补肾活血方促进脂肪间充质干细胞类髓核分化的作用机制

背景:干细胞移植是防治椎间盘退变的新思路,但移植后的干细胞如何顺利存活、增殖、分化,并恢复髓核细胞功能,是目前亟需克服的重点和难点。目的:探讨补肾活血方对脂肪间充质干细胞存活、增殖、类髓核分化的影响。方法:采用Transwell小室构建人脂肪间充质干细胞和人退变髓核细胞共培养模型。实验分为对照组、模型组、含药血清组、无药血清组,除对照组外,其余各组均用50μmol/L叔丁基过氧化氢干预24 h,然后含药血清组和无药血清组分别予以含体积分数20%补肾活血方含药血清或无药血清的DMEM低糖完全培养液干预48 h,取下层脂肪间充质干细胞,甲苯胺蓝染色法观察蛋白聚糖合成水平,Real-Time PCR法检测Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9的mRNA表达,Western blot法检测SOX9的蛋白表达,乳酸脱氢酶法检测细胞毒性,流式细胞术检测细胞活性氧水平,β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况。结果与结论:①与对照组相比,模型组坏死脱落细胞比例增加,甲苯胺蓝染色变浅,Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9 mRNA和SOX9蛋白表达水平下降(P<0.05);与模型组相比,补肾活血方含药血清可显著减轻细胞损伤并促进Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9 mRNA和SOX9蛋白表达(P<0.05),但无药血清组改善不明显(P>0.05);②与对照组相比,模型组细胞毒性、活性氧水平、细胞衰老水平显著增加;与模型组相比,补肾活血方干预后共培养体系微环境得到明显改善(P<0.05),无药血清对共培养体系微环境改善作用不明显(P>0.05);③结果表明,补肾活血方可以促进脂肪间充质干细胞存活、增殖、类髓核分化。

芒柄花素抑制脂多糖诱导髓核间充质干细胞的炎症反应

背景:芒柄花素具有抗炎、抗氧化能力,但其对髓核间充质干细胞是否有保护作用尚不清楚。目的:探讨芒柄花素对炎症微环境下髓核间充质干细胞的作用及机制。方法:①从SD大鼠尾椎椎间盘中提取髓核间充质干细胞,流式细胞术鉴定间充质干细胞表面标志;②CCK-8法检测脂多糖、芒柄花素对髓核间充质干细胞增殖活力的影响,以确定后续处理细胞应用的芒柄花素浓度;③在DMEM/F-12完全培养基中添加5μg/mL脂多糖模拟炎症微环境,然后用不同浓度芒柄花素处理髓核间充质干细胞24 h,通过Western blot、实时荧光定量PCR、免疫荧光检测炎症标志物表达,Western blot检测核因子κB信号通路蛋白水平。结果与结论:①贴壁培养的髓核间充质干细胞呈梭形,生长状态良好,流式细胞术结果显示间充质干细胞表面标志物CD29、CD44、CD90呈阳性,造血干细胞表面标志物CD34、CD45呈阴性。②12.5,25,50,100,200μmol/L芒柄花素处理24 h对髓核间充质干细胞无明显增殖抑制效果。与脂多糖组相比,12.5,25,50μmol/L芒柄花素处理24 h后髓核间充质干细胞活力显著提高,因此后续选用12.5,25,50μmol/L为芒柄花素低、中、高浓度处理髓核间充质干细胞。③与脂多糖组相比,芒柄花素低、中、高浓度组髓核间充质干细胞中基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13、肿瘤坏死因子α蛋白和mRNA表达均明显降低(P<0.05),且具有剂量依赖性。④与脂多糖组相比,芒柄花素低、中、高浓度组髓核间充质干细胞中磷酸化核因子κB和磷酸化核因子κB抑制蛋白的表达显著降低(P<0.05),且具有剂量依赖性。上述结果说明芒柄花素可能通过抑制核因子κB信号通路减轻脂多糖诱导的大鼠髓核间充质干细胞炎症。

