低强度脉冲超声波对髁突软骨细胞炎症状态的作用研究

目的 观察低强度脉冲超声波对白介素-1β制造的大鼠髁突软骨细胞炎症模型中MAPK信号通路相关因子磷酸化的表达变化。方法 二次酶消化法分离髁突软骨细胞并完成鉴定。将分离出的大鼠髁突软骨细胞随机分为3组,加入3种不同浓度的IL-1β处理并进行Ⅱ型胶原与MMP-13免疫细胞化学染色,筛选出最佳致炎浓度。再次将所提取的大鼠髁突软骨细胞随机分为3组:NC组、OA组、LIPUS组,处理后对Ⅱ型胶原、p38、p-p38、ERK1/2、pERK1/2进行免疫细胞化学染色,观察蛋白表达情况。结果(1)成功提取大鼠髁突软骨细胞。(2)IL-1β:10 ng/mL组Ⅱ型胶原表达量降低最明显,差异有统计学意义(P<0.05),MMP-13表达量升高最明显,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)OA组与LIPUS组Ⅱ型胶原表达量均降低,差异有统计学意义(P<0.05),OA组降低更明显,差异有统计学意义(P<0.05)。3组的p38、ERK1/2表达量无明显差异(P>0.05)。OA组与LIPUS组p-p38、p-ERK1/2表达量均升高,差异有统计学意义(P<0.05),OA组升高更明显,差异有统计学意义(P<0.05)。结论(1)二次酶消化法成功提取大鼠髁突软骨细胞。(2)10 ng/mL为IL-1β最佳致炎浓度。(3)LIPUS处理可减少炎性髁突软骨细胞中Ⅱ型胶原的降解,抑制了MAPK通路相关因子p38、ERK1/2的磷酸化。

过量氟对小鼠髁突软骨损伤及自噬相关因子LC3、p62表达的影响

目的:研究过量氟对小鼠髁突软骨损伤及髁突软骨中自噬相关因子的表达。方法:将30只4周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组和实验组,每组15只,对照组自由饮用去离子水,实验组自由饮用含氟离子浓度为75 mg/L的去离子水,持续喂养8周。通过改良番红O-固绿软骨染色观察髁突纤维软骨层结构变化;免疫组织化学染色检测软骨细胞外基质降解标志物基质金属蛋白酶13(Matrix metalloproteinase 13,MMP-13)、Ⅱ型胶原蛋白的表达水平及自噬相关因子微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)、自噬底物蛋白p62的表达水平。采用SPSS 22.0软件包对免疫组织化学染色半定量结果进行双因素方差分析。结果:与对照组相比,实验组纤维软骨层变薄,软骨细胞体积变小,核变小,染色加深。免疫组织化学染色结果显示,实验组MMP-13表达量增加,Ⅱ型胶原蛋白表达量降低;LC3表达量增加,p62表达量下降。结论:用含氟离子浓度为75 mg/L的去离子水喂养小鼠8周,可导致髁突软骨退变,髁突软骨发生自噬。

