人髌下脂肪垫干细胞与骨关节炎软骨细胞间接共培养可促进其向软骨细胞分化

目的将人髌下脂肪垫干细胞(IPFPSC)及骨关节炎软骨细胞(OAC)进行间接共培养,促进OAC软骨表型的恢复及诱导IPFPSC向软骨细胞分化。方法体外分离、培养人IPFPSC及OAC,分为单独IPFPSC组、单独OAC组及IPFPSC和OAC间接共培养组,体外成软骨诱导21 d后,通过HE染色、Alcian蓝染色、免疫荧光细胞化学染色检测细胞1型胶原蛋白(Col1)、Col2、Col10、聚集蛋白聚糖(aggrecan)及SOX-9的表达情况。结果共培养组OAC聚集成微球,IPFPSC呈椭圆形;单独组OAC聚集分布,排列松散,单独组IPFPSC呈长梭形。HE染色显示共培养组OAC聚集成团,核染色深,IPFPSC呈椭圆形,胞质丰富,呈旋涡状生长;单独组OAC聚集分布,核染色浅;单独组IPFPSC呈长梭形,核染色浅。Alcian蓝染色显示共培养组OAC及IPFPSC蛋白多糖分泌多,单独OAC及单独IPFPSC组分泌少。免疫荧光细胞化学染色显示共培养组IPFPSC及OAC中Col2、aggrecan及SOX-9表达较强,Col1与Col10表达较弱;而单独培养的IPFPSC及OAC组则相反。结论 IPFPSC和OAC间接共培养可以促进OAC软骨细胞表型的恢复及诱导IPFPSC向软骨细胞分化。

人髌下脂肪垫干细胞的鉴定及成软骨分化

背景:人髌下脂肪垫是在全膝关节置换手术中经常被切除的废弃物,如果充分加以利用可以作为间充质干细胞的主要来源用于软骨组织工程。目的:探索人髌下脂肪垫干细胞体外分离、培养及鉴定方法,并在特定条件下诱导其成软骨分化,探讨其作为软骨组织工程种子细胞的可行性。方法:获取8例人工膝关节置换术患者废弃的髌下脂肪垫,综合运用胰蛋白酶和Ⅰ型胶原蛋白酶消化法及差速贴壁法分离培养人髌下脂肪垫干细胞,体外培养至第3代后进行细胞形态学观察、细胞生长曲线以及细胞表面抗原分析,然后进行成软骨诱导分化,通过免疫组化和甲苯胺蓝染色以及RT-qPCR方法对人髌下脂肪垫干细胞成软骨分化能力进行鉴定。结果与结论:①分离纯化及培养出的人髌下脂肪垫干细胞呈梭形贴壁生长,第3代细胞生长曲线呈“S”形,CD44、CD105呈阳性表达,而CD45呈阴性表达;②成软骨诱导14 d后,诱导分化组免疫组织化学染色和甲苯胺蓝染色均呈阳性,并且ACAN、BMP-2、COL2A1和SOX-9的基因相对表达量明显高于空白对照组;③该研究证实了从髌下脂肪垫中可分离出具有分化潜能的间充质干细胞,其具有较强的体外增殖能力以及成软骨分化能力,有望成为软骨组织工程理想的种子细胞。

机械加载通过促进髌下脂肪垫干细胞迁移及软骨分化治疗骨关节炎

目的:探究机械加载对骨关节炎小鼠髌下脂肪垫干细胞(IFP-SCs)的动员作用。方法:54只雌性C57BL/6小鼠通过随机数字表法分为对照组(Sham组,n=18)、骨关节炎组(OA组,n=18)、骨关节炎机械加载组(OAL组,n=18)。采用DMM手术建立OA模型,OAL组进行2周的机械加载治疗(条件为1 N,5 Hz,6 min/d)。HE和番红O染色评估小鼠OA模型的软骨损伤程度。免疫荧光、细胞迁移实验、Western印迹等方法检测干细胞的迁移和软骨形成能力。结果:机械加载降低了OA小鼠的国际骨关节炎研究学会(OARSI)评分(t=4.025,P<0.01)。与OA组相比,OAL组IFP-SCS的迁移能力增加(t=-5.142,P<0.001),同时软骨中基质细胞衍生因子(SDF-1)和IFP-SCs中C-X-C趋化因子受体4(CXCR4)的表达增加(t=-4.403,P<0.01)。此外,机械加载使软骨分化中重要的转录因子SRY相关高迁移率族盒蛋白9(SOX9)上调,促进了IFP-SCs软骨分化(t=-11.170,P<0.01)。结论:机械加载通过促进IFP-SCs迁移和软骨分化,促进骨关节炎小鼠软骨修复。