TGM2过表达的骨髓间充质干细胞外泌体抑制乳酸介导的髓核细胞氧化应激性凋亡

目的探究转谷氨酰胺酶2(transglutaminase2,TGM2)过表达的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)来源外泌体在乳酸介导的髓核细胞氧化应激性凋亡中的作用及机制。方法选用20只6周龄雄性SD大鼠[体质量(350±50)g]用于提取髓核细胞。利用乳酸构建原代髓核细胞氧化应激性凋亡模型;利用慢病毒载体在BMSCs中过表达TGM2蛋白,提取外泌体并进行鉴定;后为验证TGM2过表达的外泌体抗髓核细胞氧化应激性凋亡潜在机制,利用流式细胞术对髓核细胞活性氧水平进行检测,Western blot、免疫荧光对髓核细胞Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase3、磷酸化PI3K、磷酸化Akt、核内Nrf2、胞质Nrf2、HO-1蛋白表达水平及Nrf2核内荧光表达情况进行检测,分为4组(n=3):对照组、乳酸处理组、乳酸+对照外泌体组、乳酸+TGM2过表达外泌体组,评估髓核细胞的氧化应激性凋亡程度及PI3K/Akt/Nrf2通路变化情况。结果10 mmol/L乳酸能够更好的诱导髓核细胞氧化应激性凋亡(P<0.05);对照BMSCs组和TGM2过表达BMSCs组均可产生外泌体且能够稳定过表达TGM2(P<0.05,P<0.01);且相较于乳酸处理组,乳酸+TGM2过表达外泌体组和乳酸+对照外泌体组的髓核细胞均表现为凋亡率降低(P<0.05),活性氧水平下降(P<0.05),乳酸+TGM2过表达外泌体组抗凋亡、活性氧蓄积效果更好(P<0.05),髓核细胞内Bax、Cleaved-Caspase3蛋白表达均下降(P<0.05),Bcl-2蛋白水平均增高(P<0.05),PI3K、Akt磷酸化程度均增强(P<0.05),Nrf2核内表达均增加,抗氧化应激因子HO-1表达均增多,乳酸+TGM2过表达外泌体组抗凋亡及PI3K/Akt/Nrf2通路激活程度更强(P<0.05)。结论TGM2过表达的BMSCs外泌体可抑制乳酸介导的髓核细胞氧化应激性凋亡,其机制可能与PI3K/Akt/Nrf2通路激活有关。

人脐带间充质干细胞运载呼肠孤病毒对人慢性髓系白血病K562细胞溶瘤作用的研究

目的:探讨人脐带间充质干细胞(hUMSCs)运载3型呼肠孤病毒(Reo3)对人慢性髓系白血病K562细胞的溶瘤效应。方法:流式细胞术检测hUMSCs和K562细胞表面Reo3易感受体——连接黏附分子A(JAM-A)表达情况,电镜观察Reo3感染hUMSCs 72 h后胞内病毒包涵体分布。将不同(0、1、2和3)感染复数(MOI)的Reo3感染hUMSCs 24、48、72、96和120 h后利用CCK-8法筛选最适MOI。选择最适滴度的Reo3感染hUMSCs 24、48、72、96和120 h后收集上清液,利用小鼠成纤维细胞系L929结合半数组织培养感染剂量(TCID50)法测定各组上清液中Reo3病毒滴度以确定最适感染时间。将K562细胞分为对照组、hUMSCs组、Reo3组和hUMSCs-Reo3组,hUMSCs组和hUMSCs-Reo3组设置hUMSCs与K562细胞作用的低、中、高比例(5∶1、10∶1和20∶1)。CCK-8法分析hUMSCs-Reo3与K562细胞共培养24、48、72 h后K562细胞活力的变化。流式细胞术评估细胞凋亡。利用L929细胞确定抗Reo3单克隆抗体的半数效应浓度(EC50);验证在体外抗体存在条件下hUMSCs-Reo3对K562细胞溶瘤作用的变化。Western blot检测运载体作用于K562细胞后胞内Bcl-2、Bax、survivin和cleaved caspase-3蛋白水平。构建K562细胞的BALB/c裸鼠皮下荷瘤模型(每组6只),分析hUMSCs-Reo3在体内对K562细胞的抑瘤效果。结果:hUMSCs和K562细胞表面JAM-A分子表达量分别为11.0%和99.0%。电镜显示Reo3感染hUMSCs 72 h后胞内出现大量病毒包涵体。在120 h范围内,与未感染组相比,MOI=1的Reo3对hUMSCs活力无显著影响,故最佳MOI为1;TCID50结果显示,MOI=1的Reo3感染hUMSCs 48 h后细胞裂解液中病毒滴度最高,故最适感染时间为48 h。hUMSCs-Reo3作用24、48和72 h后K562细胞活力呈现剂量与时间依赖性抑制。抗Reo3单克隆抗体的EC50为1∶34;在体外不同浓度(1∶34、1∶300和1∶600)抗体存在条件下,hUMSCs仍能运载Reo3抑制K562细胞活力并诱导凋亡发生。与对照组相比,hUMSCs-Reo3作用48 h后K562细胞中Bcl-2和survivin表达水平显著下调(P<0.05),Bax和cleaved caspase-3表达水平显著上调(P<0.05或P<0.01)。在BALB/c裸鼠荷瘤模型中,荷瘤体积测定、肿瘤组织和主要脏器病理学分析及小动物活体成像仪检测组织蛋白酶B/L活性结果表明,运载体在体内对K562细胞具有溶瘤效应而对正常组织无不良影响。结论:hUMSCs可有效运载Reo3,该运载体系在体内、外实验中能够释放足量Reo3抑制K562细胞恶性增殖并促进细胞凋亡,从而发挥溶瘤效应。