慢性不可预见性应激致大鼠髁突软骨组织学变化的自然转归

目的探讨慢性不可预见性应激引起的颞下颌关节髁突软骨的组织学受损的转归,为颞下颌关节紊乱病的防治提供实验依据。方法本动物实验经第四军医大学口腔医院实验动物管理伦理委员会批准(批准号:2020伦审字081号)。将60只雄性SD大鼠随机分为空白对照组、应激组、应激去除2周组、应激去除4周组、应激去除8周组。对大鼠施加的慢性不可预见性应激(chronic unpredictable moderate stress,CUMS)包括24 h潮湿垫料、12 h倾斜饲养、4 h噪音、昼夜颠倒、强迫浸水、夹尾、束缚应激,持续8周;在去除应激2周、4周、8周后观察其血清学、行为学以及髁突软骨组织学与超微结构的变化,其中采用酶联免疫法观察大鼠的血清促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)和皮质酮(corticosterone,CORT)水平的变化,采用糖水偏好实验和强迫游泳实验观察大鼠抑郁样情绪的行为学变化,运用免疫组织化学染色法和Western blot法检测髁突软骨白细胞介素-1α(interleukin-1α,IL-1α)和基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinases-3,MMP-3)的表达。结果应激组在CUMS刺激持续8周末时,与对照组相比大鼠血清中CORT和ACTH水平增高(P<0.01),行为学表现为摄糖减少、强迫游泳实验中“不动”时间延长(P<0.01),说明出现了明显的快感缺失、抑郁、绝望情绪,证明CUMS模型建立成功;并且髁突软骨表现出明显的退行性改变,软骨表面胶原纤维排列紊`乱,蛋白多糖合成减少;髁突中的IL-1α和MMP-3在各层软骨的胞内和细胞外基质中均有表达,且表达水平升高(P<0.01)。应激去除2周后CORT和ACTH血清学水平下降,但高于对照组(P<0.01),行为学检测与对照组相比仍有差异(P<0.01);髁突软骨表面仍可看到松解的胶原纤维,增殖层内可见一些游离细胞区;髁突中的IL-1α和MMP-3在各层软骨的表达较应激组降低,但仍高于对照组(P<0.01)。应激去除4周后,CORT和ACTH血清学变化恢复到正常水平,行为学测试与对照组仍有差异(P<0.05),髁突软骨表面有少量胶原纤维,IL-1α和MMP-3的表达与应激组相比显著下降(P<0.01),其中IL-1α水平接近对照组水平(P>0.05),但MMP-3的表达仍高于对照组(P<0.01)。应激去除8周后,行为学变化也恢复到正常水平,与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),髁突胶原纤维增多,呈现波纹状,并未发生严重的软骨下骨的损伤,未发生不可逆损害,IL-1α和MMP-3的表达水平均接近对照组水平(P>0.05)。结论CUMS引起的行为学改变和髁突软骨损伤在应激因素去除后可以随时间自然恢复,IL-1α和MMP-3表达的下降可能是这种自我修复过程的内在机制之一。

A型肉毒毒素注射咬肌对髁突软骨下骨改建的影响

目的SD大鼠右侧咬肌内注射A型肉毒毒素,探讨其对髁突软骨下骨改建的影响。方法选取9周龄雄性SD大鼠32只,经随机抽样分成两组:实验组(A型肉毒毒素咬肌注射组)和空白对照组,每组16只,实验组SD大鼠咬肌内注射A型肉毒毒素。于术后2、4、8、12周时处死SD大鼠,每组每时间段各4只,获取髁突标本进行观察分析:1、HE染色后行骨形态计量分析,观察髁突软骨下骨的结构变化;2、免疫组化的方法检测髁突软骨下骨OPG和RANKL的表达。结果1、HE染色后行骨形态计量分析显示:实验组骨小梁数目以及骨小梁面密度在术后2、4周时均低于对照组(P<0.05),而术后8、12周时与对照组差异无统计学意义(P>0.05);骨小梁间隙在术后2、4周时高于对照组(P<0.05),而术后8、12周时与对照组差异无统计学意义(P>0.05);骨小梁厚度术后2周时低于对照组(P<0.05)、术后12周时高于对照组(P<0.05),而术后4、8周时与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。2、免疫组化结果显示:OPG表达在术后2周时实验组高于对照组(P<0.05),术后4、8、12周时与对照组差异无统计学意义(P>0.05);RANKL表达在术后2、4周时实验组高于对照组(P<0.05),术后8、12周时与对照组差异无统计学意义(P>0.05);OPG/RANKL的比值在术后2、4周时实验组低于对照组(P<0.05),术后8、12周时与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论SD大鼠咬肌内注射A型肉毒毒素早期可诱导颞下颌关节髁突软骨下骨结构异常,OPG/RANKL信号通路介导了髁突软骨下骨的改建,后期其对髁突软骨下骨改建的影响逐渐减弱。提示咬肌内注射A型肉毒毒素不会造成髁突软骨下骨的过度损伤。

