髓样相关蛋白14真核表达载体的构建及其细胞内定位研究

目的:构建小鼠髓样相关蛋白14(MRP14)的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达定位情况。方法:提取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增得到MRP14编码序列。然后将该编码序列克隆到带有血凝素(HA)标记的载体pcDNA3-HA上,随后转染NIH3T3细胞,在荧光显微镜下观察结果。结果:重组质粒经聚合酶链反应(PCR)、酶切和测序鉴定证明构建正确。转染实验发现,该质粒能够在NIH3T3细胞中表达,表达产物主要定位在细胞质中。结论:成功构建带HA标签的MRP14真核表达载体。该载体能在哺乳动物细胞中有效表达并正确定位,为下一步深入研究MRP14作用细胞的信号通路提供了一个重要工具。

急性冠状动脉综合征患者髓样相关蛋白8/14水平及其临床意义

目的探讨急性冠状动脉综合征(ACS)患者髓样相关蛋白8/14(MRP 8/14)水平及其临床意义。方法选择100例ACS患者为研究组,100例健康体检者为对照组。比较两组血清MRP 8/14的表达水平。采用受试者工作特征(ROC)曲线判断MRP 8/14对ACS的诊断价值。根据最佳临界值将ACS患者分为MRP 8/14低值组和MRP 8/14高值组,比较两组的临床资料和死亡情况。采用Cox模型分析MRP 8/14对ACS患者随访期间死亡的影响。结果研究组MRP 8/14表达水平高于对照组(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,MRP 8/14诊断ACS的曲线下面积为0.793(P<0.05),最佳临界值为1 526.2 ng/ml。MRP 8/14高值组患者年龄、糖尿病比例、Killip分级>1比例、肌酸激酶同工酶MB峰值和心肌肌钙蛋白T峰值均高于低值组(P<0.05)。随访1年,MRP 8/14低值组死亡比例低于MRP 8/14高值组(P<0.05)。Cox分析结果显示,MRP 8/14水平升高为ACS患者随访期间死亡的危险因素(P<0.05)。结论 MRP 8/14在ACS患者中表达上调,其对诊断ACS及评估预后有重要意义。

术前血清磷酸甘油酸激酶1、髓样相关蛋白8/14水平与前列腺癌根治术患者预后和生存情况相关性研究

目的:探讨术前血清磷酸甘油酸激酶1(PGK-1)、髓样相关蛋白8/14(MRP8/14)水平与前列腺癌根治术患者预后以及术后生存情况的相关性。方法:选择80例前列腺癌根治术患者以及同期健康体检的100例健康者作为研究对象,所有研究对象均检测空腹血清中PGK-1和MRP8/14水平,其中前列腺癌患者于术前和术后1个月时检测。分析血清PGK-1和MRP8/14水平与前列腺癌根治术患者预后和总生存期(OS)、无进展生存期(PFS)的相关性。结果:前列腺癌组术前血清PGK-1和MRP8/14水平均显著高于健康组,术后1个月时血清PGK-1和MRP8/14水平均显著低于术前(均P<0.05)。复发患者术前血清PGK-1和MRP8/14水平均显著高于未复发患者(均P<0.05)。Log-Rank检验发现,血清PGK-1和MRP8/14低水平前列腺癌根治术患者PFS显著长于高水平患者(均P<0.01),血清PGK-1和MRP8/14低水平前列腺癌根治术患者OS也显著长于高水平患者(均P<0.01)。结论:术前血清PGK-1和MRP8/14水平均可能作为评估前列腺癌根治术患者预后和生存期的重要指标,高水平患者通常手术治疗预后较差。