METTL3通过YTHDF2/AKT1/PPARγ调控人骨髓间充质干细胞成脂分化的机制研究

目的:探讨N^(6)-甲基腺苷(m^(6)A)甲基化酶甲基转移酶样蛋白3(METTL3)在体外调控人骨髓间充质干细胞(MSCs)向脂肪细胞分化的作用机制。方法:构建METTL3、AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1(AKT1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和YTH m^(6)A RNA结合蛋白F2(YTHDF2)慢病毒载体,包装慢病毒并感染MSCs;采用成脂分化试剂盒诱导各组MSCs分化为脂肪细胞,利用油红O染色检测各组的脂肪细胞形成情况;采用分子克隆技术构建METTL3突变重组载体以证实METTL3的m^(6)A关键位点对靶基因的调控作用;利用放线菌素D作用于YTHDF2过表达的MSCs以探究阅读蛋白YTHDF2对AKT1 mRNA和蛋白表达的影响;采用RNA pull-down结合银染和Western blot实验检测可能发生甲基化修饰的片段与识别蛋白的结合情况。结果:m^(6)A甲基化酶METTL3以PPARγ/AKT1依赖的方式抑制骨髓MSCs的脂肪形成,并且以m^(6)A修饰阅读蛋白YTHDF2依赖的方式抑制AKT1的蛋白表达。YTHDF2可识别并结合发生m^(6)A修饰的AKT1编码序列(CDS),降低其表达水平,抑制MSCs脂肪形成过程。结论:m^(6)A甲基化酶METTL3通过YTHDF2/AKT1/PPARγ通路调控人骨髓MSCs成脂分化过程。本研究为从肿瘤微环境角度寻找急性髓系白血病治疗新靶点提供了理论依据。

补肾中药调控骨髓间充质干细胞防治多发性硬化的机制探索

髓鞘再生障碍是脱髓鞘疾病如多发性硬化(multiple sclerosis,MS)的重要病理环节,而中医药具有促进髓鞘再生的潜在优势。中医学认为,肾藏精,精化髓,髓上行充脑。MS患者的基本病机为肾精亏虚,脑髓失养,损伤的轴突再髓鞘化困难,从而导致神经功能障碍。因此补肾生髓为其根本治法,补肾中药治疗MS疗效显著。研究发现,骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一类具有强大分化潜能的多能干细胞,其分泌的外泌体可透过血脑屏障,其功能特点与中医肾藏精主骨生髓充脑的理论具有高度相关性,且BMSCs对MS也有良好的治疗作用。研究还证实,补肾中药可促进BMSCs增殖分化、定向迁移和调节自噬与凋亡。因此推测补肾中药调控BMSCs可能是其防治MS的机制之一。本研究为中医药防治MS等脱髓鞘疾病提供了新思路。

自体骨髓间充质干细胞复合髓核脱细胞基质修复椎间盘退变的实验研究

目的探讨自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)辅以髓核脱细胞基质(DNPM)的细胞治疗作用。方法在本研究中,我们制作了一种优化的DNPM并通过评估其生化组成、水含量、生物安全性和力学性能来评估其性能。进一步研究DNPM在体外对BMSCs的NP样分化的刺激作用,以及在体内动物模式下,对退变椎间盘髓核的再生作用。实验分组:(1)sham组:非椎间盘损伤组;(2)退变组:椎间盘退变造模后未处理;(3)BMSCs组:椎间盘退变单纯注射BMSCs;(4)复合组:椎间盘退变注射BMSCs复合DNPM。结果4周后,约68%和43%的胶原蛋白和sGAG分别保留在NPCs中。NPCs也表现出与新鲜NP相似的力学性能。此外,NPCs具有生物相容性,能够诱导椎间盘退变(IVDD)中髓核样分化和细胞外基质(ECM)的合成。在体外实验中,12周后,复合组的椎间盘高度指数(DHI)(近81%)和MRI指数(349.05±38.48)显著高于造模组,接近sham组。NPCs还部分恢复了体内退化NP组织的ECM含量和结构。结论自体BMSCs辅以DNPM具有良好的生物和力学性能,并具有促进退化NPCs再生的能力,对椎间盘退变有较好的修复能力。

自体骨髓间充质干细胞移植在老年股骨头坏死髓芯减压术中的应用价值

目的观察自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植在老年股骨头坏死(ONFH)髓芯减压术中的应用效果。方法该研究为前瞻性研究,选择平顶山市第一人民医院2022年1月至2023年5月收治的113例ONFH老年患者为研究对象,以计算机随机分组法将其分为试验组(57例)和对照组(56例),对照组予以传统髓芯减压术治疗,试验组经自体BMSCs移植联合髓芯减压术治疗,比较两组治疗前后的BMSCs表面分子、骨代谢水平、骨密度、骨坏死面积、髋关节功能及疼痛症状改善情况。结果在不同治疗方案下,试验组的BMSCs表面分子CD34、CD105、CD166表达量分别为(2.48±0.76)%、(13.36±3.27)%、(37.49±5.28)%,均高于对照组[(1.92±0.36)%、(11.45±2.13)%、(34.23±5.16)%](P<0.05);试验组骨保护素(OPG)、骨钙素(BGP)、成纤维细胞生长因子(FGF-2)分别为(5.45±1.36)pg/mL、(6.27±1.45)μg/mL、(43.35±10.46)ng/L,均高于对照组[(4.41±1.36)pg/mL、(5.52±1.44)μg/mL、(37.25±10.41)ng/L](P<0.05);试验组术后1个月、术后3个月的骨密度分别为(0.32±0.11)g/cm^(2)、(0.49±0.23)g/cm^(2),均高于对照组[(0.25±0.11)g/cm^(2)、(0.35±0.16)g/cm^(2)](P<0.05);骨坏死面积分别为(26.44±5.17)%、(20.45±5.23)%,均低于对照组[(29.12±5.33)%、(23.32±5.18)%](P<0.05);试验组术后1个月、术后3个月的视觉模拟疼痛量表(VAS)评分分别为(4.25±1.27)分、(2.82±0.46)分,均低于对照组[(5.33±1.77)分、(3.21±0.52)分](P<0.05);试验组术后1个月、术后3个月的髋关节Harris量表评分分别为(70.33±10.32)分、(85.66±10.45)分,均高于对照组[(65.22±10.36)分、(80.33±10.71)分](P<0.05)。结论自体BMSCs能通过上调骨髓干细胞表面分子而改善老年ONFH患者的骨代谢水平,自体BMSCs移植联合髓芯减压术可有效提升患者骨密度水平,并减少骨坏死面积,对缓解患者髋关节疼痛、促进髋关节功能恢复均有积极意义。