静张应力对大鼠髁突软骨细胞增殖效应调节研究

目的 探讨静张应力环境对髁突软骨细胞增殖效应的影响。方法 将第 4代大鼠下颌髁突软骨细胞在细胞膜式张应力施加装置上培养 ,检测不同血清浓度及持续不同的静张应力 (5kPa、10kPa)在 0～ 12h内对髁突软骨细胞增殖活性的影响。结果 低血清培养基中 ,随培养时间的延长 ,硅胶膜上髁突软骨细胞的增殖活性受到抑制 ;短期 (2h)的静张应力 (5kPa、10kPa)对髁突软骨细胞细胞周期的调控影响不大 ;0～ 10h内 5kPa静张应力组软骨细胞增殖指数随着张应力作用时间的延长不断上升 ,增殖指数峰值位于 10h处 ;0～ 8h内 10kPa静张应力组软骨细胞增殖指数随着张应力作用时间的延长不断上升 ,增殖指数峰值位于 8h处 ;5kPa静张应力组较 10kPa静张应力组对髁突软骨细胞具有更大的促增殖作用。

Herbst矫治器在不同重建时对髁突软骨表面应力分布的影响

目的 :从生物力学角度研究Herbst矫治器在不同的重建状态下前导下颌 ,对髁突软骨表面应力分布的影响 ,为临床应用提供理论依据。方法 :采用三维有限元方法 ,在已建立的颞下颌关节—下颌骨—Herbst矫治器系统的三维正交各向同性有限元模型上 ,根据临床和相关文献设计重建的类型 ,在髁突的矢状向及冠状向上分别选取相应节点 ,计算相应的最大主应力与最小主应力值。结果 :不同重建时 ,髁突软骨表面同一部位的应力值相差不大 ,在相同重建时 ,髁突软骨表面不同部位的应力值相差较大。在每一种重建组合中 ,矢状向髁突软骨后方有较大范围的张应力区 ,而髁突前斜面有较大范围的压应力区。冠状向髁突软骨表面的内、外侧斜面都主要为压应力区。结论 :本文设计的 5组重建类型 (下颌水平前伸 3～ 7mm ,垂直打开 4～ 2mm)在髁突表面的应力分布相差不大 。

颌间Ⅲ类矫形力作用下转化生长因子β1在髁突软骨中的基因表达

目的 观察颌间Ⅲ类矫形力不同作用时间下转化生长因子 β1(TGF_β1)在髁突软骨中的基因表达。 方法 选用青春生长发育期雌性恒河猴 6只 ,随机分为 3、6月实验组和对照组 ,实验组戴用颌间Ⅲ类双阻板磁力矫治器 ,对照组不戴。苏木精—伊红染色观察髁突软骨组织形态 ,原位杂交方法检测髁突软骨TGF_β1mRNA的表达 ,并进行统计学处理。结果 ①组织学观察表明 :与对照组相比 3月组髁突软骨前份有一定程度增厚 ,中、后份变薄 ;6月组髁突软骨厚度变化与 3月组相似。②原位杂交结果表明 :对照组TGF_β1mRNA前份表达较弱 ,中、后份表达较强 ;3月组髁突软骨前中后份TGF_β1mRNA表达均增强 ,以前份最强 ;6月组髁突软骨TGF_β1mRNA表达比 3月组明显减少 ,但前份仍强于中后份。实验组之间以及实验组与对照组之间的差异均有统计学意义 (P <0 0 1)。结论 髁突软骨TGF_β1mRNA的表达强弱与颌间Ⅲ类矫形力不同的作用时间有关。 3月组TGF_β1mRNA表达较 6月组明显 ,提示

