髓核退变程度对软骨终板干细胞生物学特性的影响

目的:探讨髓核退变程度对软骨终板干细胞生物学特性的影响。方法:选取13位脊柱退行性变患者,根据Pfirrmann分级标准将患者分为轻度组、中度组和重度组。取患者的椎间盘软骨终板组织分离并培养CEMSCs,培养到第3代后,检测细胞的活性、凋亡率和复苏情况。结果:轻度髓核退变组患者CEMSCs荧光强度最高,重度组最弱(P<0.05);轻度组CEMSCs凋亡最少,重度组最多,轻度组细胞活力和复苏活力最强,重度组最弱,均具有统计学意义(P<0.05)。结论:髓核退变程度影响软骨终板干细胞的活性、凋亡率和复苏情况,髓核退变程度越高,软骨终板干细胞的活力越弱,凋亡越多,复苏活力越弱。

T2WI信号强度对确定腰椎间盘髓核退变的价值

目的研究腰搬间盘髓核T2信号强度与患者年龄、性别及与髓核退变程度的关系。方法回顾性分析422例腰椎间盘退行性变患者的MRI资料，征正中矢状位上测量髓核T2WI信号强度值．对不同级别的信号值进行非参数相关分析和t检验；对午龄与椎间盘信号值砭退变级别采用卡方检验和相关分析；对不同椎间盘水平的信号值进行t检验；对不同椎间盘水平间信号值进行非参数Spearman相关性分析。结果不同性别在同一级别和同一椎间盘水平的信号值差异均有统计学意义；年龄越大髓核信号值越低，髓核退变程度越高。T2WI信号强度可以代表椎间盘髓核退变程度。在所有腰椎间盘中第4～5腰椎间盘退变发生率最高结论腰椎间盘髓核T2信号强度与髓核退变程度及患者年龄具有相关性。T1信号强度有可能戍为一种评价髓核退变简便、易行的方法。

白藜芦醇通过上调SIRT1促进退变髓核细胞胞外基质合成

目的:研究白藜芦醇(RES)对人退变椎间盘髓核细胞(DNPCs)合成细胞外基质(ECM)的影响。方法:对人退变椎间盘髓核组织进行分离、单层培养细胞鉴定、藻酸盐培养。取原代藻酸盐培养细胞分别用0、12.5、25、50、100、200μmol/L的RES分别刺激DNPCs 12、24、48 h,Western blot法检测沉默交配型信息调节因子2同源蛋白1(silent mating typeinformation regulation 2 homolog 1,SIRT1)、Ⅱ型胶原(Colla2α1)、蛋白聚糖聚合物(aggrecan)蛋白表达,real-time荧光定量PCR检测SIRT1 mRNA表达水平。用SIRT1-siRNA转染后再与100μmol/L RES共培养24 h,观察Colla2α1、aggrecan的蛋白表达。结果:RES上调SIRT1 mRNA和蛋白水平的表达,促进DNPCs合成ECM的表达,与对照组相比具有统计意义(P<0.05)。siRNA靶向沉默SIRT1表达后,再加入RES刺激,观察到Colla2α1与aggrecan的蛋白表达与对照组相比显著下降(P<0.05)。结论:RES可刺激DNPCs ECM的合成,且呈现一定的量效关系,这种调节作用与SIRT1的活性有关。