术后腹腔粘连形成机制及间充质干细胞外泌体的治疗前景

背景:术后腹腔粘连的形成是一个复杂的过程,预防术后粘连是临床上亟待解决的问题。目的:旨在从细胞及分子水平分析粘连的发生机制,为间充质干细胞外泌体预防和治疗粘连提供理论依据。方法:以“腹腔粘连,盆腔粘连,术后粘连,上皮间充质转化,间充质干细胞,干细胞外泌体,间充质干细胞外泌体”为中文检索词,以“Abdominal adhesion,pelvic adhesion,postoperative adhesion,epithelial mesenchymal transformation,mesenchymal stem cell,stem cell exosomes,mesenchymal stem cell exosomes”为英文检索词,检索PubMed、中国知网和中国生物医学文献数据库,筛选各数据库建库至2023年8月发表的术后腹腔粘连及间充质干细胞外泌体干预研究的相关文章,并进行系统的整理分析,最终纳入54篇文献进行综述。结果与结论:(1)任何腹膜炎症、机械损伤、组织缺血和异物植入等病理因素均可引起腹膜表面的损伤,引起术后腹腔粘连;腹腔粘连的形成过程包括腹膜间皮细胞修复、炎性反应、纤溶系统及凝血途径等过程的相互作用,涉及多种细胞因子及信号通路,包括Wnt/β-catenin通路能诱导纤维化和血管生成,并与转化生长因子β/Smads信号通路相互协同,能刺激成纤维细胞增殖,引起腹膜纤维化;同时,核转录因子kB信号通路上调细胞炎症因子的表达,促进成纤维细胞增生,组织纤维化的过程中发挥关键作用。(2)干细胞的旁分泌功能是目前以再生医学为基础的分子干预腹腔粘连的重要方向,可以参与作用于腹腔粘连中的多种复杂细胞因子及信号通路。(3)相对于传统治疗腹腔粘连的方法,间充质干细胞外泌体具有生物活性、使用安全、无需特殊培养和扩增、更低的免疫原性及较长的稳定性等优势,能通过多种途径引导一种正常的修复和愈合。(4)间充质干细胞外泌体在以往研究中均被证明可以参与调节粘连形成的上述各过程,在临床研究中显示出潜在的应用前景,但需要进一步临床研究以探索适当的间充质干细胞外泌体治疗方案,来解决临床转化的问题。

淫羊藿苷调控髓核来源间充质干细胞凋亡修复椎间盘退变

背景:椎间盘退变是导致腰痛的最常见原因之一,内源性髓核来源间充质干细胞的数量减少及功能减退可能是导致椎间盘退变的重要原因,一定范围内的淫羊藿苷可能通过PI3K/Akt信号通路减少间充质干细胞凋亡。目的:探讨淫羊藿苷调控髓核来源间充质干细胞凋亡的可能机制。方法:获取SD大鼠退变椎间盘髓核来源间充质干细胞,以不同浓度淫羊藿苷干预第3代髓核来源间充质干细胞,CCK-8法检测细胞活力及增殖情况。将第3代髓核来源间充质干细胞分为对照组、淫羊藿苷组及LY294002组,干预1周后通过流式细胞仪检测细胞凋亡率,Tunel荧光检测Tunel染色阳性细胞数,RT-PCR及免疫荧光检测Caspase-3、Bcl-2、Bax、p-Akt及p53的mRNA及蛋白表达水平。将16只椎间盘退变模型SD大鼠均分为淫羊藿苷组[淫羊藿苷灌胃50 mg/(kg·d)]及对照组(等量生理盐水灌胃),在治疗前、治疗后2周及4周时行大鼠尾椎X射线片、MRI检查及苏木精-伊红染色评估椎间盘退变。结果与结论:(1)一定浓度范围内的淫羊藿苷可促进髓核间充质干细胞增殖,在0.1μmol/L时细胞活力达到最佳(P<0.05);(2)与对照组比较,淫羊藿苷组的细胞凋亡率、Tunel染色阳性细胞数、Caspase-3、Bax及p53表达显著下降,p-Akt及Bcl-2表达显著增加(P<0.05);PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002干预后可以逆转淫羊藿苷的保护作用(P<0.05);(3)在动物模型水平,淫羊藿苷治疗后椎间盘退变程度得到延缓,与对照组比较,治疗4周时椎间隙高度指数及MRI评分及苏木精-伊红染色评分差异有显著性意义(P<0.05);(4)结果表明,在一定浓度范围内,淫羊藿苷以浓度依赖性方式促进退变椎间盘来源髓核间充质干细胞增殖,可通过PI3K/Akt信号通路调节髓核间充质干细胞凋亡,进而一定程度上改善椎间盘退变程度。

