芒柄花素抑制脂多糖诱导髓核间充质干细胞的炎症反应

背景:芒柄花素具有抗炎、抗氧化能力,但其对髓核间充质干细胞是否有保护作用尚不清楚。目的:探讨芒柄花素对炎症微环境下髓核间充质干细胞的作用及机制。方法:①从SD大鼠尾椎椎间盘中提取髓核间充质干细胞,流式细胞术鉴定间充质干细胞表面标志;②CCK-8法检测脂多糖、芒柄花素对髓核间充质干细胞增殖活力的影响,以确定后续处理细胞应用的芒柄花素浓度;③在DMEM/F-12完全培养基中添加5μg/mL脂多糖模拟炎症微环境,然后用不同浓度芒柄花素处理髓核间充质干细胞24 h,通过Western blot、实时荧光定量PCR、免疫荧光检测炎症标志物表达,Western blot检测核因子κB信号通路蛋白水平。结果与结论:①贴壁培养的髓核间充质干细胞呈梭形,生长状态良好,流式细胞术结果显示间充质干细胞表面标志物CD29、CD44、CD90呈阳性,造血干细胞表面标志物CD34、CD45呈阴性。②12.5,25,50,100,200μmol/L芒柄花素处理24 h对髓核间充质干细胞无明显增殖抑制效果。与脂多糖组相比,12.5,25,50μmol/L芒柄花素处理24 h后髓核间充质干细胞活力显著提高,因此后续选用12.5,25,50μmol/L为芒柄花素低、中、高浓度处理髓核间充质干细胞。③与脂多糖组相比,芒柄花素低、中、高浓度组髓核间充质干细胞中基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13、肿瘤坏死因子α蛋白和mRNA表达均明显降低(P<0.05),且具有剂量依赖性。④与脂多糖组相比,芒柄花素低、中、高浓度组髓核间充质干细胞中磷酸化核因子κB和磷酸化核因子κB抑制蛋白的表达显著降低(P<0.05),且具有剂量依赖性。上述结果说明芒柄花素可能通过抑制核因子κB信号通路减轻脂多糖诱导的大鼠髓核间充质干细胞炎症。

淫羊藿苷调控髓核来源间充质干细胞凋亡修复椎间盘退变

背景:椎间盘退变是导致腰痛的最常见原因之一,内源性髓核来源间充质干细胞的数量减少及功能减退可能是导致椎间盘退变的重要原因,一定范围内的淫羊藿苷可能通过PI3K/Akt信号通路减少间充质干细胞凋亡。目的:探讨淫羊藿苷调控髓核来源间充质干细胞凋亡的可能机制。方法:获取SD大鼠退变椎间盘髓核来源间充质干细胞,以不同浓度淫羊藿苷干预第3代髓核来源间充质干细胞,CCK-8法检测细胞活力及增殖情况。将第3代髓核来源间充质干细胞分为对照组、淫羊藿苷组及LY294002组,干预1周后通过流式细胞仪检测细胞凋亡率,Tunel荧光检测Tunel染色阳性细胞数,RT-PCR及免疫荧光检测Caspase-3、Bcl-2、Bax、p-Akt及p53的mRNA及蛋白表达水平。将16只椎间盘退变模型SD大鼠均分为淫羊藿苷组[淫羊藿苷灌胃50 mg/(kg·d)]及对照组(等量生理盐水灌胃),在治疗前、治疗后2周及4周时行大鼠尾椎X射线片、MRI检查及苏木精-伊红染色评估椎间盘退变。结果与结论:(1)一定浓度范围内的淫羊藿苷可促进髓核间充质干细胞增殖,在0.1μmol/L时细胞活力达到最佳(P<0.05);(2)与对照组比较,淫羊藿苷组的细胞凋亡率、Tunel染色阳性细胞数、Caspase-3、Bax及p53表达显著下降,p-Akt及Bcl-2表达显著增加(P<0.05);PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002干预后可以逆转淫羊藿苷的保护作用(P<0.05);(3)在动物模型水平,淫羊藿苷治疗后椎间盘退变程度得到延缓,与对照组比较,治疗4周时椎间隙高度指数及MRI评分及苏木精-伊红染色评分差异有显著性意义(P<0.05);(4)结果表明,在一定浓度范围内,淫羊藿苷以浓度依赖性方式促进退变椎间盘来源髓核间充质干细胞增殖,可通过PI3K/Akt信号通路调节髓核间充质干细胞凋亡,进而一定程度上改善椎间盘退变程度。