人软骨终板干细胞与退变髓核细胞体外非接触共培养的实验研究

目的:探究人软骨终板干细胞(cartilage endplate stem cells,CESCs)与退变髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)在Transwell非接触共培养条件下的相互作用。方法:对取自因腰椎退行性疾病行腰椎间盘切除椎弓根螺钉内固定患者的软骨终板、退变髓核进行CESCs及NPCs的分离培养及鉴定。通过琼脂糖悬浮培养法获得CESCs的克隆,扩增后行流式技术及免疫荧光对CESCs进行干细胞表面标记的检测,取第三代CESCs与第一代NPCs进行实验,建立三个细胞培养组:CESCs单独培养组、NPCs单独培养组、CESCs与NPCs共培养组(分别接种于Transwell底部和上层插槽中进行非接触共培养)。在培养之后的不同时间点(3、5、7d),采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)检测各组细胞中蛋白聚糖(Agg)、SOX-9及Ⅱ型胶原蛋白(CollⅡ)m RNA的表达变化情况,共培养7d后,采用Western-blot检测各组细胞中蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白、Sox-9蛋白的表达变化。结果:经过分离培养及鉴定,筛选出的细胞为CESCs(流式细胞计数分析,CESCs细胞表面的CD73、CD90、CD105阳性率分别为97.5%、98.7%、98.7%);共培养后,RT-PCR显示单独培养的CESCs在各检测时间点几乎无Agg、CollⅡ、SOX-9基因表达;而共培养组的CESCs在第5天开始出现Agg、CollⅡ、SOX-9基因表达(其表达量分别为0.10、0.11、0.15),与单独培养CESCs相比有统计学意义(P<0.05);共培养组NPCs的Agg、CollⅡ及SOX-9基因表达量(其表达量分别为1.32、1.25、0.92)高于单独培养NPCs的表达量(P<0.05),且随着时间延长逐渐升高,共培养与单独培养相比,差异有统计学意义(P<0.05)。共培养7d后,Westernblot结果与RT-PCR结果一致,共培养组CESCs的Agg、CollⅡ、SOX-9蛋白表达量高于单独培养组(P<0.05)。结论:CESCs与NPCs共培养时的相互作用能促使CESCs表达髓核细胞特异性标记物Agg、CollⅡ和SOX-9;通过相互作用,CESCs可增强NPCs表达自身特异性相关分子。

低强度脉冲超声通过PI3K/Akt通路促进人退变髓核细胞合成细胞外基质

目的探讨低强度脉冲超声(LIPUS)对人退变髓核细胞合成细胞外基质的影响及机制。方法取人腰椎退变髓核组织,进行髓核细胞的分离、培养、鉴定,取P3代细胞转至藻酸钙凝珠培养。实验分组如下:LIPUS组:超声刺激1周,20 min/d;对照组:不予超声刺激同条件培养1周;LY294002组:超声刺激并加入LY294002共培养1周。应用ELISA法检测上清中髓核细胞分泌的aggrecan和Ⅱ型胶原(Col2α1);RT-PCR法检测细胞中aggrecan和Col2α1在mRNA水平的表达差异;Western blot法检测细胞中aggrecan、Col2α1、Akt及p-Akt的表达差异。结果予以LIPUS刺激后,上清中的aggrecan和Col2α1浓度较对照组升高(P<0.05),细胞内aggrecan和Col2α1在mRNA及蛋白水平的表达与对照组比较均有增高(P<0.05),Akt的表达无明显变化(P>0.05),p-Akt的表达增高(P<0.05),加入特异性抑制剂LY294002后,aggrecan和Col2α1的合成明显降低(P<0.05)。结论低强度脉冲超声能通过PI3K/Akt信号通路促进藻酸钙凝珠立体培养的人退变髓核细胞合成细胞外基质。

