白细胞介素18经toll样受体4/髓样细胞分化因子88/核转录因子-κB通路促进支气管平滑肌细胞增殖与迁移

目的 探讨白细胞介素18 (IL-18)经toll样受体4 (TLR4)/髓样细胞分化因子88 (MyD88)/核转录因子-κB(NF-κB)通路促进支气管平滑肌细胞(BSMC)增殖与迁移。方法 采用不同浓度IL-18、不同时间处理BSMC,确定实验条件。细胞计数试剂盒(CCK-8)测定细胞活性,Transwell小室检测细胞迁移,Western blot法检测相关蛋白的表达。抑制剂Eritoran特异性阻断TLR4/MyD88/NF-κB通路,检测TLR4/MyD88/NF-κB通路阻断后对细胞周期、细胞增殖、细胞迁移及TLR4/MyD88/NF-κB通路相关蛋白的表达的影响。结果 IL-18可促进支气管平滑肌细胞细胞增殖,提高细胞迁移能力,上调TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白水平(P<0.05)。Eritoran可抑制IL-18引起的BSMC细胞增殖,上调G1期细胞百分比,下调S期、G2期细胞百分比,抑制细胞迁移,降低TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白水平(P<0.05)。结论 IL-18可能通过上调TLR4/MyD88/NF-κB通路中信号分子的表达,促进了平滑肌细胞增殖和迁移。

Toll样受体4、核因子-κb通路在溃疡性结肠炎发病机制中的应用

目的:通过研究Toll样受体4(Toll-like receptor,TLR4)、髓样分化分子88(myeloid differentiation factor,Myd88)、核因子-κb(nuclear factor-κb,NF-κb)在溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)大鼠模型结肠组织中的表达以及外周血中白细胞介素1(interleukin-1,IL-1)的表达水平,探讨TLR4/NF-κb信号通路在UC发病中的作用。方法:将健康SD大鼠40只随机分为模型组(A组)和正常对照组(B组),每组各20只,运用复合法(三硝基苯磺酸+乙醇)制备细胞免疫反应性UC大鼠模型,造模成功后,进行大体形态损伤评分,HE染色观察大鼠结肠黏膜组织学改变,采用RT-PCR法检测UC各组大鼠结肠黏膜组织中TLR4、Myd88和NF-κb表达,采用ELISA法检测外周血中IL-1的表达。结果:与B组比较,A组大鼠结肠黏膜大体形态评分、组织学损伤评分、结肠黏膜组织中TLR4、Myd88和NF-κb的表达及外周血中IL-1的表达均显著增高(P<0.01)。结论:UC大鼠模型中TLR4、Myd88、NF-κb和IL-1的表达明显升高,TLR4可能通过介导NF-κb引发信号通路下游的基因表达,从而导致炎症因子的释放。