脂肪间充质干细胞修复氧化损伤髓核细胞机制研究

目的探究脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cell,ADSC)修复氧化损伤髓核细胞(nucleus pulposus cell,NPC)的作用机制。方法实验分为NPC组、ADSC组、NPC+ADSC组、H2O2+NPC+ADSC组、H2O2+NPC组5组。采用H2O2构建NPC氧化损伤模型;SA-β-Gal染色分析NPC衰老程度;流式细胞仪检测NPC氧化损伤水平;Western blot检测ADSC中CollagenⅡ、Aggrecan蛋白表达水平,以及NPC中CollagenⅡ、p53、p21、TGF-β1、Smad2、p-Smad2蛋白表达水平;qPCR检测ADSC中CollagenⅡ、Aggrecan mRNA表达水平,以及NPC中CollagenⅡ、p53、p21、TGF-β1、Smad2 mRNA表达。结果与H2O2+NPC组相比较,H2O2+NPC+ADSC组的NPC衰老数量减少(P<0.05),NPC氧化损伤减轻(P<0.05),p53、p21蛋白和基因表达下降(P<0.05),CollagenⅡ、TGF-β1、p-Smad2蛋白和基因表达升高(P<0.05)。与ADSC组相比,NPC+ADSC组CollagenⅡ、Aggrecan基因和蛋白表达升高(P<0.05)。结论ADSC与NPC共培养不仅可以促进ADSC类髓核化,而且ADSC可修复氧化损伤的NPC,抑制其衰老,该过程可能与调控TGF-β1/Smad2信号通路有关。

间充质干细胞及其外泌体在治疗ALI/ARDS中的机制研究进展

间充质干细胞(MSC)因其显著的免疫调节能力及再生能力,已在多种疾病的细胞治疗领域显示出巨大前景,特别是在急性肺损伤(ALI)/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的治疗中表现出极高的应用潜力。ALI/ARDS均为严重的肺部炎症状态,常导致高病死率。MSC能通过分泌MSC来源的外泌体(MSC-EXO)——一种富含蛋白质、RNA及其他生物分子的微小囊泡发挥其治疗效应。在ALI/ARDS治疗中,MSC-EXO通过多种信号通路发挥作用,包括抑制核转录因子-κB(NF-κB)通路以降低炎症反应,激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路促进细胞存活,及调节丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)与酪氨酸蛋白激酶/信号转导与转录激活子(JAK/STAT)通路以支持肺组织的修复和再生等。因此,MSC和MSC-EXO的研究与应用不仅开辟了新的治疗策略,也为深入理解ALI/ARDS的复杂病理生理机制提供了重要视角。