SIRT1通过AKT通路和ERK1/2通路共同调节退变髓核细胞细胞外基质的合成

目的研究沉默信息调节因子2同源蛋白1(SIRT1/sirtuin 1)对已退变的人椎间盘髓核细胞(DNPCs)合成细胞外基质的影响。方法对人DNPCs进行分离、培养及其细胞鉴定,第一部分取P2代细胞用白藜芦醇(RES,SIRT1激动剂)、二甲双胍(MET,SIRT1激动剂)、尼克酰胺(NAM,SIRT1抑制剂)、SIRT1-siRNA进行相应处理,采用Western印迹检测Ⅱ型胶原(COLLA2α1)、聚蛋白多糖(Aggrecan)及其p-AKT、t-AKT、p-ERK1/2、t-EKR1/2。第二部分先RES与P2代细胞共培养后分别加入PI3K与ERK的特异性抑制剂LY294002、PD98059,观察COLLA2α1、Aggrecan的表达情况。结果用SIRT1激动剂刺激以后COLLA2α1、Aggrecan的表达显著提高,AKT及其ERK1/2的磷酸化水平也相应提高,用NAM及其SIRT1-siRNA处理后COLLA2α1、Aggrecan的表达显著降低,AKT及其ERK1/2的磷酸化水平也显著降低。用LY294002和PD98059分别处理后观察到COLLA2α1、Aggrecan的表达亦显著降低。结论 SIRT1可通过AKT及其ERK1/2两条通路上调人DNPCs细胞外基质的表达,抑制椎间盘的变性,为进一步研究椎间盘退变的机制、组织工程学、基因治疗等奠定了基础。

益气活血方对非破裂型腰椎间盘突出退变髓核细胞ColⅡ、Aggrecan及TIMP-1 mRNA的影响

目的探讨益气活血方对人体非破裂型腰椎间盘突出退变髓核细胞中Ⅱ型胶原(ColⅡ)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)及金属基质蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)mRNA的表达的影响。方法选择非破裂型腰椎间盘突出症(LDH)的住院患者经手术摘除的腰椎间盘组织,采用组织块法培养原代细胞;以SPF级雄性SD大鼠制备药物血清。将传代第1代的退变髓核细胞分为3组,实验组分别予体积比为5%、10%的益气活血方血清DMEM培养液;对照组加入生理盐水血清DMEM培养液。通过Realtime PCR检测ColⅡ、Aggrecan、TIMP-1mRNA的表达。结果与生理盐水组比较,益气活血方血清可上调非破裂型腰椎间盘突出退变髓核细胞中ColⅡ、Aggrecan mRNA的表达(P<0.05),未检测出TIMP-1mRNA的变化。结论益气活血方可能通过影响非破裂型腰椎间盘突出髓核细胞中ColⅡ、Aggrecan含量,进而发挥防治非破裂型腰椎间盘突出髓核细胞的退变作用。

非接触式共培养下两种同源间充质干细胞对退变髓核细胞生物学影响的比较研究

目的:比较非接触式共培养条件下两种同源间充质干细胞对退变髓核细胞生物学功能的影响。方法:取同一腰椎间盘突出症患者骨髓间充质干细胞(BMSCs)、脂肪间充质干细胞(ADSCs)和退变髓核细胞(NPCs),两种间充质干细胞分别与髓核细胞在Tanswell 6孔板中进行非接触式共培养,与ADSCs共培养的NPCs为A组,与BMSCs共培养的NPCs为B组,以单独培养的NPCs为对照组。共培养7d后,提取3组髓核细胞总RNA,进行反转录后,利用Real-Time PCR检测其Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因的相对表达量。结果:非接触式共培养7d后,Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因相对表达量对照组分别是1.03±0.28、1.21±0.40和0.94±0.34,A组分别是3.49±0.55、3.88±2.11和2.41±0.91,B组分别是7.60±1.89、6.26±2.96和4.55±1.88。与对照组相比,A、B组髓核细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因相对表达显著增加(P<0.05);A、B两组间相比也有显著性差异(P<0.05)。结论:非接触式共培养条件下骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞对退变髓核细胞均有一定的激活效应;骨髓间充质干细胞对退变髓核细胞的激活效应更强,可能更加适合于椎间盘退行性疾病的生物学治疗。