静脉注入胆红素对新生大鼠脾髓样分化因子88和白细胞介素1受体相关激酶-4蛋白表达的影响

目的建立新生大鼠高胆红素血症模型，探讨静脉注入胆红素对脾髓样分化因子88（myeloiddifferentiationfactor88，MyD88）和白细胞介素1受体相关激酶-4（interleukin-1 receptor associ-ated kinase-4，IRAK-4）蛋白表达的影响。方法选用清洁级7～8d新生SD大鼠，雌雄不限，体重12．0～15．0g，采用随机抽签法随机分为空白对照组（I）、脂多糖（1ipopolysaccharide，LPS）对照组（II）、15mg／kg胆红素对照组（11I）、15mr／kg胆红素＋LPS组（1Va）、30mg／kg胆红素＋LPS组（IVb）和50mr／蝇胆红素＋LPS组（IVC），共6组，每组设置2h、5h、24h三个时间点，每个时间点8只。颈静脉注射不同剂量胆红素（15mr／kg、30mr／kg和50mr／kg）建立新生SD大鼠高胆红素血症模型，1h时腹腔注入LPS1mg／kg。在注入胆红素后2h、5h、24h取脾脏，采用免疫组织化学法检测脾MyD88和IRAK-4蛋白的表达。结果（1）LPS可促进脾细胞MyD88和IRAK-4表达（qMyD882h=49．89，qMyD885h=139．54，qIRAK-42h=7．93，qIRK45h=24．30，qIRAK-424h=6．97，P〈0．01）。（2）低浓度胆红素单独作用可促进脾细胞MyD88表达，抑制IRAK-4表达（qMyD882h=0．76，qMyD885h=5．05，qIRAK42h=6．43，qIRAK45h=22．37，qIRAK-424h=1．50，P〈0．01）。（3）低浓度胆红素对LPS刺激MyD88表达的影响不明显（q2h=1．48，q5h=1．45，q24h=0．10，P〉0．05），中、高浓度胆红素对LPS刺激MyD88表达有抑制作用（qⅣb2h=42．87，qⅣc2h=51．38，qⅣb5h=103．61，qⅣc5h=115．44，qⅣb24h=1．18，qⅣc24h=11．66，P〈0．01）。（4）低、中、高浓度胆红素对LPS刺激IRAK-4表达均有抑制作用（qⅣa2h=9．52，qⅣb2h=14．39，qⅣc2h=25．55，qⅣa5h=38．83，qⅣb5h=54．62，qⅣc5h=60．51，qⅣa24h=2．41，qⅣb24h=1．47，qⅣc24h=7．61，P〈0．01）。（5）胆红素对MyD88、IRAK-4的抑制作用，2h时即可观察到，5h时作用明显，24h时低、中浓度胆红素的抑制作用消失，高浓度胆红素的抑制作用仍然存在（P〈0．01）。（6）MyD88、IRAK_4表达水平与胆红素浓度呈负相关（r，mD882h=一0．86，rsMyD885h=一0．92，FsMyD8824h=一0．53，rmAK-42h=一0．82，rsIRAK-45h=一0．86，rmAK-424h=一0．57，P〈0．01）。（7）在胆红素和LPS作用下，脾细胞MyD88和IRAK4表达水平呈正相关（r2h=0．77，r5h=0．9，F24h=0．67，P〈0．01）。结论胆红素可抑制MyD88和IRAK-4蛋白的表达，浓度越高抑制作用越明显，持续时间越长。提示胆红素影响新生大鼠免疫功能的机制可能与调节Toll样受体4信号通路中MyD88和IRAK-4的表达有关。

MyD88通路关键因子IRAK1、IRAK4和TRAF6在尖锐湿疣组织中的表达

目的观察尖锐湿疣患者皮损组织中MyD88通路关键因子白介素-1受体相关激酶-1(IRAK1)、白介素-1受体相关激酶-4(IRAK4)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)的表达。方法选取60例尖锐湿疣患者作为观察组,60例正常包皮环切者作为对照组,免疫组化法检测皮损组织中MyD88通路关键因子IRAK1、IRAK4和TRAF6的表达水平,并进行临床分析。结果IRAK1、IRAK4和TRAF6在观察组中普遍呈高表达,所占比例分别为80%、83.3%和91.7%,对照组中无表达或呈低表达,所占比例分别为96.7%、98.3%和100%,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论尖锐湿疣患者皮损组织中MyD88通路关键因子IRAK1、IRAK4、TRAF6的表达显著高于正常对照组。

白细胞介素-37b负反馈调控Toll样受体4信号通路对的人骨性关节炎的保护作用研究

目的探讨白细胞介素-37b(IL-37b)负反馈调控Toll样受体4(TLR4)信号通路对人骨性关节炎(OA)的保护机制。方法常规培养OA软骨细胞,分别用100 nmol·L^-1的pEGFP-IL-37b、pEGFP-IL-37b-NC1、IL-37b-siRNA及IL-37b-siRNA-NC2转染至细胞,并分别记为B、C、D和E组;另取OA软骨细胞仅只加入Lipofectamine 3000试剂作为A组。用酶联免疫吸附法检测细胞中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL^-1β的表达水平,用Western Blotting检测细胞中TLR4、髓样分化因子(MyD88)及核转录因子-κB(NF-κB)蛋白的相对表达水平。结果A,B,C,D和E组的TNF-α分别为(1.01±0),(0.53±0.01),(0.99±0.04),(1.75±0.10)和(1.00±0.01)ng·mL^-1,IL^-1β分别为(0.95±0.03),(0.46±0.13),(0.96±0.05),(1.84±0.09)和(0.96±0.06)ng·mL^-1,TLR4蛋白相对表达量分别为1.00±0.01,0.29±0.04,1.00±0.02,1.81±0.04和1.00±0.01,MyD88蛋白相对表达量分别为1.00±0.02,0.28±0.12,0.96±0.02,1.86±0.07和0.98±0.02,NF-κB蛋白相对表达量分别为0.96±0.03,0.43±0.02,0.97±0.05,1.50±0.05和0.97±0.04,A组的上述指标与B,D组相比,差异均有统计意义(均P<0.05)。结论IL-37b在OA中能够抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的表达,从而抑制炎症的发生。