渐进性咬合紊乱对大鼠髁突软骨肿瘤坏死因子-α表达的影响

目的探讨渐进性咬合紊乱对大鼠髁突软骨中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响。方法48只8周龄大鼠,随机分为实验组和对照组各4个时间点,雌雄各半,每组3只。以皮筋弹性力推右侧下颌、左侧上颌第一磨牙近中移动,4周后同样方式推右侧下颌、左侧上颌第三磨牙远中移动,造成渐进性咬合紊乱动物模型,实验2、4、6、8周后处死动物。苏木精-伊红染色观察髁突软骨组织学变化及软骨厚度变化,免疫组织化学方法检测和阳性细胞面积百分比法分析髁突软骨中TNF-α的表达特点。结果实验4、6、8周组髁突软骨均较对照组增厚(P<0.05),实验组出现以无菌坏死为主的软骨退行性变。TNF-α主要集中表达于髁突软骨的肥大层,实验2、6、8周组表达高于同龄对照组(P<0.05),实验4周组与同龄对照组之间无差异(P>0.05),雌雄变化趋势基本相同。结论TNF-α参与了异常咬合所导致的髁突软骨病理性改建活动,随时间延长,咬合紊乱较重者,髁突软骨的分解代谢活动更加明显。

雌激素对人胚髁突软骨细胞增殖分化的影响

目的观察不同浓度的雌激素作用于体外培养的人胚髁突软骨细胞(MCCs),探讨雌激素对MCCs增殖分化的影响。方法体外培养MCCs,甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色法鉴定;甲基噻唑基四唑(MTT)法检测不同浓度雌激素对MCCs增殖与分化的影响。结果高浓度(10-6mol·L-1)、低浓度(10-12mol·L-1)雌二醇抑制MCCs增殖分化,生理浓度(10-10、10-8mol·L-1)雌二醇促进MCCs增殖分化,且随作用时间延长,促进或抑制作用增强。结论雌激素对体外培养的人胚MCCs增殖分化具有双向调节作用,呈时间和剂量依赖性。表明雌激素对维持颞下颌关节的正常功能具有重要意义,可能在颞下颌关节病的发生和进程中发挥作用。

功能矫形前伸大鼠下颌后髁突软骨β转化生长因子Ⅰ型受体(TβR-Ⅰ)表达变化的研究

目的：了解青春期ＳＤ大鼠髁突软骨β转化生长因子Ⅰ型受体（ＴβＲ－Ⅰ）在功能矫形前伸下颌后分布的变化，探讨ＴβＲ－Ⅰ与ＴＧＦ－β１表达的关系。方法：实验组戴模拟临床功能矫治器，引导大鼠下颌前伸，并在实验３ｄ，１，２，３和４周各处死５只大鼠，取下髁突，应用免疫组织化学方法探测β转化生长因子Ⅰ型受体（ＴβＲ－Ⅰ）在髁突中的含量及分布。结果：髁突各层软骨细胞均有Ⅰ型受体（ＴβＲ－Ⅰ）的分布，以成熟层阳性强度最高；功能矫形前伸下颌后，髁突软骨细胞各层ＴβＲ－Ⅰ的表达均增强。结论：机械刺激调节了ＴＧＦ－β的功能。

紊乱对猴髁突软骨中TGF-β1分布的影响

目的 :探讨渐进性咬合紊乱所致猴颞下颌关节退形性变中 ,髁突软骨TGF β1的分布变化特点及其意义。方法 :2只青年恒河猴分成实验组和对照组。采用拔牙和固定矫治技术造成实验组后牙渐进性咬合紊乱。 8月后 ,对髁突进行HE染色和TGF β1免疫组化定量分析。 结果 :①实验组髁突前内侧出现明显的退性形变 ,与对照猴相比 ,其髁突各部位软骨厚度均变薄 (P <0 .0 1) ,其中变化程度最大者为前部内份 ,其次是髁突前部中份和中部内份。②与对照猴相比 ,实验组髁突软骨各部位TGF β1表达均升高 (P <0 .0 1)。结论 :渐进性咬合紊乱可导致髁突退性形变 ,髁突软骨中TGF β1表达明显增强 ,TGF β1可能参与了关节软骨的修复活动。