NALP3炎性体、骨形态发生蛋白在退变腰椎间盘髓核组织中的表达及意义

目的探究退变腰椎间盘髓核组织中NALP3炎性体、骨形态发生蛋白(BMP)的表达及意义。方法在我院选取2017年6-2018年6月接受治疗的80例腰椎间盘突出症患者,患者手术切除标本中取出退变椎间盘髓核组织块,另外选取在我院行前路减压内固定切除的脊柱骨折患者椎间盘的正常椎间盘髓核组织块制作标本待用。对待测标本进行免疫组化染色,使用Western Blot检测NALP3、BMP-2表达。分析NALP3、BMP-2与腰椎间盘突出症患者腰椎间盘退变等级、腰部负荷程度的关系,并分析NALP3、BMP-2之间相关性。结果腰椎间盘组患者中NALP3表达显著高于正常组(P<0.05),BMP-2表达低于正常组(P<0.05);Ⅴ级患者NALP3水平高于Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级(P<0.05),BMP-2水平低于Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级(P<0.05);重程度患者NALP3水平高于很轻、轻、中程度(P<0.05),BMP-2水平低于很轻、轻、中程(P<0.05);NALP3、BMP-2之间进行Pearson相关性分析,NALP3、BMP-2之间呈负相关(r=-0.269,P=0.016)。结论退变腰椎间盘髓核组织中NALP3升高,BMP-2降低,且与患者退变等级、病情严重程度密切相关,为临床上腰椎间盘突出症的诊治提供理论参考。

Toll样受体4及白细胞介素-23、白细胞介素-17A在退变腰椎间盘髓核组织中的表达及其临床意义

目的探讨Toll样受体4(TLR4)及白细胞介素-23(IL-23)、IL-17A在退变腰椎间盘髓核组织中的表达及其临床意义。方法选取2019年2月—2022年2月青海大学附属医院收治的97例腰椎间盘突出症(LDH)患者作为研究组。另选取同期该院行前路减压内固定切除的脊柱骨折患者58例作为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测两组腰椎间盘髓核组织TLR4、IL-23、IL-17A mRNA相对表达量。比较研究组不同腰椎间盘退变等级患者TLR4、IL-23、IL-17A mRNA相对表达量,分析研究组TLR4与IL-23、IL-17A mRNA相对表达量的相关性。结果研究组TLR4、IL-23、IL-17A mRNA相对表达量高于对照组(P<0.05)。V级组TLR4、IL-23、IL-17A mRNA相对表达量高于Ⅱ级组、Ⅲ级组、Ⅳ级组(P<0.05),Ⅳ级组高于Ⅱ级组、Ⅲ级组(P<0.05),Ⅲ级组高于Ⅱ级组(P<0.05)。重度腰痛组TLR4、IL-23、IL-17A mRNA相对表达量高于中度腰痛组(P<0.05)。重度腰椎功能丧失组TLR4、IL-23、IL-17A mRNA相对表达量高于中度腰椎功能丧失组(P<0.05)。Pearson相关性分析显示,研究组退变腰椎间盘髓核组织TLR4 mRNA相对表达量与IL-23 mRNA、IL-17A mRNA相对表达量呈正相关(r=0.662和0.671,均P<0.05)。结论LDH患者退变腰椎间盘髓核组织TLR4、IL-23、IL-17A异常高表达,且与LDH患者腰椎间盘退变等级、病情严重程度关系密切。