桂枝芍药知母汤对尿酸钠诱导的大鼠巨噬细胞Toll-MyD88信号通路炎性信号表达的影响

目的:基于Toll-My D88信号通路观察桂枝芍药知母汤对尿酸钠诱导的大鼠巨噬细胞炎性信号表达的影响,以期分析其抗炎的药效作用机制。方法:以尿酸钠混悬液诱导大鼠巨噬细胞制备痛风性关节炎巨噬细胞模型,以桂枝芍药知母汤含药血清进行干预,ELISA法检测白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、钙结合蛋白S100A8的表达,DNA-蛋白质互作ELISA(DPI-ELISA)方法检测核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)活性;Western-Blot法检测髓性分化因子-88(myeloid differentiation factor 88,My D88)信号衔接蛋白、核因子κB酶抑制剂-β(inhibitor kappa B kinaseβ,IKK-β)、核因子κB抑制蛋白α亚基(NF-kappa-B inhibitor alpha,IKB-α)表达水平;逆转录PCR检测Toll样受体-2(toll-like receptor-2,TLR-2)、TLR-4mRNA的表达。结果:尿酸钠混悬液诱导巨噬细胞造模2 h后,模型细胞对照组IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、S100A8含量,NF-κB活性,My D88、IKK-β蛋白表达及TLR-2、TLR-4 mRNA表达较正常细胞对照组显著增高(P<0.05),IKB-α表达较正常细胞对照组显著降低(P<0.05);与模型细胞对照组比较,桂枝芍药知母汤各剂量组细胞表达TLR-2、TLR-4 mRNA水平显著降低(P<0.05);在不加受体抑制剂的实验中,桂枝芍药知母汤各剂量组IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量,My D88、IKK-β蛋白表达水平显著降低(P<0.05),高剂量组NF-κB活性显著降低(P<0.05),高剂量组S100A8、IKB-α表达水平显著升高(P<0.05)。结论:桂枝芍药知母汤抗炎作用机制与降低TLR-2、TLR-4 mRNA表达,抑制My D88、IKK-β蛋白表达,增加S100A8、IKB-α蛋白表达水平,抑制NF-κB激活,进而降低Toll-My D88信号通路相关炎性因子表达密切有关。

胃安除幽汤对Hp阳性慢性胃炎的影响及机制研究

目的:观察胃安除幽汤对幽门螺杆菌(Hp)阳性慢性胃炎患者免疫水平及肠道菌群的影响,并探讨其作用机制。方法:选择Hp阳性慢性胃炎患者180例,随机分为对照组和胃安除幽汤组各90例。两组患者均接受四联疗法,胃安除幽汤组在此基础上联合应用胃安除幽汤治疗,比较两组的症状缓解情况、Hp清除情况、肠道菌群组成、CD4+和CD8+细胞变化情况以及胃黏膜中的髓样分化因子88(MyD88)/白细胞介素受体相关激酶(I-RAK)/核因子-κB(NF-κB)通路转录和翻译水平。结果:治疗后两组的临床症状均有明显缓解(P<0.05),胃安除幽汤组各症状评分均低于对照组(P<0.05);胃安除幽汤组Hp清除率(86.67%)高于对照组(71.67%)(P<0.05);治疗后两组的有益菌(乳酸杆菌和双歧杆菌)含量均升高(P<0.05),且胃安除幽汤组高于对照组(P<0.05);有害菌(大肠杆菌、梭菌、拟杆菌和柔嫩梭菌)水平均降低(P<0.05),且胃安除幽汤组低于对照组(P<0.05);治疗后两组患者的CD4+细胞比例以及CD4+/CD8+比值均升高(P<0.05),且胃安除幽汤组高于对照组(P<0.05);治疗后两组患者胃黏膜中MyD88、I-RAK和NF-κB的mRNA和蛋白表达水平均降低,且胃安除幽汤组低于对照组(P<0.05)。结论:在四联疗法基础上联合胃安除幽汤可改善Hp阳性慢性胃炎患者临床症状,提高Hp清除率,改善机体免疫水平与肠道菌群失衡,其机制可能与抑制MyD88/I-RAK/NF-κB信号通路有关。