温肾壮阳方含药血清调控HIF-1α/VEGF通路对髓核细胞凋亡与增殖的影响

目的 探讨温肾壮阳方含药血清对髓核细胞凋亡、增殖及缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)/血管内皮生长因子(VEGF)通路的影响。方法 将25只SD雄性大鼠随机分为5组,分别用生理盐水、依托考昔溶液及低、中、高浓度温肾壮阳方进行灌胃7 d制备相应含药血清。取人髓核细胞,实验分为6组:空白对照组用正常大鼠血清培养,缺氧造模组用300μmol/L氯化钴(CoCl_(2))溶液干预24 h诱导缺氧状态,依托考昔组用300μmol/L CoCl_(2)+依托考昔含药血清同时干预24 h,低、中、高浓度温肾壮阳方组分别用300μmol/L CoCl_(2)+相应浓度肾壮阳方含药血清同时干预24 h。采用CCK-8实验检测细胞生存率,采用Western blot法和qPCR法检测细胞中HIF-1α、VEGF、半胱天冬酶-1(Caspase-1)、p53蛋白与mRNA表达情况,流式细胞术检测髓核间充质干细胞(NPSCs)增殖情况。结果 缺氧诱导各组细胞存活率均明显低于空白对照组(P均<0.05),中浓度温肾壮阳方组、高浓度温肾壮阳方组的细胞存活率均明显高于缺氧造模组(P均<0.05)。缺氧造模组细胞中HIF-1α、VEGF、Caspase-1、p53蛋白及mRNA相对表达量均明显高于空白对照组(P均<0.05);依托考昔组HIF-1α蛋白及mRNA相对表达量均明显高于缺氧造模组(P均<0.05),VEGF、Caspase-1、p53蛋白及mRNA相对表达量与缺氧造模组比较差异均无统计学意义(P均>0.05);温肾壮阳方各组HIF-1α蛋白及mRNA相对表达量与缺氧造模组比较差异均无统计学意义(P均>0.05),VEGF蛋白及mRNA相对表达量均明显高于缺氧造模组(P均<0.05);中浓度温肾壮阳方组、高浓度温肾壮阳方组Caspase-1、p53蛋白及mRNA相对表达量均明显低于缺氧造模组(P均<0.05)。各造模组NPSCs占比均明显低于空白对照组(P均<0.05),中浓度温肾壮阳方组NPSCs占比明显高于缺氧造模组、依托考昔组、高浓度温肾壮阳方组(P均<0.05)。结论 温肾壮阳方对缺氧诱导的髓核细胞有保护作用,可促进NPSCs增殖,减少细胞凋亡,且可特异性促进VEGF的表达,有利于血管的分化与生成。

IL-1β对髓核干细胞衰老的生物学影响

探索IL-1β对髓核干细胞衰老的生物学影响。方法:选取2020年2月-2021年2月会昌县人民医院收治腰椎间盘退变患者50例作为研究组、非退行性椎间盘病变患者50例作为对照组。对髓核组织HE染色结果进行分析,统计分析两组患者髓核组织IL-1β mRAN及蛋白表达水平,对髓核组织中IL-1β mRNA表达水平和Pfirrmann分级、HDS评分的相关性进行分析,并对髓核组织中IL-1β mRNA表达水平和腰椎间盘退变患者疾病严重程度的相关性进行分析。结果:镜下观察,半乳糖苷酶染色,细胞增殖、细胞周期检测均表现为髓核干细胞的衰老状态。研究组轻度、中度、重度患者髓核组织IL-1β mRAN及蛋白表达水平均逐渐升高(P<0.05),均高于对照组(P<0.05)。髓核组织中IL-1β mRNA表达水平和Pfirrmann分级呈显著的正相关关系(P<0.05),和HDS评分呈显著的正相关关系(P<0.05)。Logistic回归分析显示,腰椎间盘退变患者疾病严重程度的影响因素包括髓核组织中IL-1β mRNA表达水平(P<0.05)。结论:IL-1β能够引起髓核干细胞的衰老,将新思路提供给了椎间盘退变机制及生物治疗的研究。

人髓核间充质干细胞的分离提纯方式及生物学活性鉴定

目的 ：探索人髓核间充质干细胞（nucleus pulposus mesenchymal stem cells,NPMSCs）的提纯方法并鉴定其生物学活性。方法：收集3例腰椎间盘突出症患者的退变髓核组织（Pfirrmann分级均为Ⅳ级）,利用酶消化法分离细胞。采用两种方法分离提纯NPMSCs,一组细胞采用贴壁法培养（贴壁组）,另一组通过流式细胞分选技术利用NPMSCs表面阳性标志物CD73、CD90、CD105获得NPMSCs（流式组）。将两种方法获得的NPMSCs进行体外培养扩增,分别进行形态学观察,细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit,CCK-8）检测增殖能力。贴壁组NPMSCs采用流式细胞分选仪在进行分选之前检测免疫表型,流式组NPMSCs在生长达80%~90%融合时进行免疫表型的检测。向成骨、成脂、成软骨诱导分化,诱导28d后分别进行茜素红染色观察其成骨能力、油红O染色观察其成脂能力、甲苯胺蓝染色观察其成软骨能力,利用Imag J软件计算染色区域所占的面积百分比。比较两组NPMSCs在形态学、免疫表型及增殖和分化能力的差异。结果：形态学观察发现,两组NPMSCs均呈漩涡状生长,贴壁组NPMSCs可见散在的单个细胞生长;流式组NPMSCs长梭形形态更长,排列更加紧密,少见散在的单个贴壁生长细胞。流式细胞分选后所得的NPMSCs占细胞总数的（89.67±2.52）%,可以进行体外培养扩增,细胞为典型的长梭形特征,漩涡状生长,在接种后12~15d达80%~90%融合,增殖能力在接种后5~13d明显高于贴壁组NPMSCs（P〈0.05）。流式组NPMSCs的CD73、CD90、CD105的表达率明显高于贴壁组NPMSCs（P〈0.05）,并且低表达CD34、CD45及HLA-DR。两种方法获得的NPMSCs均能完成三系诱导分化,流式组成骨、成脂、成软骨染色区域百分比均明显高于贴壁组（P〈0.05）。结论：利用流式细胞分选技术从人退变髓核组织中可获得较高纯度的NPMSCs,并能进行后续培养扩增。与贴壁法获得的NPMSCs相比,流式细胞分选的NPMSCs具有更强的增殖与分化能力。

