趋化因子新变异体MPIF-1β重组蛋白的纯化和活性分析

目的 为深入研究趋化因子新变异体MPIF 1β的结构与功能 ,利用pKPL3a MPIF 1β表达质粒进行原核表达、纯化工艺研究及活性检测。方法 MPIF 1β重组蛋白以包涵体形式存在 ,占总菌体蛋白的 15 % ,工程菌经超声破碎 ,包涵体洗涤 ,变性、复性、肝素SepharoseCL 6B亲和层析 ,CMSepharoseFastFlow和SephacrylS 2 0 0层析分离获得目的蛋白。结果 还原SDS PAGE分析相对分子质量 15 0 0 0u ,纯度 99.0 % ,纯化倍数 6 .6倍 ,总回收率 9.0 7%。体外生物学活性检测证明MPIF 1β重组蛋白对小鼠骨髓集落形成具有抑制作用 ,对U937细胞具有趋化活性 ,且呈一定的剂量依赖关系。结论 建立了简便可行的MPIF 1β重组蛋白纯化路线 ,初步证明了MPIF

软骨脱细胞基质多孔支架与骨髓基质干细胞体外构建组织工程软骨的研究

目的探讨关节软骨脱细胞基质多孔支架（CEDPS）与骨髓基质干细胞（BMSCs）体外培养组织工程软骨的可行性。方法粉碎人关节软骨，脱细胞处理后差速离心法收集细胞外基质悬液，采用冷冻干燥技术制备三维多孔支架。扫描电镜观察其微观结构，并进行组织学观察，生化成分定量检测其胶原、氨基葡聚糖（GAG）、DNA含量，生物力学方法测量其干性及覆水状态下压缩弹性模量；分离培养犬骨髓基质干细胞，TGF－β1成软骨诱导，PKH26标记，接种到支架卜体外继续诱导培养，荧光显微镜及扫描电镜观察培养3d后细胞在支架内的黏附、分布情况。结果制备的CEDPS支架无细胞碎片残留，软骨细胞外基质特异性染色阳性，具有相互贯通的三维孔隙结构；支架生化成分定量检测：总胶原含量为（708．2±44．7）μ/mg，GAG含量为（254．7±25．9）μ/mg，DNA含量为（0．021±0．007）μ/mg；支架纵向压缩弹性模量E=（1．226±0．288）MPa，覆水后压缩弹性模量E＝（0．052±0．007）MPa。荧光显微镜、电镜检查结果表明细胞广泛均匀的分布在支架内部，呈圆形或椭圆形，在支架上增殖显著，细胞基质分泌明显。结论CEDPS支架在生化组成和结构上与软骨细胞外基质成分类似，去细胞彻底，具有良好生物力学特性，是一种较为理想的软骨组织工程支架载体；成软骨诱导的BMSCs与CEDPS支架在体外可初步构建类软骨样组织。

自体骨髓间充质干细胞治疗矽肺的观察

目的 探讨自体骨髓问充质干细胞（BMSCs）移植治疗矽肺的安全性和治疗作用。方法选取我院确诊的10例矽肺患者，经医学伦理委员会批准，患者签署知情同意书后，无菌抽取患者骨髓液100ml，体外分离、纯化培养BMSCs，收获第3代BMSCs5×10^7个，细胞质量检测合格后，坩生理盐水50ml稀释，静脉滴注回输，每周1次，连续3次，其中3例患者采用肝细胞生长闪子（HGF）基因修饰的自体BMSCs输注。移植后6个月、9个月，观察患者的临床症状、胸部cT、x线胸片、肺功能、T细胞亚群、血清中IgG、铜蓝蛋白（CP）等指标。结果治疗9个月后，所有患者咳嗽、咳痰、胸闷症状基本消失；肺功能：最大肺活量（FVC）从治疗前平均（71．2％±17．O％）提高到（84．0％±10．9％），第1秒最大呼气最（FEV。）从治疗前平均（67．5％±17．7％）提高到（80．6％±14．9％），与治疗前比较，差异有统计学意义（P〈0．（）1）；血清中cP和lgG较治疗前明显下降，差异有统计‘学意义（P〈O．01）；采用HGF基『太J修饰的自体BMSCs治疗的患者胸片和肺部cT提示有不同程度好转，肺纹理较治疗前减少、清晰，双肺结节影较治疗前缩小，边缘较治疗前清晰，结节影密集及分布均较治疗前有所减少。结论自体BMSCs移植治疗矽肺对临床症状改善有一定效果，HGF基因修饰的自体BMSCs可使小结节影缩小，略有变淡，肺纹理较治疗前减少。