MRP8、MRP14及MRP8/14促进体外培养的小鼠骨髓来源树突状细胞的表型成熟

目的探讨髓样相关蛋白8(MRP8)、MRP14及其异二聚体MRP8/14对小鼠骨髓源性树突状细胞(BMDC)表型成熟的影响。方法体外培养及纯化小鼠BMDC,分为对照组、1μg/m L MRP14处理组、1μg/m L MRP8处理组、1μg/m L MRP8/14处理组。采用流式细胞术检测刺激后BMDC表面共刺激分子CD40、CD80、CD86、主要组织相容性复合体Ⅱ(MHCⅡ)的表达情况。结果 MRP14、MRP8及MRP8/14均能促进BMDC表面共刺激分子CD40、CD80、CD86表达,MRP14、MRP8均能促进BMDC表面共刺激分子MHCⅡ表达,且MRP14和MRP8/14促进BMDC表达CD80、CD86的能力强于MRP8。结论 MRP14、MRP8及MRP8/14通过增加BMDC表面共刺激分子的表达而促进BMDC的表型成熟,且MRP8、MRP14及MRP8/14三者促进DC表达各种共刺激分子的能力不同。

p38 MAPK在MRP8/14诱导小鼠胚胎成纤维细胞凋亡中的作用

目的探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)对髓样相关蛋白8(MRP8)/髓样相关蛋白14(MRP14)诱导小鼠胚胎成纤维细胞凋亡的影响。方法制备MRP8、MRP14、MRP8/14备用。分别取p38^(+/+)和p38-/-细胞,随机分为空白对照组、MRP8组、MRP14组、MRP8/14组。MRP8组、MRP14组、MRP8/14组分别加入50μg/m L MRP8、MRP14和MRP8/14。空白对照组加入等体积的DMEM培养液。各组干预24、48 h,采用MTT法检测p38^(+/+)和p38-/-细胞活力。采用流式细胞术检测空白对照组及MRP8/14干预24、48 h组p38^(+/+)和p38-/-细胞凋亡率。采用MTT法检测空白对照组、MRP8/14组以及TLR4受体抑制剂TAK242或RAGE中和抗体处理的MRP8/14(分别设为MRP8/14+TAK242组、MRP8/14+RAGE组)干预24 h p38^(+/+)细胞活力。采用MTT法和流式细胞术检测空白对照组、MRP8/14组以及p38激酶抑制剂SB203580处理的MRP8/14(设为MRP8/14+SB203580组)干预24 h p38^(+/+)细胞活力和凋亡率。采用Western blotting法检测MRP8/14干预0、1、2、4、6、8 h p38^(+/+)细胞p38 MAPK磷酸化。结果 MRP8组、MRP14组、MRP8/14组干预24、48 h p38^(+/+)、p38-/-细胞活力均低于空白对照组(P均<0.05),但无论MRP8/14组干预24 h还是48 h,p38-/-细胞活力明显高于p38^(+/+)细胞(P均<0.05)。MRP8/14干预24、48 h组p38^(+/+)细胞凋亡率均高于空白对照组,且MRP8/14干预48 h组细胞凋亡率更高(P均<0.05);而MRP8/14干预24、48 h组p38-/-细胞凋亡率均未见明显变化(P均>0.05)。MRP8/14组、MRP8/14+RAGE组干预24 h p38^(+/+)细胞活力低于空白对照组、MRP8/14+TAK242组干预24 h(P均<0.05)。MRP8/14+SB203580组干预24 h p38^(+/+)细胞活力较MRP8/14组干预24 h明显升高,细胞凋亡率较MRP8/14组干预24 h明显降低(P均<0.05)。MRP8/14干预2、4、6 h p38^(+/+)细胞p38 MAPK磷酸化水平明显高于干预0、1、8 h(P均<0.05)。结论 p38 MAPK能促进MRP8/14诱导的小鼠成纤维细胞凋亡,其机制可能与TLR4-p38 MAPK信号通路激活有关。