辛伐他汀对大鼠髓核间充质干细胞增殖及分泌功能的影响

目的:观察大鼠髓核间充质干细胞(nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cell,NPMSC)的生物学特性和辛伐他汀对髓核间充质干细胞增殖及分泌功能的影响。方法:取8周龄SD大鼠尾椎髓核组织,采用胶原酶及胰酶序贯消化法分离NPMSC并进行体外扩增培养,观察细胞形态并通过噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况。通过流式细胞仪检测细胞免疫表型及逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)检测干细胞基因表达进行NPMCS的鉴定。取第3代NPMSC施加不同浓度辛伐他汀干预(0μmol/L、0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L),在干预1d、3d、7d、14d、21d后通过CCK-8法检测细胞活力,RT-PCR检测蛋白多糖、Ⅱ型胶原、缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1,GLUT-1)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的mRNA表达。结果:原代细胞早期可形成葵花样细胞集落,克隆样生长,传代后细胞生长较原代细胞明显加快,细胞形态以纺锤形为主。第3代细胞高表达干细胞相关阳性表面抗原分子CD73、CD90及CD105,低表达干细胞相关阴性表面抗原分子CD45及CD11b,与骨髓间充质干细胞具有相似的干细胞转录因子Sox2、Oct-4及Nanog表达水平。适当浓度的辛伐他汀(0.01μmol/L^0.1μmol/L)可促进NPMSC增殖及HIF-1α、GLUT-1、VEGF的mRNA表达,且浓度为0.1μmol/L时达到最强,而高浓度辛伐他汀(1μmol/L)对细胞增殖能力及HIF-1α、GLUT-1、VEGF的mRNA表达有明显抑制作用。辛伐他汀可使NPMSC中出现并促进Ⅱ型胶原及蛋白多糖m RNA的表达,0.1μmol/L浓度达到最强。结论:大鼠的髓核组织培养出的NPMSC能够表达骨髓间充质干细胞特异性的干性基因,适当浓度(0.01μmol/L^0.1μmol/L)的辛伐他汀可促进NPMSC增殖和细胞外基质的分泌。

低氧培养促进大鼠髓核间质干细胞增殖

目的研究低氧培养对大鼠髓核间质干细胞(NPMSCs)增殖的影响。方法分离大鼠尾椎髓核获得NPMSCs并进行体外扩增培养,观察细胞形态,流式细胞仪鉴定细胞免疫表型。取第3代NPMSCs分为常氧组和2%低氧组,分别培养7 d及14 d,观察细胞形态;MTT法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞活力和RT-q PCR检测低氧诱导因子1α(HIF-1α)、葡萄糖转运蛋白1(GLUT-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、沉默信息调节蛋白1(SIRT1)及SIRT6的mRNA表达情况。结果原代NPMSCs细胞早期可形成葵花样细胞集落,传代后细胞增殖明显加快,细胞形态以纺锤形为主。第3代细胞高表达干细胞相关阳性表面抗原分子,低表达干细胞相关阴性表面抗原分子。低氧组细胞形态以多角形为主,细胞更容易聚集成团块,且细胞增殖速度明显加快(P<0.05),细胞凋亡率明显下降(P<0.05)。低氧组HIF-1α、VEGF、GLUT-1、SIRT1及SIRT6表达量明显高于常氧组(P<0.05)。结论 2%O2的低氧环境促进髓核间质干细胞增殖,其机制可能与SIRT1及SIRT6介导的HIF-1α信号通路有关。