MiRNA-326抑制人椎间盘退变髓核细胞活力和凋亡的机制

目的:探讨过表达miRNA-326对椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)髓核(nucleus pulposus,NP)细胞凋亡的影响及其作用机制。方法:构建miRNA-326慢病毒表达载体,在293T细胞中获得重组慢病毒,经感染NP细胞得到稳定过表达细胞系GV369-miRNA-326-NP,同时设置空载体GV369-NP组与空白组。荧光显微镜观察慢病毒载体的标签蛋白[绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)]的表达,实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)方法检测miRNA-326的表达,流式细胞术检测细胞凋亡,荧光素酶报告基因分析验证miRNA-326与FasL的靶向关系,蛋白质印迹法检测细胞中凋亡相关蛋白FADD,caspase-3,Bcl-2及Bax的表达,使用试剂盒检测细胞线粒体膜电势的变化情况。结果:荧光显微镜下示,经慢病毒感染的过表达细胞系和空载体细胞系均出现绿色荧光,而空白组未见绿色荧光。与空白组相比,GV369-miRNA-326-NP组中miRNA-326的表达水平、Bcl-2表达水平和线粒体膜电位明显升高,而细胞凋亡率,FADD,caspase-3和Bax的表达水平明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05);GV369-NP组与空白组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。荧光素酶报告基因分析证实miRNA-326与FasL存在靶向关系。结论:MiRNA-326可抑制IDD NP细胞发生凋亡,既可通过靶向性调控外源性FasL/Fas通路参与caspase-3和FADD介导的细胞凋亡,也可通过线粒体途径对细胞凋亡发挥作用。

紫外分光光度法在退变腰椎间盘髓核胶原蛋白水平测定中的应用

用手术中摘除的退变髓核为样本,采用紫外分光光度法(测定波长为560 nm)测定退变腰椎间盘髓核胶原蛋白的含量。结果吸光度(y)与L(-)-羟脯氨酸浓度(x)呈良好线性关系,线性回归方程为y=0.2375x+0.0015(r=0.9999),平均回收率为99.75%,胶原蛋白占髓核干重平均为38.35%。

MMP⁃13、BMP⁃2及P16在退变腰椎间盘髓核中的表达及临床意义

目的分析基质金属蛋白酶⁃13(MMP⁃13)、骨形态发生蛋白⁃2(BMP⁃2)及P16在退变腰椎间盘髓核中的表达及临床意义。方法选取2017年8月至2020年8月于本院进行手术治疗的90例腰椎间盘突出症患者的髓核组织作为研究组,同时纳入同期于本院进行前路或后路腰椎骨折手术治疗的50例患者经病理及MRI证实为正常椎间盘组织作为对照组。比较两组MMP⁃13、BMP⁃2及P16表达水平差异及其平均灰度值。采用Pearson相关分析退变腰椎间盘髓核MMP⁃13、BMP⁃2及P16与椎间盘退变等级的相关性。结果研究组患者MMP⁃13、BMP⁃2及P16阳性表达率显著高于对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。研究组患者MMP⁃13、BMP⁃2及P16平均灰度值水平明显低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关系数分析显示:退变腰椎间盘髓核MMP⁃13、BMP⁃2及P16表达与椎间盘退变等级呈正相关关系(P<0.05)。结论MMP⁃13、BMP⁃2及P16水平在退变腰椎间盘髓核中呈异常表达状态,且与椎间盘退变等级显著相关,其表达情况可作为评估椎间盘退变程度的可靠依据。

低强度脉冲超声对立体培养的人退变髓核细胞的影响

目的探讨低强度脉冲超声对三维立体培养的人退变髓核细胞的作用。方法取人腰椎退变髓核组织,进行髓核细胞的分离、培养、鉴定,取P3代细胞转至藻酸钙凝珠后予以不同超声强度(0、15、30、60、120 mW/cm2)的脉冲超声刺激1 w(20 min/d)。分别应用流式细胞仪检测细胞凋亡率,RT-PCR及Western blot法检测细胞中聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原在mRNA及蛋白水平的表达差异。结果超声强度为30、60、120 mW/cm2组的细胞凋亡率较对照组(0 mW/cm2)低(P<0.05),超声强度为15 mW/cm2组与对照组相比差异无显著性(P>0.05);在mRNA及蛋白表达水平上,30、60、120 mW/cm2组较对照组均有显著性差异(P<0.05),组间比较无显著性差异(P>0.05)。结论低强度脉冲超声能抑制体外藻酸钙凝珠立体培养的人退变髓核细胞凋亡,促进细胞合成细胞外基质(聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原),从而延缓或修复椎间盘退变。