不同咀嚼负荷对幼兔髁突软骨内印度豪猪蛋白-人甲状旁腺激素相关蛋白通路表达的影响

目的分析不同咀嚼负荷作用下,幼兔髁突软骨内印度豪猪蛋白(Ihh)-人甲状旁腺激素相关蛋白(PThrP)通路表达的差异性,探讨咀嚼应力负荷对髁突软骨Ihh-PThrP信号通路的影响。方法选取10d龄幼兔48只,随机分为硬食组和软食组,分别喂以同种颗粒状(硬食)和粉状(软食),于饲养的第2、4、6、8周处死。采用苏木精-伊红(HE)染色、免疫组织化学、免疫印迹、实时定量荧光聚合酶链反应检测Ihh和PThrPmRNA和蛋白的动态变化。结果HE染色显示硬食组髁突软骨厚度高于软食组的厚度;第2、4、6、8周,Ihh蛋白、PThrP蛋白和mRNA表达量在两组中呈递减趋势;软食组中Ihh和PThrP蛋白以及mRNA表达量显著低于硬食组。结论较低的咀嚼负荷会造成髁突软骨生长因子Ihh和PThrP分泌减少,Ihh-PThrP通路表达迟缓,软骨发育受阻碍;适当的咀嚼负荷对髁突的正常发育有至关重要的作用。

永生化下颌骨髁突软骨细胞的微囊化研究

为了探讨微囊包裹软骨细胞在软骨组织工程中的适用性 ,根据气流切割原理采用海藻酸钠 -多聚赖氨酸 -海藻酸钠 ( APA)对永生化下颌骨髁突软骨细胞 ( Im mortalized mandibular condylar chondrocyte,IMCC)进行微囊包裹。用倒置显微镜观察、台盼蓝染色、细胞记数、HE染色、免疫组化等方法检测微囊的大小、细胞的生长及微囊内组织的软骨特性等情况。研究发现 ,IMCC可在微囊内存活 ,活细胞率 >80 % ,微囊直径平均 779μm。细胞数量随着培养时间的延长逐渐增多 ,约 2 0 d左右达到平台期 ,细胞在囊内呈簇样生长 ,高表达软骨特异的蛋白多糖和 型胶原。提示 IMCC可在微囊内形成类软骨组织样结构 。

体内压应力刺激下大鼠髁突软骨细胞的分离、体外培养以及差异蛋白质组学观察

目的:观察体内压应力刺激下大鼠髁突软骨细胞的生物学活性和蛋白质表达谱。方法:对大鼠进行III类矫形力应力加载2周,观察髁状突大体形态和组织形态学;体外培养实验鼠和对照鼠软骨细胞,计数细胞收获数和细胞存活率,检测总蛋白质组学水平上差异。结果:压力刺激后的大鼠髁突软骨明显变薄,表面无光泽,缺乏弹性,重量降低(P<0.01);力学刺激后髁突软骨细胞收获率和存活率均下降(P<0.01),形态更加狭长;蛋白质组学结果主要为应激蛋白上调,信号转导蛋白活化,细胞骨架蛋白和细胞增殖代谢相关蛋白的下降。结论:经体内力学加载后,体外分离培养的关节软骨细胞形态、生物学活性以及在蛋白质水平均发生了明显的变化。

大鼠下颌髁突软骨细胞体外培养研究

下颌髁突软骨的生长改建一直是人们关注的焦点。本实验选用ＳＤ大鼠下颌髁突软骨，分离培养髁突软骨细胞，用倒置显微镜、扫描电镜、酶组织化学、免疫组织化学等方法研究了培养髁突软骨细胞的生物学特征。结果：培养的髁突软骨细胞呈多角形或梭形，细胞内有大量分泌颗粒，并有重叠生长和集落生长的特性，它们能合成特异的蛋白多糖、碱性磷酸酶、Ⅱ型胶原等。本研究所介绍的大鼠下颌髁突软骨细胞的分离培养技术及鉴定方法。

机械压力对大鼠下颌髁突软骨细胞增殖活性影响的体外研究

目的:建立体外培养细胞加力装置,在细胞水平探讨机械力作用下大鼠髁突软骨细胞功能代谢的变化。方法:采用流式细胞术检测不同时段、不同力值的机械压力对体外培养的大鼠髁突软骨细胞增殖活性的影响。结果:在一定时间、0～2.03×10-4Pa(0～207g/cm2)力值范围内,随着机械压力的增大,受压的下颌髁突软骨细胞增殖活性增高,以持续压力作用6h最为明显;当持续压力作用于下颌髁突软骨细胞24h后,细胞增殖活性则出现下降。结论:在一定时间、一定力值范围内,随着机械压力的增大,受压的下颌髁突软骨细胞增殖活性有逐渐增高的趋势;当持续压力作用超过一定的范围。