白细胞介素1β对大鼠髓核间质干细胞生物学特性的影响

背景:内源性干细胞并未在椎间盘退变的进程发挥修复作用,作者推测可能与相关致病因素的异常作用有关,导致对髓核间质干细胞功能产生一定的抑制效应。目的:观察炎症因子白细胞介素1β对大鼠髓核间质干细胞生物学特性的影响。方法:取3月龄雄性SD大鼠脊柱腰段椎间盘髓核组织,用胶原酶,胰酶序贯消化法分离并培养髓核间质干细胞。采用流式细胞术检测细胞免疫表型CD24,CD34,CD45,CD90,CD105表达;利用RT-PCR检测干细胞基因SOX2,Nanog的表达。观察髓核间质干细胞成脂、成骨、成软骨分化能力。利用流式细胞术检测白细胞介素1β作用于髓核间质干细胞后的凋亡率,荧光定量PCR检测白细胞介素1β作用于髓核间质干细胞后SOX9,蛋白多糖,Ⅱ型胶原酶,caspase-3基因的表达变化。结果与结论:体外分离培养出的细胞表现为纺锤样长梭形;CD90、CD105表达阳性,CD45、CD34、CD24表达阴性,表达干细胞基因SOX2,Nanog,具有成骨和成软骨分化能力,无成脂分化能力。CCK-8检测白细胞介素1β可以抑制髓核间质干细胞的增殖活性,与作用时间、作用浓度存在一定的依赖关系,最佳作用时间为48 h,最佳作用浓度为50μg/L。流式细胞仪检测白细胞介素1β可以使髓核间质干细胞轻度凋亡;荧光定量PCR结果显示:SOX9,蛋白多糖,Ⅱ型胶原的mRNA表达下调,caspase-3表达上调。结果可见白细胞介素1β具有抑制髓核间质干细胞增殖活性并诱导其凋亡的作用,是导致椎间盘自身干细胞无法发挥修复作用的原因之一。

髓核间充质干细胞生物学特性与椎间盘Pfirrmann分级相关性研究

目的研究不同Pfirrmann分级椎间盘中髓核间充质干细胞(human nucleus pulposus mesenchymal stem cells,hNP-MSCs)的生物学特性,进一步明确hNP-MSCs在椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IVDD)中的作用及其相关性。方法选取2017年1月~2019年1月我院椎间盘髓核摘除术的患者,根据术前MRI按Pfirrmann分级标准(Ⅰ~Ⅴ级)分为5组,各组均为3例,共15例,评价hNP-MSCs在不同椎间盘退变中的生物学特性差异及其与椎间盘退变程度的相关性。结果 PfirrmannⅠ~Ⅴ级5组共15例标本均分离获取到了hNP-MSCs原代细胞,贴壁时间及80%~90%融合率时间差异有统计学意义(P<0.05),Pfirrmann分级越高,细胞生长所需时间越长,细胞形态及增殖集落越不均一。酶标仪检测不同Pfirrmann分级的5组hNP-MSCs标本接种后第1、3天,不同组hNP-MSCs标本OD值差异无统计学意义(P>0.05),第5、7、9、11、13天,不同组hNP-MSCs标本OD值差异有统计学意义(P<0.05),Pfirrmann分级超高,OD值越低,提示增殖能力与Pfirrmann分级呈负相关性。不同Pfirrmann分级的5组hNP-MSCs标本P2代细胞流式细胞仪检测结果显示均为高表达CD44、CD73、CD90、CD105,低表达CD31、CD34、CD45,各组CD44、CD73、CD90、CD105阳性表达率差异有统计学意义(P<0.05),且随Pfirrmann分级的增加,阳性表达率下降,呈负相关性。结论 hNP-MSCs的生物学特性与椎间盘Pfirrmann分级密切相关,椎间盘退变程度越重,hNP-MSCs的生物学表现越差。

骨形态生成蛋白2联合转化生长因子β3诱导髓核间充质干细胞向类髓核细胞分化的实验研究

背景:髓核间充质干细胞(nucleus pulposus mesenchymal stem cells, NPSCs)在椎间盘损伤退变修复中具有重要应用价值,诱导髓核间充质干细胞向类髓核细胞分化是关键步骤。目的目的:探讨联合使用骨形态生成蛋白2(bone mor-phogenetic protein 2, BMP-2)和转化生长因子β3(transforming growth factorβ3, TGF-β3)诱导髓核间充质干细胞向类髓核细胞分化的可行性及效果。方法方法:取3月龄大鼠尾椎髓核组织,分离培养髓核间充质干细胞,并进行形态学观察、三系分化鉴定和流式细胞术检测干细胞表面抗原。将培养获得的NPSCs分为4组,对照组、20 ng/ml TGF-β3组、100 ng/ml BMP-2组和20 ng/ml TGF-β3+100 ng/ml BMP-2组,分别加入不同组合的细胞因子对NPSCs进行诱导培养。采用CCK-8增殖实验检测各组细胞因子毒性,在诱导第7天、第14天提取mRNA进行实时定量RT-PCR检测各组髓核特异基因Aggrecan、SOX-9、Collagen-2、Krt19的相对表达量;在诱导第14天进行阿利新蓝染色检测细胞外基质的表达量,对比各组染色强度来比较各组NPSCs分化程度。结果结果:成功从髓核组织分离NPSCs并进行鉴定。原代细胞培养11 d后传至P3代,贴壁细胞呈纺锤长梭形,旋窝样生长。CCK-8实验结果显示,加入细胞因子组细胞增殖水平在培养3 d后较对照组升高,但3组之间无统计学差异,排除由细胞增殖导致的胞外基质增多。RT-PCR结果显示,在诱导第7天时加入细胞因子组髓核特异基因的表达较对照组均升高(P<0.05),在第14天时,20 ng/ml TGF-β3+100 ng/ml BMP-2组髓核特异基因的表达较20 ng/ml TGF-β3组和100 ng/ml BMP-2组升高(P<0.05)。阿利新蓝染色结果显示,20 ng/ml TGF-β3+100 ng/ml BMP-2组细胞外基质分泌明显高于其他组。结论结论:联合使用TGF-β3和BMP-2能够有效诱导NPSCs向类髓核细胞分化,可为下一步应用NPSCs治疗椎间盘退变打下基础。