髓样相关蛋白8／14水平在前列腺癌诊断及预后中的意义

目的探讨髓样相关蛋白8／14（MRP8／14）在前列腺癌诊断及预后判断中的意义。方法回顾性分析2012年10月至2014年10月收治的150例前列腺癌患者的病例资料，年龄（66．4±8．5）岁；150例良性前列腺增生（BPH）患者，年龄（66．8±7．4）岁。根据年龄匹配正常人群150例，年龄（66．5±7．8）岁。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测各组受试者血清中MRP8／14的表达情况。采用受试者工作特征曲线（ROC）预测MRP8／14对前列腺癌的诊断价值，根据临界值将前列腺癌患者分为MRP8／14低值组（〈临界值）和MRP8／14高值组（≥临界值），比较两组患者的临床资料和生存情况。结果正常人、BPH患者和前列腺癌患者的MRP8／14水平分别为（966．7±152．8）ng／ml、（1207．0±190．6）ng／ml和（2833．3±1101．5）ng／ml，前列腺癌患者的MRP8／14水平明显高于正常人和BPH患者，差异有统计学意义（P〈0．05）。ROC曲线分析MRP8／14对前列腺癌的诊断价值的曲线下面积（AUC）为0．887（95％C10．841—0．934），差异有统计学意义（P〈0．05）；临界值为2845．7ng／ml，诊断前列腺癌的特异性为76．4％、敏感性为85．1％。MRP8／14低值组88例，MRP8／14高值组62例。与MRP8／14低值组比较，MRP8／14高值组的美国东部肿瘤协作组活动状态1分、Gleason评分8～10分、涉及器官数〉2个和临床肿瘤分期〉m期的患者更多，前列腺特异性抗原（PSA）、乳酸脱氢酶（LDH）、碱性磷酸酶（AKP）、C反应蛋白（CRP）水平更高（P〈0．05）。对前列腺癌患者平均随访2年，32例患者死亡，其中MRP8／14低值组死亡12例，病死率为13．6％；MRP8／14高值组死亡20例，病死率为32．2％。Kaplan—Meier生存函数曲线表明，MRP8／14低值组和MRPS／14高值组的2年生存率分别为86．4％和67．8％，差异有统计学意义（x。=10．403，P〈0．05）。Cox回归分析结果表明，在校正了可能与病死率相关的危险因素后，MRP8／14仍是前列腺癌患者随访期间死亡的独立预测因子，与MRP8／14低值组比较，MRPS／14高值组患者随访期间死亡危险比为2．567（95％CI1．740—4．816，P〈0．001）。结论MRP8／14在前列腺癌患者血清中明显上调，与前列腺癌患者的临床分期及预后密切相关，是与前列腺癌患者随访期间死亡密切相关的独立危险因素。

咯利普兰通过NF-κB抑制MRP8/14在RAW264.7细胞中促炎性因子的释放

目的:探讨PDE4抑制剂咯利普兰抑制髓样相关蛋白8/14(MRP8/14)对小鼠巨噬细胞系RAW264.7中促炎性因子释放的刺激作用,并研究核因子κB(NF-κB)在其中的作用。方法:MRP8/14刺激RAW264.7细胞,采用液相芯片技术和实时荧光定量PCR(q PCR)技术分别检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)的蛋白和mRNA水平;咯利普兰预处理RAW264.7细胞后,MRP8/14刺激细胞,采用液相芯片技术和q PCR技术分别检测TNF-α和IL-6的蛋白水平和mRNA水平;Western blot法检测NF-κB P65蛋白磷酸化水平;间接免疫荧光法检测RAW264.7细胞内NF-κB P65蛋白核移位情况。结果:液相芯片及q PCR结果显示MRP8/14具有很强的促炎性因子TNF-α和IL-6释放的作用(P<0.01),而咯利普兰可以显著减弱MRP8/14促炎性因子释放的作用(P<0.05)。此外,MRP8/14能够诱导NF-κB P65蛋白发生磷酸化,胞核中P65蛋白增加;而咯利普兰显著减弱NF-κB P65蛋白磷酸化(P<0.05)。结论:咯利普兰可能通过NF-κB途径显著减弱MRP8/14的促炎作用。