加味宣痹汤对急性痛风性关节炎大鼠TLR4/MyD88/IRAK4通路的作用机制

目的:探讨加味宣痹汤治疗急性痛风性关节炎(AGA)的效果及相关作用机制。方法:采用高尿酸血症(HUA)联合AGA的造模方法,以加味宣痹汤对照秋水仙碱作为干预手段。评测干预后各组大鼠左踝关节炎症指数、足肿胀情况;并在取材后,观察大鼠左踝关节滑膜组织形态学炎性病理情况,检测血清中尿酸(SUA)、C-反应蛋白(CRP)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度,以及左踝关节液中TLR4、MyD88、IRAK4 mRNA表达水平。结果:治疗4次后,加味宣痹汤各剂量组大鼠炎症指数、足肿胀水平均显著低于模型组(P<0.05)。与模型组比较,加味宣痹汤各剂量组大鼠血清SUA、CRP、IL-1β、TNF-α水平和关节液TLR4、MyD88、IRAK4 mRNA表达水平显著降低(P<0.05),且加味宣痹汤中、高剂量组大鼠上述指标均低于秋水仙碱组(P<0.05)。HE染色病理切片显示,秋水仙碱组和加味宣痹汤各剂量组大鼠踝关节滑膜组织中炎性细胞数量和血管充血现象明显较少,其中高剂量组与正常组最接近。结论:加味宣痹汤对HUA合并AGA大鼠具有一定的抗炎、消肿、降尿酸作用,其可能是通过抑制TLR4、MyD88、IRAK4的活化,使TNF-α、IL-1β等炎症因子减少释放,从而发挥作用。

基于抗炎作用的三草降压汤对自发性高血压大鼠肾脏的保护机制研究

目的观察三草降压汤对自发性高血压大鼠肾脏组织中Toll样受体4(TLR4)/核转录因子-κB(NF-κB)/Nod样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)信号通路表达的影响,探讨三草降压汤通过干预炎症反应治疗高血压肾损害的分子机制。方法 24只20周龄的雄性SHR大鼠,随机分为模型组、卡托普利组(30mg/kg)、三草降压汤组(10.6g/kg),另选8只同周龄的雄性WKY大鼠作为正常对照组。各组连续灌胃给药12周,分别于给药第4周、第8周和第12周检测各组大鼠血压,并于给药12周后,留取各组大鼠24小时尿液,生化法检测尿微量白蛋白(mAlb)、尿肌酐(UCRE)和尿蛋白(UP)等指标,实验结束后腹主动脉取血,取血清用生化法检测各组大鼠血肌酐(SCRE)、尿素氮(BUN)和血尿酸(UA)等肾功能指标。采用苏木素-伊红(HE)染色观察肾组织病理变化,Masson染色评估肾组织纤维化程度。采用免疫组织化学法(IHC)检测Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)核转录因子-κB(NF-κB)、Nod样受体蛋白3(NLRP3)和白细胞介素-1β(IL-1β)蛋白的表达。采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测单核细胞趋化因子-1(MCP-1)蛋白的表达量。采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测TLR4、NF-κB和NLRP3的蛋白表达情况。结果血压及生化检测结果表明,与正常组相比,模型组的血压显著升高(P<0.01),且mAlb、UCRE、UP、SCRE、BUN和UA等含量均升高(P<0.01);与模型组相比,卡托普利组和三草降压汤组的血压明显下降(P<0.01),mAlb、UCRE、UP、SCRE、BUN和UA等含量均显著降低(P<0.01)。HE染色及Masson染色结果显示,与正常组相比,模型组大鼠肾小球重度萎缩,残余肾小球代偿性肥大,肾小球入球小动脉和小叶间动脉发生重度玻璃样变性、动脉周围重度炎性浸润,肾小球毛细血管壁增厚、管腔狭窄,系膜基质增生明显,肾小管扩张。与模型组相比,三草降压汤组和卡托普利组大鼠肾小球萎缩程度减轻,肾小管无扩张,肾小球动脉周围炎性浸润及玻璃样变性明显减轻。IHC及Western blot检测结果发现,与正常对照组相比,模型组的TLR4、MyD88、NF-κB、NLRP3和IL-1β蛋白的表达量均显著升高(P<0.01);与模型组相比,卡托普利组和三草降压汤组的TLR4、MyD88、NF-κB、NLRP3和IL-1β蛋白的表达量均显著降低(P<0.01)。ELISA检测结果表明,与正常对照组相比,模型组的MCP-1表达量显著升高(P<0.01);与模型组相比,卡托普利组和三草降压汤组的MCP-1表达量明显降低(P<0.01)。结论三草降压汤可通过调控TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路抑制肾脏炎症反应,从而发挥降压及高血压肾损害的保护作用。