椎间盘微环境下椎间盘源性干细胞和髓核间充质干细胞的活性

背景:椎间盘微环境对干细胞生物学行为具有重要作用,拟通过微环境调节作用来实现不依赖种子细胞的椎间盘组织修复。目的:探讨椎间盘微环境下椎间盘源性干细胞和髓核间充质干细胞活性的差异。方法:健康雄性SD大鼠10只,按照解剖区分离椎间盘骨组织,用Ⅱ型胶原酶消化后进行体外培养椎间盘源性干细胞;分离髓核组织,采用酶消化法体外培养髓核间充质干细胞。将获得的椎间盘源性干细胞和髓核间充质干细胞在体外进行正常条件、椎间盘微环境条件下培养扩增,培养第1-6天采用MTT法测定细胞增殖情况,培养第1,3,6天采用流式细胞技术检测CD29阳性表达水平。结果与结论:①在不同环境的培养条件下,椎间盘源性干细胞和髓核间充质干细胞增殖情况呈相反趋势。在正常培养条件下,椎间盘源性干细胞和髓核间充质干细胞呈增殖状态,第4-6天为对数增殖期,两者差异无显著性意义(P>0.05);在椎间盘微环境条件下,髓核间充质干细胞的增殖活性明显低于椎间盘源性干细胞,差异有显著性意义(P<0.05);②在椎间盘微环境条件下培养第3,6天,椎间盘源性干细胞表面CD29阳性抗原表达水平明显高于髓核间充质干细胞,差异有显著性意义(P<0.05);③结果表明,在椎间盘微环境条件下,髓核间充质干细胞和椎间盘源性干细胞活性受到一定程度的抑制,但椎间盘源性干细胞较髓核间充质干细胞保留更多的细胞活性。

脂肪与髓核来源间充质干细胞在转化生长因子β1诱导下向类髓核细胞分化

背景:大量研究表明多种组织来源的成体干细胞在体外均可向类髓核细胞分化。椎间盘髓核组织来源间充质干细胞在转化生长因子β1诱导下能否向类髓核细胞分化?其分化能力与脂肪间充质干细胞相比是否有差异目前未见报道。目的:比较脂肪间充质干细胞与髓核间充质干细胞在转化生长因子β1诱导下向类髓核细胞诱导分化能力的差异。方法:分别取大鼠腹股沟处脂肪组织与尾段脊柱,采用机械酶消化法分离培养脂肪间充质干细胞与髓核间充质干细胞。流式细胞仪检测两种细胞CD105、CD90、CD29、CD45、CD44、CD34、CD24的表达。脂肪间充质干细胞与髓核间充质干细胞各自分为诱导组、无因子诱导组和对照组,诱导组以转化生长因子β1标准软骨诱导液培养,无因子诱导组以不含转化生长因子β1的软骨诱导液培养,对照组以含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养。培养14 d后用RT-PCR检测各组细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX-9基因的表达。结果与结论:两种细胞CD105、CD90、CD29表达阳性,CD45、CD44、CD34、CD24表达阴性。向类髓核细胞诱导培养14 d后两种细胞诱导组Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX-9基因表达水平较对照组均明显升高,差异有显著性意义(P<0.05);髓核间充质干细胞诱导组3种基因的表达水平明显高于脂肪间充质干细胞诱导组,差异有显著性意义(P<0.05)。提示脂肪间充质干细胞与髓核间充质干细胞均具有向类髓核细胞分化的能力,而髓核间充质干细胞相对于脂肪间充质干细胞其软骨相关基因表达更高,可能更适合于作为组织工程髓核研究的种子细胞。

家兔髓核间充质干细胞的体外培养与鉴定

(1)目的建立家兔腰椎髓核间充质干细胞(NPMSCs)体外培养模型并对其进行鉴定,为进一步研究椎间盘退变提供理论依据。(2)方法首先用酶消化法得到家兔原代髓核细胞,再将其加入间充质干细胞完全培养基中分离出NPMSCs并进行传代培养,观察NPMSCs的细胞学及生物学特性。最后进行细胞鉴定:运用流式细胞术检测家兔NPMSCs的细胞表面免疫表型CD105、CD90、CD34、CD45的表达情况;运用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测间充质干细胞基因SOX2、Nanog的表达。(3)结果家兔髓核组织来源细胞在原代培养4~6天后即可见部分细胞贴壁生长,形态为短梭形或多角形。传代后细胞增殖速度明显加快,到第三代可见细胞大多为长梭形,待细胞达到90%融合时,可见细胞呈漩涡状生长。通过流式细胞术检测所培养细胞的表面免疫分子标志:CD105、CD90阳性表达,CD34、CD45阴性表达;运用RT-PCR检测所培养细胞可表达干细胞基因SOX2、Nanog。(4)结论成功在体外培养出家兔NPMSCs,为研究椎间盘退变的发生发展机制打下基础。