SDF-1/CXCR4信号轴通过NF-κB通路诱导人退变髓核细胞凋亡

目的探讨趋化因子SDF-1/CXCR4信号轴对人退变椎间盘髓核细胞凋亡的调控作用及其分子机制。方法将术中摘取的椎间盘标本根据Pfirrmann退变程度分为正常组和退变组。用免疫组织化学法、定量PCR和Western blot等检测SDF-1和CXCR4的表达。用退变椎间盘髓核原代细胞培养,取第3~5代的细胞给予10 ng/mL SDF-1刺激、CXCR4-siRNA转染及NF-κB特异性抑制剂PDTC(20μmol/L)等不同处理,Western blot和q-PCR验证转染效率和信号通路上靶蛋白(基因)的表达;Annexin V/PI检测细胞凋亡率;细胞免疫荧光检测NF-κB的重要基团P65的核转移情况。结果 SDF-1和CXCR4在退变椎间盘组织中表达显著升高(P<0.05);SDF-1可以诱导退变髓核细胞的凋亡,但在CXCR4的表达受到沉默后,SDF-1的促凋亡作用被抑制(P<0.05);加入SDF-1的诱导后,磷酸化P65的表达水平明显增高(P<0.05),P65向核内移位;用PDTC抑制NF-κB活性后,SDF-1促凋亡作用明显减弱(P<0.05)。结论 SDF-1/CXCR4信号轴促进髓核细胞凋亡的机制可能与Akt/NF-κB信号通路相关。

基质金属蛋白酶8与Ⅱ型胶原在颈椎间盘退变髓核组织中的表达及意义

背景:椎间盘髓核组织是人体易退变的组织,Ⅱ型胶原是髓核的主要成分,而基质金属蛋白酶8(MMP-8)可降解Ⅱ型胶原,引起组织退化。目的:探讨MMP-8、Ⅱ型胶原在成人颈椎间盘退变髓核组织与正常髓核组织中的表达有无差异,并初步评价其在颈椎间盘退变过程中的作用。方法:取退变的成人颈椎间盘髓核组织60例和正常的成人颈椎间盘髓核组织10例,HE染色观察颈椎间盘髓核组织结构;天狼猩红饱和苦味酸染色观察两者胶原类型及分布特点;免疫组化染色观察及定量分析两者MMP-8、Ⅱ型胶原表达并进行比较,同时采用Pearson相关分析法分析颈椎间盘退变髓核组织MMP-8与Ⅱ型胶原表达的相关性。结果:HE染色显示,颈椎间盘正常髓核组织中纤维网致密结构规整,无断裂及钙化;而退变髓核组织纤维排列紊乱或相互交叉融合,组织出现断裂及纤维软骨组织钙化。苦味酸天狼猩红染色显示,颈椎间盘正常髓核组织内胶原纤维排列致密,主要是Ⅱ型胶原;而退变髓核组织内各型胶原含量减少,仅有少量的Ⅰ型胶原和极少量Ⅱ型胶原。定量分析结果显示,与颈椎间盘正常髓核组织比较,退变髓核组织MMP-8表达较多[(0.130±0.019)vs(0.067±0.010)],而Ⅱ型胶原表达较少[(0.065±0.010)vs(0.130±0.014)],且差异均有统计学意义(t=17.369、-12.493,P均<0.01)。相关分析结果显示,颈椎间盘退变髓核组织MMP-8表达与Ⅱ型胶原表达呈负相关(r=-0.713,P<0.01)。结论:MMP-8在颈椎间盘退变髓核组织中的表达较正常髓核组织明显增高,是颈椎间盘髓核组织退变的重要调节因子,对降解椎间盘细胞外基质中的Ⅱ型胶原有着重要的作用,且两者的表达呈负相关。