基于“髓系骨病”理论探索Osterix阳性骨髓间充质干细胞维持骨稳态的作用

目的:探索Osterix阳性骨髓间充质干细胞维持骨稳态的作用。方法:Osterix-CreERT2小鼠(Osterix基因靶标小鼠)与Rosa26-tdTomato小鼠(番茄红荧光报告小鼠)交配获得子代Osterix-CreERT2/Rosa26-tdTomato小鼠,Osterix-CreERT2小鼠与Rosa26-DTA小鼠(白喉毒素A片段报告小鼠)交配获得子代Rosa26-DTA小鼠和Osterix-CreERT2/Rosa26-DTA小鼠。选取3只子代Osterix-CreERT2/Rosa26-tdTomato小鼠纳入示踪组,6只子代Rosa26-DTA小鼠纳入空白组,6只子代Osterix-CreERT2/Rosa26-DTA小鼠纳入Osterix阳性细胞剔除组。各组小鼠均于1月龄时按0.1 mg·g^(-1)体质量腹腔注射他莫昔芬,每天1次,连续注射5 d,以诱导白喉毒素表达,特异性剔除Osterix阳性细胞。他莫昔芬干预结束后2周,脱颈处死示踪组小鼠,切取左侧股骨,通过免疫荧光染色观察Osterix阳性细胞在小鼠股骨中的分布情况。他莫昔芬干预结束后6个月,脱颈处死Osterix阳性细胞剔除组和空白组小鼠,切取左侧股骨,以Micro-CT观察小鼠股骨骨微结构、阿尔新蓝-苏木精染色观察小鼠股骨组织形态、免疫组织化学染色测定小鼠股骨中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和脂肪酸结合蛋白4(fatty acid-binding protein,FABP4)表达量。结果:①Osterix阳性细胞在小鼠股骨中的分布情况。Osterix阳性细胞中tdTomato蛋白的红色荧光与DAPI染色的细胞核蓝色荧光分布高度重合,均位于髓腔;Osterix阳性细胞中tdTomato蛋白的红色荧光与CD73染色的骨髓间充质干细胞细胞核绿色荧光分布高度重合,均位于髓腔。②小鼠股骨骨微结构观察结果。Osterix阳性细胞剔除组的骨松质骨密度和骨松质骨小梁厚度均低于空白组[(36.077±3.449)g·mm^(-3),(25.240±1.077)g·mm^(-3),t=2.831,P=0.031;(0.070±0.004)mm,(0.055±0.003)mm,t=2.839,P=0.014],骨松质骨小梁分离度高于空白组[(0.332±0.012)mm,(0.381±0.004)mm,t=-2.159,P=0.009];2组的骨松质骨体积分数、骨松质骨小梁数量比较,组间差异均无统计学意义[(6.902±2.216)%,(2.531±0.399)%,t=1.848,P=0.129;(0.950±0.266)个·mm^(-1),(0.418±0.037)个·mm^(-1),t=1.626,P=0.122]。Osterix阳性细胞剔除组的骨皮质骨密度、骨皮质骨体积分数、骨皮质骨小梁厚度均低于空白组[(40.127±1.718)g·mm^(-3),(24.990±3.099)g·mm^(-3),t=4.522,P=0.003;(19.482±0.803)%,(13.444±1.604)%,t=3.600,P=0.009;(0.161±0.006)mm,(0.117±0.010)mm,t=3.818,P=0.007];2组的骨皮质骨小梁分离度、骨皮质骨小梁数量比较,组间差异均无统计学意义[(0.295±0.001)mm,(0.296±0.003)mm,t=-0.372,P=0.072;(1.124±0.221)个·mm^(-1),(1.146±0.042)个·mm^(-1),t=1.525,P=0.171]。③小鼠股骨组织形态观察结果。与空白组相比,Osterix阳性细胞剔除组小鼠股骨生长板软骨-骨连接处有大量脂滴生成,脂肪空泡堆积。Osterix阳性细胞剔除组的脂滴面积大于空白组[(203.514±0.957)%,(241.061±5.805)%,t=-6.381,P=0.003]。④小鼠股骨中ALP和FABP4表达量测定结果。Osterix阳性细胞剔除组股骨ALP表达量低于空白组[(1.143±0.122)%,(0.550±0.641)%,t=4.305,P=0.013],FABP4表达量高于空白组[(10.419±1.113)%,(15.670±1.405)%,t=-2.930,P=0.043]。结论:Osterix阳性骨髓间充质干细胞发挥着维持骨稳态的作用。

兔骨髓间充质干细胞与髓核细胞共培养后的营养效应和类髓核分化效应

目的:探讨兔骨髓间充质干细胞(BMMSCs)与髓核细胞(NPCs)共培养时BMMSCs的营养效应和类髓核分化效应及其动态变化规律。方法:应用1月龄新西兰大白兔的骨髓和髓核进行BMMSCs及NPCs的分离培养与鉴定,建立3个细胞培养组,BMMSCs与NPCs共培养组(实验组),BMMSCs单独培养组和NPCs单独培养组作为对照组。在培养的不同时间点(3、6、9、12、15、18、21d)分别检测细胞培养上清液中转化生长因子β1(TGFβ1)、血小板衍化生长因子(PDGF)的含量变化及BMMSCs与NPCs的增殖能力,采用RT-PCR法检测培养不同时间点BMMSCs与NPCs的蛋白聚糖Aggrecan及Ⅱ型胶原蛋白mRNA的表达变化。结果:分离培养的两种细胞经鉴定分别为BMMSCs及NPCs。从第3天开始的各个时间点,实验组上清液中TGFβ1、PDGF的含量较两对照组明显增高(P<0.05),且随时间的延长而逐渐增高,第15天达最高,TGFβ1、PDGF分别达815.81±25.69pg/ml和494.28±20.01pg/ml,此后第18d、21d逐渐下降。实验组细胞DNA含量在各个时间点上均较两对照组明显升高(P<0.05)。从第3天开始的各个时间点,实验组NPCs的蛋白聚糖Aggrecan及Ⅱ型胶原mRNA的表达较对照组高(P<0.05);同时从第15天开始至第21天,实验组BMMSCs的蛋白聚糖Aggrecan及Ⅱ型胶原mRNA的表达较对照组高(P<0.05)。结论:BMMSCs与NPCs共培养时BMMSCs可通过表达TGFβ1、PDGF等细胞因子发挥其营养效应,激活NPCs,促进其增殖及细胞外基质的合成;在共培养后期,BMMSCs在髓核局部微环境下,可发挥其类髓核分化效应,开始合成蛋白聚糖Aggrecan及Ⅱ型胶原蛋白。

