骺板软骨细胞的冻存及复苏

目的 研究骺板软骨细胞冻存的方法。方法 取对数生长期的骺板软骨细胞 ,加入配制好的冻存液 (冻存液A :培养液与DMSO ;冻存液B :含 5 %小牛血清的培养液与DMSO ;冻存液C :含 2 0 %小牛血清的培养液与DMSO ;冻存液D :小牛血清与DMSO混合 ;其中DMSO终浓度均为 10 %。) ,冻存。细胞复苏后用台盼蓝拒染试验检测细胞存活率。然后接种于培养皿中 ,采用苏木 伊红染色和甲苯胺蓝染色 ,观察细胞形态及合成糖胺多糖的能力。结果 细胞活率为 :A冻存液 70 % ,B冻存液 75 % ,C、D两种冻存液无明显差别 ,分别为 89%和 92 %。复苏的细胞贴壁时间延迟 ,但培养 72小时以后 ,细胞活力明显增强。甲苯胺蓝异染提示 ,经冷冻保存后软骨细胞仍能保持合成异染基质 (糖胺多糖 )的能力。结论 本实验冻存、复苏的方法结果稳定 ,可用于保存骺板软骨细胞。

大鼠胫骨骺板软骨细胞P物质的表达

目的 研究P物质 (SP)在大鼠胫骨骺板软骨细胞中的表达及其在长骨纵向生长中的意义。方法 应用免疫组化技术检测 8周龄大鼠胫骨骺板不同组织学层次软骨细胞的SP表达状况。结果 骺板静止及增殖期软骨细胞未见SP免疫阳性染色 ,肥大区及钙化区软骨细胞可见SP免疫组化阳性染色。结论 骺板肥大区及钙化区软骨细胞可以表达SP 。

原代骺板软骨细胞的高效分离和体外培养观察

目的 设计原代骺板软骨细胞的高效分离法 ,并对骺板软骨细胞的体外培养进行初步观察。 方法 改良设计以 1g L的胰蛋白酶 / 1g L的乙二胺四乙酸 (EDTA)、1g L的透明质酸酶和 2g L的Ⅰ型胶原酶系列消化分离原代软骨细胞的三步酶消化分离法 ,观察其对幼兔骺板原代软骨细胞的分离效果 ;倒置显微镜和光镜下观察体外培养条件下细胞生物学特性。 结果 ( 1)三步酶的消化可使软骨基质完全解离降解 ,细胞均得以分离 ,收获量与组织湿重呈非常显著的正相关 ,每克软骨的细胞收获量平均为 32 .3× 10 6 个 ,细胞存活率平均为 97.6 %。 ( 2 )原代和第 1代细胞附壁生长呈三角形或多角形 ,生长融合时呈卵圆形 ,Ⅱ型胶原免疫组化和甲苯胺蓝 (TB)异染反应均呈阳性 ;第 3代以后细胞逐渐变为梭形 ,Ⅱ型胶原免疫组化为阴性 ,TB异染反应明显减弱。结论 ( 1)原代骺板软骨细胞三步酶消化分离法具有细胞收获率高、细胞存活率高、操作简便等特点。 ( 2 )随着传代培养次数的增加 ,骺板细胞出现去分化 ,逐渐失去软骨细胞的特异性表型。