渐进性咬合紊乱对大鼠髁突软骨碱性成纤维细胞生长因子表达的影响

目的探讨渐进性咬合紊乱大鼠髁突软骨中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的变化规律。方法建立大鼠渐进性咬合紊乱动物模型,应用免疫组织化学SABC方法检测髁突软骨中bFGF的表达,并通过计算阳性细胞密度来探讨bFGF在不同实验时间点的表达变化情况。结果bFGF主要表达在大鼠髁突软骨的增殖层、过渡层和肥大层。对照组大鼠髁突软骨中从6周龄到10周龄bFGF的表达逐渐增强,10周龄后降低并保持在一个稳定的水平;成年实验组和幼年实验组在实验2、6、8周时,bFGF的表达均高于各自的对照组,具有统计学意义(P<0.05),而实验4周时与对照组之间无统计学差异。结论bFGF参与了大鼠渐进性咬合紊乱所致髁突软骨的改建活动。

雌激素受体与Ⅱ型胶原在人胚髁突软骨中的表达

目的探讨雌激素受体(ER)和Ⅱ型胶原在人胚髁突软骨中的表达情况。方法采用苏木精-伊红(HE)及免疫组织化学染色法检测ERα、ERβ和Ⅱ型胶原在人胚颞下颌关节髁突软骨各层的表达。结果Ⅱ型胶原主要表达于髁突软骨的过渡层及肥大层。ERα主要表达于髁突软骨的过渡层及肥大层,均匀分布于细胞内;ERβ集中表达于肥大层,且以细胞核内分布为主。纤维层及增殖层未见Ⅱ型胶原和ER表达,钙化软骨层有少量表达。结论 ER与Ⅱ型胶原在髁突软骨中分布一致,雌激素可选择性地结合不同亚型的ER,从而调节髁突软骨细胞分泌Ⅱ型胶原的能力。

不同静压力对大鼠髁突软骨细胞生物学特性的影响

目的探讨不同静压力对髁突软骨细胞生物学特性的影响。方法对培养到第3代的新生SD大鼠髁突软骨细胞加载12、24、36 kPa的静压力,1 h后立即收集样本,同时设不加载力的对照组,用免疫组织化学技术对样本细胞进行染色,用病理图像分析仪分析细胞胞浆中胶原表达强度的变化。结果对于对照组、12、24 kPa组,随着压力的增加,髁突软骨细胞表达Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原及蛋白多糖(PG)增加。与24 kPa组相比,36 kPa组髁突软骨细胞表达Ⅰ型胶原及PG减弱,而Ⅱ、Ⅲ型胶原表达则增加。结论适当的压力刺激可能会使髁突软骨细胞分化更加成熟,但是过大的应力则可能导致髁突软骨细胞生物学特性减弱,从而表现出去分化的某些特征。

渐进性咬合紊乱对髁突软骨成纤维细胞生长因子受体1表达的影响

目的:探讨渐进性咬合紊乱对大鼠髁突软骨中成纤维细胞生长因子受体1(Fibroblast growth factor receptor1,FGFR1)表达的影响。方法:建立大鼠渐进性咬合紊乱模型,采用免疫组化方法检测髁突软骨中FGFR1的表达,并通过比较阳性细胞密度,分析FGFR1的表达变化规律。采用SPSS11.0软件包进行统计学分析。结果:FGFR1主要表达在大鼠髁突软骨过渡层和肥大层,增殖层很少;正常组大鼠髁突软骨从6周龄到10周龄FGFR1表达逐渐增强,10周龄后降低,并保持在一个稳定水平;成年组和幼年组实验4、6周时FGFR1的表达均显著低于对照组,实验8周时的表达高于对照组(P<0.05),幼年组尤为明显,实验2周组与对照组无显著差异。结论:FGFR1参与了大鼠渐进性咬合紊乱所致髁突软骨的改建活动。