miR146通过靶向Notch 1促进骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化

目的探讨miR146在骨髓间充质干细胞(BMSC)向髓核样细胞分化中的作用及其机制。方法从SD大鼠中分离培养BMSC,传至第3代用于本实验。以TGFβ1(转化生长因子-β1)诱导BMSC向髓核样细胞分化为模型。检测TGFβ1诱导BMSC后蛋白多糖(ACAN)、Ⅱ型胶原蛋白(COLⅡ)和SOX 9的蛋白及mRNA表达水平;RT-PCR检测miR146的表达水平。随后通过上调或下调miR146水平,检测ACAN、COLⅡ和SOX 9的蛋白及mRNA表达水平;双荧光素酶报告系统验证miR146的靶基因,并上调或下调miR146水平后检测靶基因的蛋白表达水平;过表达靶基因并检测其与miR146 mimic共转染对ACAN、COLⅡ和SOX 9表达的影响。最后,上调或下调靶基因后,检测miR146表达水平的变化。结果 TGFβ1诱导BMSC向髓核样细胞分化后ACAN、COLⅡ、SOX 9和miR146高表达。上调miR146后,ACAN、COLⅡ和SOX 9的表达升高;下调miR146后ACAN、COLⅡ和SOX 9的表达降低。双荧光素酶报告系统证实,Notch1是miR146的靶基因,miR146通过抑制Notch1的表达上调ACAN、COLⅡ和SOX 9的表达水平。上调Notch1后miR146表达下调,下调Notch1后miR146表达上调。结论 miR146通过靶向Notch1促进骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化,Notch1对miR146亦具有负向调控作用。

牛膝总皂苷调控Nampt/NAD/Sirt1轴诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化

背景:研究表明,骨髓间充质干细胞可向髓核样细胞分化,但分化机制尚不明确。目的:利用牛膝总皂苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化,并探讨Nampt/NAD/Sirt1轴在其中的作用。方法:取第3代SD大鼠骨髓间充质干细胞,随机分成4组:(1)骨髓间充质干细胞组;(2)骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷组;(3)骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷+烟酰胺单核苷酸组(烟酰胺单核苷酸为促NAD合成的外源性小分子物质);(4)骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷+FK866组(FK866为烟酰胺磷酸核糖转移酶抑制剂)。连续诱导培养14d,阿尔新蓝染色法检测细胞内糖胺多糖含量,RT-PCR检测髓核样细胞相关基因COL2、Aggrecan、KRT19和PAX1 mRNA表达,Western blot检测COL2的蛋白表达,Sirt1测定试剂盒检测Sirt1活性,NAD^+/NADH试剂盒检测NAD+含量。结果与结论:(1)与骨髓间充质干细胞组相比,骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷组能够使糖胺多糖、髓核样细胞相关基因表达、COL2蛋白表达、Sirt1活性、NAD^+含量明显增加(P <0.05);(2)与骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷组相比,骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷+烟酰胺单核苷酸组糖胺多糖、髓核样细胞相关基因表达、COL2蛋白表达、Sirt1活性和NAD^+含量增加(P<0.05);相反,骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷+FK866组上述指标均降低(P <0.05);(3)结果表明,牛膝总皂苷可诱导大鼠骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化,Nampt/NAD/Sirt1轴在其中发挥促进作用。

大鼠骨髓间充质干细胞对脾单个核细胞的免疫调节作用

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)对脾单个核细胞(MNC)的免疫调节作用,并初步探讨其作用机制。方法:从大鼠骨髓中分离培养间充质干细胞,通过瑞氏-姬姆萨染色进行形态学观察。应用流式细胞术(FCM)检测鉴定其细胞表面特征分子。以刀豆蛋白A(ConA)作为刺激原,用MTT法测定不同数量MSCs对脾MNC增殖能力的影响。ELISA法检测MSCs对脾MNC分泌IL-2和IL-10水平的影响。用FCM分析MSCs对脾MNC细胞周期分布以及p27、cyclin E表达水平的影响。用乳酸脱氢酶释放法检测MSCs对脾MNC杀伤活性的影响。结果:经不同数量的MSCs作用后,脾MNC增殖水平明显低于阳性对照组(P<0.01),而且MSCs比例越高,其抑制作用越强(P<0.01)。经MSCs作用后,脾MNC分泌IL-2的水平明显降低,而分泌IL-10的水平明显升高(P<0.01),且这种作用随MSCs比例的增加而增强。在ConA刺激下,MSCs可以使脾MNC阻滞于G0/G1期,抑制其进入S期(P<0.01)。MSCs可使脾MNC表达p27的水平明显上升,cyclin E表达的水平明显下降(P<0.05)。与MSCs共培养后,脾MNC对colon26和H22细胞的杀伤活性和单独培养组相比明显下降(P<0.05)。结论:MSCs能够抑制脾MNC体外增殖,该作用可能与MSCs改变MNC分泌细胞因子的水平及其对MNC细胞周期的调节有关。