NF-κB介导MRP8/14诱导的人肺泡上皮A549细胞凋亡

目的:探讨髓样相关蛋白8/14(MRP8/14)对人肺泡上皮A549细胞存活及凋亡的影响,并研究核因子κB(NF-κB)在其中的作用。方法:MRP8/14以不同剂量或刺激时间处理A549细胞,CCK-8法检测其对细胞活力的影响;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot法及间接免疫荧光法检测A549细胞内NF-κB p65蛋白核移位情况;Western blot法检测NF-κB p65蛋白磷酸化水平;使用NF-κB特异性抑制剂Bay 11-7082探讨NF-κB在凋亡过程中的作用。结果:MRP8/14能以剂量和时间依赖的方式影响A549细胞的存活(P<0.05),流式细胞技术检测结果表明MRP8/14处理后A549细胞凋亡率明显增加(P<0.01)。此外,MRP8/14能够诱导NF-κB p65蛋白发生显著磷酸化,并移位至细胞核中,NF-κB信号通路明显激活,而NF-κB特异性抑制剂Bay 11-7082能够明显抑制MRP8/14诱导的细胞凋亡(P<0.01)。结论:NF-κB在MRP8/14所导致的肺泡上皮细胞凋亡过程发挥了重要作用。

MRP8/MRP14诱导腹腔巨噬细胞释放炎性细胞因子

目的探讨MRP8/MRP14诱导小鼠腹腔巨噬细胞细胞因子表达效应及其作用机制。方法 Luminex x MAP液相芯片系统检测重组MRP8/MRP14蛋白诱导腹腔巨噬细胞6种细胞因子/趋化因子的水平变化;MRP14不同结构域融合蛋白刺激细胞,检测TNF-α、IP-10和IL-6表达;Western blot检测MRP8/MRP14刺激细胞p38 MAPK、JNK和ERK激酶磷酸化变化;细胞预先用p38 MAPKs、JNK、ERK激酶抑制剂、TLR4和RAGE受体拮抗剂预处理,之后给予MRP8/MRP14蛋白刺激,检测TNF-α、IP-10和IL-6表达。结果 MRP8/MRP14能显著诱导TNF-α、IP-10和IL-6的表达,与对照组相比,蛋白表达水平分别升高约98.2、378.6和6.3倍(P<0.01),MRP8/MRP14不能诱导IL-2、IL-5和IFN-g的表达;MRP14全长及其结构域EFhand-1、EFhand-2及EFhand-1+2融合蛋白能够诱导TNF-α、IP-10和IL-6的表达(P<0.01),CT末端结构域不具有诱导活性;MRP8/MRP14刺激细胞后1 h p38 MAPK、JNK及ERK激酶发生显著磷酸化变化,持续至2 h;与单纯MRP8/MRP14组相比,p38 MAPK抑制剂SB203580显著抑制TNF-α、IP-10和IL-6的表达(P<0.05);JNK抑制剂SP600125显著抑制TNF-α和IP-10的表达(P<0.05),对IL-6的表达无影响;ERK及其上游MEK1/2的抑制剂PD98059和U0126显著抑制IL-6的表达(P<0.05);TLR4抑制剂TAK242抑制了MRP8/MRP14诱导的TNF-α、IP-10和IL-6的表达(P<0.05),而RAGE中和性抗体仅部分抑制MRP8/MRP14诱导的IL-6的表达(P<0.05)。结论 MRP8/MRP14能够诱导小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α、IP-10和IL-6的表达;MRP蛋白以包含有钙离子结合基序的结构域具有诱导细胞因子表达的活性;TNF-α和IP-10的表达与TLR4受体及其下游的p38 MAPKs、JNK通路有关,IL-6的表达则同时由TLR4和RAGE受体介导,继而激活下游的p38 MAPKs和ERK信号通路。