两种同源间充质干细胞在接触式共培养体系下对退变髓核细胞生物学影响的比较

目的:比较两种人间充质干细胞在接触式共培养体系下对退变髓核细胞生物学功能的影响。方法:取同一例腰椎间盘突出症患者的退变髓核组织、脂肪组织和骨髓组织,分别分离培养退变髓核细胞(NPCs)、脂肪间充质干细胞(ADSCs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)。取3种细胞传代至第3代的细胞进行接触式共培养。共培养前,利用PKH26对第3代退变NPCs进行染色标记,然后按1∶1的细胞比例,将NPCs分别与ADSCs和BMSCs在普通6孔板内进行接触式共培养。实验分为3组,A组为单独培养的NPCs,为对照组;B组为与ADSCs共培养的NPCs;C组为与BMSCs共培养的NPCs。共培养第7天时,利用MoFlo高速流式细胞分选仪将共培养的细胞进行分选,获取各组NPCs。然后提取各组NPCs的总RNA,进行反转录后,再利用Real-Time PCR技术检测各组NPCs的Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因的相对表达量。将Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因的相对表达量按分组进行组间t检验,P<0.05为有统计学差异。结果:从退变髓核组织、骨髓组织和脂肪组织中,均成功分离培养出NPCs、BMSCs和ADSCs。待各细胞传至第3代时,成功利用PKH26对NPCs进行染色标记。按实验分组将各细胞进行接触式共培养后第7天,成功利用MoFlo高速流式细胞分选仪将共培养细胞进行分选,获取各组NPCs。经提取各组NPCs的总RNA,反转录并进行Real-time PCR后,获取各组NPCs的Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因相对表达量,A组分别为1.03±0.04,1.05±0.07,1.04±0.17;B组分别为5.26±0.24,7.71±0.21,3.84±0.25;C组分别为9.33±0.39,11.07±0.34,5.64±0.26;B、C组NPCs的Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因相对表达量与A组比较显著性增加(P<0.05);C组与B组比较,各指标基因相对表达量显著性增加(P<0.05)。结论:在接触式共培养条件下,BMSCs和ADSCs对退变NPCs均具有营养激活效应;BMSCs对退变NPCs的激活效应比ADSCs更好,对于椎间盘退行性疾病的生物学治疗可能更具优势。

miR-147b-5p对人髓核细胞退变的影响

目的探讨miR-147b-5p的表达对人髓核细胞(HNPCs)退变的影响。方法采用炎性细胞因子白细胞介素(IL)-1β和肿瘤坏死因子(TNF)-α诱导HNPCs退变,甲苯胺蓝染色观察HNPCs形态及蛋白聚糖的表达,免疫荧光染色观察HNPCs中Ⅱ型胶原蛋白(ColⅡ)表达,实时荧光定量(qRT)-聚合酶链反应(PCR)检测退变髓核细胞中miR-147b-5p的表达。将细胞分为对照组、模型组、miR-147-5p mimic组、miR-147b-5p inhibitor组、mimic-NC组和inhibitor-NC组。噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞活力;流式细胞术检测各组细胞凋亡水平;甲苯胺蓝染色和免疫荧光染色分别观察各组细胞蛋白聚糖和ColⅡ表达;Western印迹检测各组细胞中Notch 4、Hes5、Hey1及Hey2蛋白表达水平。结果成功获得退变髓核细胞,与对照组比较,模型组细胞中蛋白聚糖及ColⅡ表达明显减少,miR-147b-5p表达水平及细胞活力显著降低,凋亡率显著升高(P<0.05)。与模型组比较,miR-147b-5p mimic组细胞活力显著增强,细胞中蛋白聚糖及ColⅡ表达明显增加,凋亡率显著降低,Notch 4、Hes5、Hey1及Hey2蛋白表达均显著降低(均P<0.05),miR-147b-5p inhibitor组各检测指标的变化趋势与各mimic组相反。结论人退变髓核细胞中miR-147b-5p表达降低,增加miR-147b-5p的表达可增强退变髓核细胞的活力,增加蛋白聚糖及ColⅡ表达,抑制细胞凋亡。