人皮下和髌下脂肪垫干细胞治疗大鼠骨关节炎的疗效比较

目的比较人皮下和髌下脂肪垫干细胞体外增殖、成软骨分化潜能以及体内治疗大鼠骨关节炎的疗效差异。方法获取上海市东方医院未患代谢性相关疾病患者的皮下和髌下脂肪垫组织,从髌下脂肪垫中分离原代脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs),体外诱导成脂、成骨、成软骨方向分化。EdU检测人皮下脂肪干细胞(subcutaneous ASCs,Sc-ASCs)和髌下脂肪垫干细胞(infrapatellar fat pad derived stem cells,IPFP-ASCs)体外增殖能力,流式细胞术检测干细胞表面标记蛋白CD34、血管相关标记蛋白CD31的表达。阿尔新蓝染色及Western blot检测Sc-ASCs和IPFPASCs体外成软骨潜能。体内实验采用8周SD大鼠随机分为对照(control,CON)组、内侧半月板不稳术(destabilisation of the medial meniscus,DMM)组和DMM手术后Sc-ASCs治疗组,DMM手术后IPFP-ASCs治疗组,通过大体观察、番红固绿染色及OARSI评分比较体内治疗效果。结果人髌下脂肪垫组织中分离获得ASCs,形态呈长梭形,在体外具有成脂、成骨、成软骨分化潜能。Sc-ASCs和IPFP-ASCs表面标记蛋白CD34和血管相关标记蛋白CD31表达无显著性差异,但人IPFP-ASCs体外增殖能力较强。阿尔新蓝染色及Western blot显示IPFP-ASCs体外成软骨能力较强。体内大鼠实验大体形态学观察显示DMM组骨赘增多,软骨表面缺损,Sc-ASCs治疗组骨赘减少,IPFP-ASCs治疗组表面较光滑,无明显骨赘生成;番红固绿染色显示DMM组软骨层出现垂直裂缝且到达钙化软骨,Sc-ASCs治疗组关节面纤维化且软骨浅表层存在垂直裂隙,IPFP-ASCs治疗组软骨层较为连续,仅存在轻微纤维化;OARSI评分显示IPFP-ASCs治疗骨关节炎疗效更好。结论人IPFP-ASCs体外增殖能力、成软骨分化潜能以及体内治疗大鼠骨关节炎的效果优于Sc-ASCs。

膝关节骨性关节炎患者关节液对髌下脂肪垫间充质干细胞的影响

目的研究膝关节骨性关节炎患者关节液对髌下脂肪垫间充质干细胞(Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cells,IPFP-MSCs)的影响。方法体外分离、培养IPFP-MSCs,分别采用DMEM/F-12培养基(或成软骨诱导培养基+DMEM/F-12培养基)、生长培养基(或成软骨诱导培养基)、膝关节骨性关节炎关节液条件培养基(或成软骨诱导培养基+骨关节炎关节液)对IPFP-MSCs进行处理。采用CCK-8和结晶紫染色检测细胞增殖能力,划痕试验和Transwell试验检测细胞迁移能力,免疫荧光染色、Western Blot法、RT-PCR法检测PCNA、CXCR4基因表达,SA-β-Gal染色检测出现的衰老细胞,阿利新蓝染色对处理后的IPFP-MSCs成软骨分化能力进行鉴定。结果与DMEM/F-12培养基处理的IPFP-MSCs相比,骨性关节炎关节液条件培养基中的IPFP-MSCs生长更为密集,单位时间内迁移的细胞数增多,蓝染的衰老细胞数减少。骨性关节炎关节液条件培养基组PCNA基因表达量显著上升,CXCR4基因表达量降低。诱导培养基+骨性关节炎关节液组的阿利新蓝染色较其他组颜色更深,范围更广。结论膝关节骨性关节炎患者的关节液能够促进IPFP-MSCs增殖和迁移,并对诱导其成软骨分化具有协助作用。