正常与退变髓核的髓核间充质干细胞代谢活性及干性基因表达的比较

目的:比较来源于正常与退变髓核的髓核间充质干细胞(NPMSCs)的细胞代谢活性及干性基因表达情况。方法:收集6例非退变患者髓核组织(正常组)与6例腰椎间盘突出症患者的退变髓核组织(退变组),采用酶消化法分离细胞,应用标准间充质干细胞培养基(standard MSC culture medium)进行细胞培养并观察细胞形态。两组内各取1例分离得到的细胞进行流式细胞仪检测间充质干细胞表面蛋白分子标记CD90、CD105、CD73、CD45、CD34及人类白细胞抗原(HLA)-DR表达情况;并进行成骨、成脂及成软骨诱导分化,诱导28d后分别应用茜素红染色鉴定细胞成骨能力、油红O染色鉴定细胞成脂能力、甲苯胺蓝染色鉴定细胞成软骨分化能力,并按照国际干细胞治疗协会(ISCT)提出的间充质干细胞的判定标准,对分离得到的细胞进行综合评估鉴定。采用CCK-8检测两组P2代NPMSCs的代谢活力。提取两组每例P2代细胞总RNA,行RT-PCR检测P2代细胞"干性维持"相关基因Oct4及Nanog表达情况。结果:两组P0代细胞均贴壁生长,形态学方面两组并无明显差异。免疫表型鉴定显示正常组和退变组间充质干细胞表面分子标记CD90、CD105、CD73表达比例分别高达96%、98%、95%以上,两组均低表达造血细胞标志物CD45、CD34、HLA-DR(均低于4%)。茜素红染色、油红O染色及甲苯胺蓝染色分别证实正常组与退变组细胞均可向骨、脂肪及软骨细胞三系诱导分化。上述结果证实分离得到的细胞即NPMSCs。细胞代谢活性测定示P2代细胞在培养后5d、7d、9d、11d、13d正常组细胞活性均强于退变组,两组细胞活性有统计学差异(P<0.05)。正常组"干性维持"相关基因Oct4及Nanog表达量分别为退变组的4.63±1.17、7.36±1.19倍,正常组均明显高于退变组(P<0.05)。结论:正常与退变髓核组织内均存在NPMSCs,但正常椎间盘来源的NPMSCs具有较强的细胞代谢活性,较"强的"干性维持"基因表达。

从脊柱内镜手术摘除组织中分离髓核间充质干细胞及其生物学特征鉴定

目的:利用经皮内镜下腰椎间盘切除术获取来源明确的髓核组织,结合组织块培养法高效分离培养人髓核间充质干细胞(human nucleus pulposus mesenchymal stem cells,hNP-MSCs),并鉴定其生物学特征。方法:收集6例腰间盘突出症手术摘除的髓核组织,利用组织块培养法分离培养。取第3~6代生长良好的细胞用于实验,采用CCK-8检测增殖能力;用流式细胞术检测细胞表面标志物;并分别向成骨、成脂和成软骨方向诱导分化,用油红O染色、茜素红染色及阿利新蓝染色对分化结果进行检测。结果:成功从椎间盘内镜摘除的髓核组织中分离培养具有增殖能力的细胞,流式细胞术检测显示细胞高表达CD29、CD44、CD90、CD73和CD105等间充质干细胞抗原,不表达造血干细胞标志CD34和CD45。生长曲线显示符合正常间充质干细胞增殖特征。茜素红染色、阿利新蓝染色及油红O染色均呈阳性,说明分离培养的细胞具有向成骨、成软骨和成脂肪诱导分化的能力。结论:首次结合椎间盘内镜微创手术和组织块培养法,体外高效分离培养了具有自我更新能力和多向分化潜能的hNP-MSCs。