他克莫司诱导的骨髓间充质干细胞成骨细胞分化和体内骨形成

目的研究免疫抑制剂他克莫司(FK506)对大鼠骨髓来源的间充质干细胞(MSC)的成骨细胞分化诱导,及对 MSCs 结合多孔β三磷酸钙(β-TCP)的体内成骨作用。方法原代 MSCs 按实验目的随机分组。对照组生长培养液中加入 L-抗坏血酸-2-磷酸(AsAp)和β-甘油磷酸(β-GP);FK506处理组在对照组基础上加入50 nmol/L FK506。实验分成体外体内两部分相继进行。体外实验细胞分别于培养第4、8、12、16大时行碱件磷酸酶(APase)活性,钙含量,扫描电镜和骨钙素 mRNANorthern 印迹分析;体内实验将细胞载入多孔β-TCP 立方块形成 MSCs/β-TCP 复合物,继续成骨诱导培养2周后植入大鼠背部皮下,4周和8周后取出复合物作组织学检查。结果 FK506处理组碱性磷酸酶活性、钙含量、骨钙素 mRNA 均明显高于对照组(均 P<0.05);体内成骨情况亦明显优于对照组。结论免疫抑制剂 FKS06能显著促进大鼠骨髓来源间充质干细胞(MSCs)的体外成骨细胞分化和动物体内继续成骨的作用,并提示 FK506可作为一种新型成骨生长因子,在临床有潜在的应用价值。

骨髓间充质干细胞诱导兔椎管成形的实验观察

目的利用胶原蛋白海绵组织工程支架复合骨髓间充质干细胞构建组织工程骨，观察其植入动物体内后人工椎板的生成情况。方法抽取2周龄新西兰大耳白兔骨髓血，通过离心贴壁法获取骨髓间充质干细胞，经培养扩增后行成骨诱导，并将诱导所得成骨细胞定植于胶原蛋白海绵上，构建组织工程骨。取3—4月龄新西兰大耳白兔48只，随机分为空白对照组（A组）、胶原蛋白海绵组（B组）和胶原蛋白海绵组织工程骨组（C组），每组16只，构建全椎板切除减压动物模型。结果CT检测发现胶原蛋白海绵组织工程骨组于术后4周即有明显新骨生成，至第8周新生椎板与正常骨组织显影类似，而其余两组均无新生骨生成。组织学检测发现术后第2周手术区局部大量纤维组织增生，第4周可见空白对照组已有部分纤维组织长入椎管，B组和C组均无纤维组织进入椎管，且后者已有新生骨组织生成。结论利用胶原蛋白海绵支架复合骨髓间充质干细胞构建组织工程骨，应用于全椎板切除减压动物模型中可成功构建人工椎板，从而及时有效的恢复了椎管的解剖结构。

聚乙二醇-骨形态发生蛋白-2-聚乳酸/聚已内酯载基因仿生骨促进骨缺损修复的实验观察

目的 观察聚乙二醇（PEG）/骨形态发生蛋白（BMP）-2纳米基因复合物及载基因仿生骨与骨髓间充质干细胞（BMSCs）对骨缺损修复的共同作用.方法 通过离子交联法制备PEG/BMP-2纳米基因复合物,通过溶液共混法制备聚乳酸（PLA）/聚已内酯（PCL）载基因仿生骨并接种BMSCs于仿生骨之上,应用免疫组化及免疫印迹检测BMSCs转染后BMP-2蛋白表达;酶联免疫方法检测转染后细胞培养上清中BMP-2分泌情况;实时聚合酶链反应检测转染后细胞BMP-2及骨钙素mRNA表达水平;截除新西兰大耳白兔双侧桡骨中段,植入载基因仿生骨材料,对骨缺损修复部位摄X线片、行HE染色和BMP-2免疫组织化学染色.结果 制备出PEG/BMP-2纳米颗粒及PEG-BMP-2-PLA/PCL载基因仿生骨.PEG/BMP-2纳米颗粒转染BMSCs和载基因仿生骨BMSCs内BMP-2表达量明显上调,骨钙素mRNA表达和碱性磷酸酶活性有所增加;体内实验中,PEG-BMP-2-PLA/PCL载基因仿生骨组与对照组比较BMP-2表达升高,新生骨在骨缺损区域所占面积比也明显增加.结论 PEG-BMP-2-PLA/PCL对骨缺损修复具有良好的效果.