锌指蛋白A20对LPS刺激时人退变髓核细胞衰老与凋亡的影响

目的探究人退变髓核细胞中锌指蛋白A20对衰老及凋亡的影响。方法提取并培养人退变髓核细胞,小干扰RNA(siRNA)降低A20表达,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作为炎症诱导因素,设置对照组、LPS组、siRNA-A20组、siRNA-A20+LPS组。通过Western blot检测A20、P21、P16、BAX、BID、BCL2、P65、p-P65蛋白表达量。细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测β-半乳糖苷酶。应用AnnexinV-PI双标法及TUNEL染色检测细胞凋亡,观察锌指蛋白A20对髓核细胞衰老及凋亡的影响。应用咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester,CAPE)进行挽救实验,检测A20、P21、P16、BAX、BID、BCL2、P65、P-P65蛋白表达量,探索下调锌指蛋白A20诱导细胞衰老及凋亡可能通路。结果与对照组相比,LPS组P21、P16蛋白表达量无明显变化,siRNA-A20组及siRNA-A20+LPS组P21、P16蛋白表达明显增加(P<0.05),β-半乳糖苷酶染色实验显示着色阳性细胞数显著增多(P<0.05)。Annexin V-PI双标法凋亡结果显示,单纯LPS刺激及单纯siRNA-A20处理组中细胞凋亡占比高于对照组(P<0.05),但低于siRNA-A20+LPS组(P<0.05),TUNEL染色结果与Annexin V-PI双标法结果一致(P<0.05)。凋亡相关蛋白BAX、BID在siRNA-A20+LPS中显著增加(P<0.05),BCL2则明显降低(P<0.05),P-P65蛋白表达量在siRNA-A20+LPS组明显上升(P<0.05)。与siRAN-A20+LPS组相比,应用CAPE预处理后P-P65、P21、P16、BID、BAX蛋白表达量明显下降(P<0.05),BCL2上升(P<0.05)。结论下调锌指蛋白A20,LPS过度激活NF-κB信号通路诱导人退变髓核细胞衰老与凋亡。

miR-663b对低糖诱导的人椎间盘退变髓核细胞的细胞活性及凋亡的影响

目的:研究miR-663b对低糖诱导的人椎间盘退变髓核细胞增殖凋亡的调控机制。方法:运用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)实验检测人椎间盘退缩患者组织和葡萄糖(5、1 mmoL/L)处理的椎间盘退变髓核细胞中miR-663b的表达;脂质体法将低糖组+miR-NC组(转染miR-NC)、低糖组+miR-663b组(转染miR-663b mimics)、低糖组+anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、低糖组+anti-miR-663b组(转染anti-miR-663b)转染至1 mmoL/L处理的椎间盘退变髓核细胞。细胞计数试剂盒(CCK-8)法、流式细胞术、免疫印迹(Western blot)检测细胞的吸光度(OD)值、细胞的凋亡率、细胞中细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A(P21)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase-3)的蛋白表达。结果:miR-663b在人椎间盘退缩患者组织和1 mmoL/L葡萄糖(低糖组)处理的椎间盘退变髓核细胞中的表达均明显降低(P<0.05)。低糖组细胞的增殖能力受到抑制,凋亡能力得到提升,并且P21和Caspase-3的蛋白表达量得到提升。过表达miR-663b的低糖组细胞中miR-663b表达明显升高,细胞增殖能力也明显升高,细胞凋亡能力则明显降低,P21和Caspase-3的蛋白表达量得到抑制,而抑制miR-663b的低糖组细胞则发生相反的作用。结论:miR-663b可促进低糖诱导的人椎间盘退变髓核细胞的增殖,抑制凋亡。