血清浓度对人髓核间充质干细胞生物学活性的影响

目的 :体外观察、研究不同血清浓度对人正常髓核间充质干细胞(nucleus pulposus mesenchymal stem cells,NPMSCs)生物学活性的影响。方法:选取先天性脊柱侧凸矫形患者手术切除的髓核组织(Pfirrmann分级为Ⅰ级或Ⅱ级),体外分离培养NPMSCs并传代培养。利用流式细胞仪分别对P3代细胞的表型[CD105、CD90、CD73、CD45、CD34和人类白细胞抗原(HLA)-DR]进行检测,并观察其向成骨、成脂和成软骨诱导分化能力。取P3代NPMSCs在无血清(0%)及含有5%和10%体积浓度胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM培养基中进行培养,分别对细胞增殖能力、细胞周期、细胞凋亡率进行检测,并利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,QRT-PCR)技术检测八聚体结合转录因子4 (octamer-binding transcription factor 4,Oct4)、Nanog、Jag1、Notch1干性基因和Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、蛋白多糖和性别决定区Y框蛋白9 (SRY related HMG box-9,SOX-9)的表达量。结果:从正常髓核组织中分离培养的细胞呈纺锤状、贴壁生长,可体外扩增,流式细胞仪检测结果显示细胞高表达CD73(98.9%)、CD90(97.9%)、CD105(98.9%),低表达HLA-DR(3.11%)、CD34(1.83%)、CD45(1.19%),且可以向成骨细胞、脂肪细胞及类软骨细胞分化。根据国际干细胞治疗协会(International Society for Cellular Therapy,ISCT)评定标准,分离培养的细胞为NPMSCs。随着FBS浓度的降低,细胞增殖率显著下降,细胞凋亡率明显增加,而且可以显著延长G1期时长(P<0.05)。QRT-PCR结果显示:随着FBS浓度的下降,干性基因(Oct4、Nanog、Jag1、Notch1)的相对表达量明显减少,Ⅰ型胶原相对表达量增加,Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9的相对表达量减少,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:血清浓度降低可显著抑制NPMSCs细胞增殖、干性基因及相关功能基因的表达。

柚苷对髓核间充质干细胞生物学性能的影响及其相关机制

目的:探讨柚苷对人退变腰椎间盘来源髓核间充质干细胞(human nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cell,hNPMSC)生物学性能的影响及其可能机制。方法:收集腰椎间盘突出症患者的退变髓核组织,分离培养hNPMSC并进行体外扩增。通过细胞形态学观察、细胞免疫表型检测及三系分化进行间充质干细胞的鉴定。取P3代hNPMSC分为对照组(正常培养基培养)、柚苷组(以含20μg/mL柚苷的培养基培养)和LY294002组(用含20μg/mL柚苷及PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002的培养基培养),培养6d后通过流式细胞仪检测细胞凋亡率,TUNEL荧光检测TUNEL染色阳性细胞率,Western Blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax及PI3K/Akt信号通路相关蛋白p-Akt、Akt和p53的表达,RT-PCR检测Ⅱ型胶原及蛋白多糖的mRNA表达。结果:来自人退变腰椎间盘髓核的原代细胞贴壁生长,呈不规则多边形,传代后以梭形为主;高表达干细胞相关阳性表面抗原分子CD73、CD90及CD105,低表达CD45及CD34;茜素红染色、油红O染色及甲苯胺蓝染色证实经诱导后可向骨、脂肪及软骨细胞分化,符合间充质干细胞的表型。与对照组比较,柚苷组细胞凋亡率、TUNEL染色阳性细胞率、p53、Caspase-3和Bax蛋白表达显著性下降,p-Akt及抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著性增加(P<0.05);LY294002干预后可以逆转这种改变(P<0.05)。与对照组比较,柚苷组hNPMSC中Ⅱ型胶原及蛋白多糖的mRNA表达显著性增加;LY294002组中Ⅱ型胶原及蛋白多糖的mRNA表达较柚苷组显著性减少(P<0.05)。结论:柚苷可通过激活PI3K/Akt信号通路减少细胞凋亡,促进hNPMSC向髓核细胞分化。

酸环境对人髓核间充质干细胞生物学活性的影响

目的:观察酸环境对体外培养的成人髓核间充质干细胞(NPMSCs)生物学特征的影响,探讨椎间盘退变的可能机制。方法:用胶原酶消化法从6例脊柱侧凸矫形患者手术摘除的6个腰椎间盘(Pfirrmann椎间盘退变分级为Ⅰ级或Ⅱ级)髓核组织中分离细胞,体外培养,传代并观察细胞形态。取P2代细胞,利用流式细胞仪对分离得到的细胞表型CD34、CD45、CD73、CD90、CD105和人类白细胞抗原(HLA)-DR表达情况进行检测;用成骨、成软骨、成脂培养液诱导培养细胞,2周后分别用茜素红、甲苯胺蓝、油红O对细胞进行染色,观察其成脂、成骨、成软骨能力。按照国际干细胞治疗协会(ISCT)有关间充质干细胞(MSCs)的判定标准,对分离得到的细胞进行综合评估鉴定。在37℃、21%O2、5%CO2的细胞培养箱中用不同p H值(6.2、6.5、6.8、7.1、7.4)的DMEM10%血清培养液培养P2代细胞,1、3、5、7、9、11、13d后利用细胞增殖试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞增殖活力(OD值),培养3d时借助流式细胞仪检测细胞凋亡率,不同p H值培养基培养28d时采用实时荧光定量(RT-PCR)检测P2代细胞"干性维持"基因Oct4、Nanog、Jag1、Notch1及酸离子通道家族蛋白基因ASIC1、ASIC2、ASIC3、ASIC4的m RNA表达情况。结果:P0代细胞均贴壁生长。P2代细胞免疫表型鉴定显示MSCs表面分子标记CD90、CD105、CD73表达比例分别高达96%、95%、94%以上,低表达CD45、CD34、HLA-DR(均低于4%)。茜素红染色、油红O染色及甲苯胺蓝染色分别证实分离的细胞均可向骨、脂肪及软骨细胞三系诱导分化。按照ISCT有关MSCs的判定标准,分离得到的细胞即NPMSCs。细胞代谢活性测定示P2代细胞在培养后1、3d各组间细胞OD值差异无统计学意义(P>0.05);5d、7d、9d、11d、13d各组间细胞OD值差异有统计学意义(P<0.05),且p H值越低细胞的OD值越小。p H值7.4组的细胞凋亡率均小于其余各组,各组间有统计学差异(P<0.05)。p H值7.4组"干性维持"基因Oct4、Nanog、Jag1、Notch1及酸离子通道家族蛋白基因ASIC1、ASIC2、ASIC3、ASIC4的m RNA均明显高于p H值7.1、6.8、6.5、6.2组(P<0.05)。随着培养液p H值降低,细胞的凋亡率升高,细胞干性维持基因及酸通道家族蛋白基因的m RNA表达降低。结论:低p H值的酸环境培养1、3d对成人NPMSCs增殖无明显影响,培养5d后明显抑制NPMSCs的增殖和基因表达,促进细胞凋亡,且随着p H降低作用越明显。