阻遏矽肺纤维化的实验研究

目的比较骨髓间充质样干细胞（BM＋MSCs）与pcDNA3．1肝细胞生长因子（HGF）转染的BM—MSCs对SiO，所致大鼠肺泡炎和早期肺纤维化的影响并探讨其机制。方法收集培养雄性Wistar幼鼠的原代BM-MSCs，并进行4，6-联脒-2-苯基吲哚（DAPI）标记。将50只雄性Wistar大鼠气管滴注40mg／mlSiO2，混悬液1ml造模后，随机分为模型组、BM—MSCs组和pcDNA3．1-HGF＋BM—MSCs组。造模次日，模型组（10只）：尾静脉注入PBS1ml；BM—MSCs组（20只）：尾静脉注入10^6／mlBM-MSCs1ml；pcD-NA3．1-HGF＋BM-MSCs组（20只）：尾静脉注入10^6个／mlpcDNA3．1-HGF转染的BM-MSCslm1。14和28d后，分别处死大鼠，取肺组织冰冻切片，荧光显微镜下检测体内DAPI标记细胞；HE和Masson染色观察肺炮炎和纤维化情况；免疫印迹（Westernblot）法测各组大鼠肺组织的I-IGF表达量；ELISA法检测肺组织中肿瘤坏死因子（TNF）．or．的含量，样本碱水解法检测肺组织中羟脯氨酸（HYP）的含量。结果14、28d时，pcDNA3．1-HGF＋BM-MSCs组肺组织肺泡炎评分（14d：1．16±0.3，28d：0.8＋0．20）均低于同时期BM-SCs组（14d：1．68＋0．17，28d：1．58±031）和模型组（14d：2．36＋_0．17，28d：2．80_＋0．14），BM—MSCs组肺泡炎评分均低于同时期模型组，差异均有统计学意义（P〈0．05）。14、28d时pcDNA3．1-HGF＋BM～MSCs组肺纤维化评分（14d：0．10＋_0．11，28d：1．16＋_0．13）均明显低于同时期BM—MSCs（14d：0．54＋0．15，28d：1．36±0．13）和模型组（14d：0．64＋0．09，28d：1．84＋0．17），差异均有统计学意义（P〈O．05）。14、28d时pcDNA3．1一HGF＋BM—MSCs组肺组织匀浆中TNF—d含量[14d：（280．48＋23．11）pg／mg，28d：（249．78_＋22．33）pg／mg]均明显低于BM—MSCs组[14d：（342．58_＋35．34）pg／mg，28d：（319．5l±17．84）pg／mg]~模型组『14d：（442．29±36．76）pg／mg，28d：（348．53＋_33．95）pghngl，BM—MSCs组肺组织匀浆中TNF—d含量低于模型组，差异均有统计学意义（P〈O．05）。14、28d时peDNA3．1-HGF＋BM—MSCs组肺组织匀浆中HYP表达量f14d：（O．46＋0．04）~g／mg，28d：（0．65_＋0．05）Ixg／mg】均明显低于同时期BM—MSCs组[14d：（0．63＋0．04）~g／mg，28d：（1．04_＋0．07）jxg／mg】和模型组【14d：（0．72_＋0．06）}xg／mg，28d：（1．39＋0．06）jxg／mgl，差异均有统计学意义（P〈0．05）；28d时，BM—MSCs组肺组织匀浆中HYP表达量低于模型组，差异有统计学意义（P〈O．05）。结论应用pcDNA3．1-HGF转染后的BM—MSCs比单独应用BM—MSCs能更有效地对抗SiO：诱导的大鼠肺泡炎和早期肺纤维化，作用机制可能与其减轻肺组织的炎症有关。