基于网络药理学和靶向验证探讨木犀草素治疗结肠癌的作用机制

目的 基于网络药理学和靶向验证探讨木犀草素治疗结肠癌的作用机制。方法 基于网络药理学筛选木犀草素治疗结肠癌的潜在靶点,通过蛋白互作网络进一步筛选核心靶点,基于核心靶点进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析,找到关键的作用通路;根据找到的关键靶点及通路进行在体结肠癌移植瘤模型的药理实验验证。采用ELISA试剂盒检测关键指标的水平,采用苏木精–伊红(HE)染色评价药物对肿瘤的病理学改变,采用免疫组织化学法及免疫印迹法检测肿瘤关键靶蛋白的表达。结果 木犀草素可能主要作用于白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等靶点,影响Toll样受体(TLR)/髓样分化因子88(MyD88)/核因子-κB(NF-κB)信号通路起到治疗肿瘤的效果。实验验证结果显示,木犀草素显著降低了荷瘤小鼠机体的IL-6、IL-1β、TNF-α水平,改善了机体的氧化应激状态[提升超氧化物歧化酶(SOD)水平,降低丙二醛(MDA)水平],抑制了TLR/MyD88/NF-κB信号通路的表达。结论 木犀草素具有显著的抗结肠癌效果,可能是通过降低机体炎症水平、改善氧化应激状态以及抑制TLR/MyD88/NF-κB通路表达实现的。

三黄膏对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌大鼠皮肤软组织感染的干预作用

目的探讨三黄膏对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染大鼠皮肤软组织的干预作用。方法将96只Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、对照组和高、中、低剂量实验组,每组16只。除空白组外,其余大鼠行皮下软组织注射MRSA菌悬液造模。造模成功后,高、中、低剂量实验组分别给予三黄膏1.00、0.50和0.25 g外敷于患处,空白组和模型组均涂抹等量凡士林(1.00 g),对照组给予莫匹罗星0.50 g。6组大鼠每12 h换药1次,连续给药7 d。治疗7 d后处死大鼠,计算创面愈合率,用实时荧光定量聚合酶链反应检测感染组织中白细胞介素-1受体相关激酶1(IRAK-1)和IκB激酶β(IKKβ)mRNA的表达水平,用酶联免疫吸附法检测白细胞介素-6(IL-6)和IL-8的含量。结果治疗7 d后,中、高剂量实验组和对照组、模型组的创面愈合率分别为(88.63±4.54)%、(93.98±3.45)%、(83.02±5.87)%和(60.30±2.30)%,对照组和中、高剂量实验组的创面愈合率与模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。高剂量实验组、对照组、模型组和空白组的IRAK-1 mRNA分别为1.14±0.04、1.18±0.05、1.42±0.05和1.01±0.05,IKKβmRNA分别为1.28±0.04、1.30±0.05、1.62±0.04和1.00±0.04,血清IL-6含量分别为(17.83±0.26)、(17.48±0.14)、(19.32±0.42)和(14.51±0.24)pg·mL^(-1),血清IL-8含量分别为(29.04±0.94)、(29.12±0.90)、(33.13±1.01)和(26.37±1.02)pg·mL^(-1)。高剂量实验组和对照组的上述指标与模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论三黄膏可能通过下调IRAK-1和IKKβ表达,抑制下游炎性分子IL-6和IL-8释放,进而发挥抗炎作用,促进感染创面愈合。