乙二胺四乙酸 (EDTA)、1g L的透明质酸酶和 2g L的Ⅰ型胶原酶系列消化分离原代软骨细胞的三步酶消化分离法 ,观察其对幼兔骺板原代软骨细胞的分离效果 ;倒置显微镜和光镜下观察体外培养条件下细胞生物学特性。 结果 ( 1)三步酶的消化可使软骨基质完全解离降解 ,细胞均得以分离 ,收获量与组织湿重呈非常显著的正相关 ,每克软骨的细胞收获量平均为 32 .3× 10 6 个 ,细胞存活率平均为 97.6 %。 ( 2 )原代和第 1代细胞附壁生长呈三角形或多角形 ,生长融合时呈卵圆形 ,Ⅱ型胶原免疫组化和甲苯胺蓝 (TB)异染反应均呈阳性 ;第 3代以后细胞逐渐变为梭形 ,Ⅱ型胶原免疫组化为阴性 ,TB异染反应明显减弱。结论 ( 1)原代骺板软骨细胞三步酶消化分离法具有细胞收获率高、细胞存活率高、操作简便等特点。 ( 2 )随着传代培养次数的增加 ,骺板细胞出现去分化 ,逐渐失去软骨细胞的特异性表型。