不同体积浓度胎牛血清对大鼠髓核间充质干细胞生物学特性的影响

目的研究大鼠髓核间充质干细胞(NPMSCs)体外培养的最佳血清体积浓度并探讨椎间盘退变的机制。方法用胶原酶、胰酶序贯消化法从SD大鼠腰部和尾部的椎间盘组织中提取NPMSCs,并进行体外培养,将其传代。①利用流式细胞仪对第3代传代NPMSCs细胞表型CD29、CD34、CD24、CD90、CD105进行鉴定;②利用普通PCR鉴定体外培养的NPMSCs细胞基因Sox2、Nanog的表达;③在37℃、21%O2、5%CO2的细胞培养箱中用成骨、成软骨、成脂培养液诱导培养第3代传代NPMSCs,2周以后,用染色剂对其染色,观察其成脂、成骨、成软骨能力。④在37℃、21%O2、5%CO2的细胞培养箱中用不同血清体积浓度(0%、5%、10%、20%、30%)的DMEM-F12血清培养液培养第3代传代NPMSCs,72h后利用CCK-8法检测细胞的增殖,并采用RT-PCR检测细胞蛋白多糖、Ⅱ型胶原、SOX9的mRNA表达,借助流式细胞仪对细胞进行细胞凋亡的检测。结果①大鼠NPMSCs的成骨、成软骨能力强,成脂能力较差,且其细胞表面高度表达CD29、CD90、CD105,低度表达CD24、CD34,细胞基因Sox2、Nanog高度表达。②随着培养液血清体积浓度增加,OD值增大,NPMSCs的凋亡率降低,细胞蛋白多糖、Ⅱ型胶原、SOX9基因的mRNA表达增加。结论①大鼠NPMSCs具有间充质干细胞特性;②细胞外营养影响大鼠NPMSCs的增殖、分泌、凋亡。

基于NF-κB通路探讨TNF-α对椎间盘退变小鼠模型髓核间充质干细胞衰老的影响

目的探讨TNF-α通过NF-κB通路对椎间盘退变小鼠模型髓核间充质干细胞衰老的影响。方法30只小鼠建立椎间盘退变模型,分离出髓核间充质干细胞(Nucleus Pulposus Mesenchymal Stem cells,NPSCs),对NPSCs进行三系分化诱导鉴定,用含不同浓度梯度TNF-α(0、0.1、1、5、10 ng/mL)的培养液培养NPSCs,按照以上浓度分为五组。MTT检测NPSCs增殖情况,Western-blot检测NF-κB蛋白表达水平,β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老水平,对三种不同浓度(0,1,10 ng/mL)处理的NPSCs进行成软骨诱导分化,Western-blot检测蛋白聚糖(Aggrecan,Agg)、Ⅱ型胶原蛋白(CollagenⅡ,ColⅡ)、性别决定区Y框蛋白-9(sex determining region Y-box9,Sox-9)蛋白表达水平。结果三系分化结果提示,NPSCs成脂诱导后细胞内可形成脂滴团和鲜红色脂滴泡,成骨诱导可见大量红染的矿化钙盐结节沉积,成软骨诱导细胞呈不规则多角形软骨细胞样改变。与0 ng/mL TNF-α组相比,其余四组NPSCs表现为增殖能力降低,NF-κB蛋白水平增高,衰老染色阳性细胞数量增多,衰老程度较高,且随TNF-α浓度升高,NPSCs的增殖能力逐渐减弱(P<0.05),NF-κB水平逐渐增高(P<0.05),衰老染色阳性细胞数量增多,衰老程度更高(P<0.05)。三种不同浓度TNF-α组NPSCs成软骨分化后Agg、Col II、Sox-9水平比较无差异(P>0.05)。结论TNF-α可通过NF-κB信号通路降低退变小鼠模型NPSCs增殖能力,加速细胞衰老,但并不影响成软骨分化能力。