富含血小板血浆凝胶复合脂肪间充质干细胞构建可注射组织工程髓核

目的:探讨以自体富含血小板血浆(PRP)凝胶复合脂肪间充质干细胞(ADSCs)构建可注射组织工程髓核的可行性。方法:将体外扩增的第3代兔ADSCs经流式细胞仪鉴定后接种至自体PRP凝胶中,体外立体培养2周、4周、8周时分别行大体观察、组织学检查、5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BrdU)免疫荧光法观察细胞在PRP凝胶中的分布及存活情况;分光光度法检测PRP凝胶-细胞复合体中糖胺聚糖(GAG)含量,实时荧光定量PCR法检测低氧诱导因子(HIF-1α)、蛋白多糖(Aggrecan)、Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)基因表达情况。结果:流式细胞仪检测显示体外扩增的第3代细胞CD90阳性率为95.2%,CD45阳性率为0.9%。培养2、4、8周时PRP凝胶细胞复合体均为表面光滑的凝胶状,弹性较好;番红O染色2周时细胞外基质几乎不着色,4周时可见细胞周围呈粉色的弱阳性染色,8周时多数细胞周围呈红色阳性染色。HE染色和扫描电镜各时间点均可见细胞均匀分布于网络状支架内;BrdU免疫荧光法显示细胞在支架中生存状态良好,培养4周时阳性细胞数较培养2周时明显增多(P<0.05),8周时较4周时明显增多(P<0.05)。培养4周时GAG含量较培养2周时明显增高(P<0.05),8周时较4周时明显增高(P<0.05);培养4周时与培养2周时比较3个目的基因mRNA表达量均增高,差异有显著性(P<0.05),8周时与4周时比较亦明显增高(P<0.05)。结论:以兔自体PRP凝胶与ADSCs构建的复合体在体外培养时细胞可以向类髓核样细胞分化,用此方法构建可注射组织工程髓核具有可行性。

接触式细胞共培养诱导人脐带华通胶间充质干细胞向类髓核细胞分化

目的:观察接触式细胞共培养条件下,人髓核细胞对脐带华通胶间充质干细胞(Wharton′s jelly-derived mesenchymal stem cells,WJMSCs)的诱导分化效应,为椎间盘退变性疾病的治疗寻找种子细胞来源。方法:取足月产健康新生儿脐带约30cm,分离、纯化、培养WJMSCs;取人椎间盘髓核组织,酶消化法分离培养髓核细胞。取第三代稳定增殖的WJMSCs,利用流式细胞方法检测细胞免疫表型CD73/CD90/CD105/CD34/CD45/HLA-ABC/HLA-DR。用羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记WJMSCs,与髓核细胞以1∶1比例进行混合,在6孔板中进行接触式细胞共培养;以单独培养的WJMSCs为对照组。培养7d后利用高速流式细胞仪分选荧光标记阳性的WJMSCs,提取细胞总RNA,进行反转录获得cDNA,利用Real-Time PCR方法检测其Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅵ型胶原、蛋白多糖、SOX-9和多能聚糖基因的相对表达,管家基因GAPDH作为内参,单独培养的WJMSCs作为对照,利用2-ΔΔCt方法计算基因相对表达变化。结果:WJMSCs原代细胞接种24h可见部分细胞贴壁生长,形态为梭形和多角形,1周后形成集落,2周时细胞融合达到90%。流式细胞检测结果显示CD73/CD90/CD105/和HLA-ABC(+),CD34/CD45和HLA-DR(-)。与髓核细胞共培养7d后WJMSCs的Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因相对表达较对照组显著性增加(P<0.01),Ⅰ型胶原、Ⅵ型胶原和多能聚糖基因相对表达未见显著性变化(P>0.05)。结论:通过接触式细胞共培养人脐带WJMSCs能够被髓核细胞诱导分化为类髓核细胞,可为组织工程技术和细胞治疗修复退变椎间盘提供种子细胞来源。

牛膝提取物对大鼠骨髓间充质干细胞向髓核样细胞增殖与分化的影响

目的研究牛膝提取物对大鼠骨髓间充质干细胞向髓核样细胞增殖与分化的影响。方法分离培养原代大鼠骨髓间充质干细胞后,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分成对照组和牛膝提取物组(10、30、50μg/mL)。培养14 d后,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,阿利新蓝法检测葡糖胺聚糖含有量,实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)、免疫印迹(Western blot)检测细胞中Sox-9、Ⅱ型胶原(ColⅡ)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)水平。SIRT1抑制剂(尼克酰胺)处理细胞,MTT法检测细胞增殖,RT-PCR和免疫蛋白印迹检测SIRT1、Sox-9水平。结果骨髓间充质干细胞表面CD90和CD44呈阳性表达,而CD45和CD34呈阴性表达。与对照组比较,牛膝提取物可显著促进骨髓间充质干细胞细胞增殖,抑制细胞凋亡,上调细胞葡糖胺聚糖含有量及Sox-9、ColⅡ、Aggrecan水平,以上差异均有统计学意义(P <0. 05),并呈剂量依赖效应。另外,尼克酰胺可抑制牛膝提取物诱导的骨髓间充质干细胞细胞增殖和Sox-9表达升高。结论牛膝提取物可通过上调SIRT1水平来促进骨髓间充质干细胞向髓核样细胞增殖与分化。