MRP8/MRP14对宫颈癌细胞增殖的影响及机制

目的探讨髓样相关蛋白8/14异源二聚体(MRP8/MRP14)对宫颈癌细胞增殖的影响及机制。方法体外培养人宫颈癌Hela细胞,加入MRP8/MRP14(观察组),另设对照组加入等体积PBS,于培养12、24、48、72 h分别采用CCK8法检测两组细胞增殖能力。取Hela细胞进行核质分离,加入MRP8/MRP14共培养30 min,采用Western blot法检测细胞凋亡相关信号通路蛋白p38 MAPK、JNK及细胞增殖相关信号通路蛋白ERK1/2、NF-κB表达。将Hela细胞分为MRP8/MRP14组和p38 MAPK、JNK、ERK1/2、NF-κB抑制剂组,RP8/MRP14组加入MRP8/MRP14;抑制剂组先分别加入p38 MAPK、JNK、ERK1/2、NF-κB抑制剂预处理2 h,再加入MRP8/MRP14;采用CCK8法观察各组细胞增殖能力。结果观察组加入MRP8/MRP14培养12、24、48、72 h后,细胞增殖能力均高于对照组,且随时间延长,细胞增殖能力逐渐增强(P均<0.05)。观察组加入MRP8/MRP14培养30 min后,与对照组比较,p38 MAPK、JNK、ERK1/2活性明显升高,NF-κB在细胞核中的表达升高(P均<0.05)。p38 MAPK、JNK抑制剂组细胞增殖能力较MRP8/MRP14组增强;ERK、NF-κB抑制剂组细胞增殖能力较MRP8/MRP14组减弱(P均<0.05)。结论 MRP8/MRP14能够促进Hela细胞增殖,其机制与p38 MAPK、JNK、ERK1/2及NF-κB等多条相关信号通路被激活有关。

血清AGR2、PGK1、MRP8/14表达情况与前列腺癌患者术后疗效评估及生存情况的相关性

目的:探讨血清前梯度蛋白2(AGR2)、磷酸甘油酸激酶1(PGK-1)、髓样相关蛋白8/14(MRP8/14)表达情况与前列腺癌(PCa)患者术后疗效评估及生存情况的相关性。方法:选取2016年1月至2017年1月收治的83例PCa患者为PCa组,另选取64例良性前列腺增生(BPH)患者为BPH组,50例健康男性为对照组,测定所有研究对象血清AGR2、PGK1、MRP8/14水平,分析其与PCa患者术后疗效及生存情况相关性。结果:PCa组血清AGR2、PGK1、MRP8/14水平明显高于BPH组、对照组(P<0.05);PCa患者血清AGR2水平与前列腺特异性抗原(PSA)水平、分化程度、淋巴结转移、骨转移、TNM分期有关,血清PGK1水平与PSA水平、淋巴结转移、侵袭、骨转移、TNM分期有关,血清MRP8/14水平与PSA水平、淋巴结转移、骨转移、TNM分期有关(P<0.05);PCa组术后血清AGR2、PGK1、MRP8/14水平明显降低(P<0.05);随访9~35个月,平均(22.48±4.27)个月,Kaplan-Meier生存曲线显示,高血清AGR2、PGK1、MRP8/14水平组总生存率明显低于低血清AGR2、PGK1、MRP8/14水平组(P<0.05);多因素Cox回归分析显示,PSA(HR=0.356,95%CI=0.372~0.953)、骨转移(HR=1.642,95%CI=1.025~2.615)、AGR2(HR=3.441,5%CI=0.085~23.154)、PGK1(HR=4.386,5%CI=0.924~20.536)、MRP8/14(HR=2.758,95%CI=1.035~20.625)为PCa患者预后风险因素(P<0.05);ROC曲线显示,血清AGR2+PGK1+MRP8/14水平(AUC=0.911,95%CI=0.850~0.954)诊断PCa的敏感度、特异度、准确度高于AGR2(AUC=0.783,95%CI=0.704~0.850)、PGK1(AUC=0.794,95%CI=0.716~0.859)、MRP8/14(AUC=0.770,95%CI=0.689~0.838)单独诊断。结论:血清AGR-2、PGK1、MRP8/14水平变化与PCa患者术后疗效和生存情况密切相关,联合检测进而提升PCa诊断价值。