嗅鞘细胞移植后脊髓损伤区髓磷脂相关糖蛋白表达的动态变化

目的:观察嗅鞘细胞移植对脊髓损伤区轴突生长抑制因子髓磷脂相关糖蛋白的影响。方法:实验于2005-08/2006-02在西安交通大学教育部环境与疾病相关基因研究重点实验室完成。①选取成年SD大鼠40只,随机数字表法分为正常组、模型组、DF12对照组、嗅鞘细胞组,10只/组。②除正常组外,其余各组均建立脊髓全横断损伤模型。术后嗅鞘细胞组在距损伤缘上下各1mm处注射原代培养12d的成年大鼠嗅鞘细胞悬液,浓度调整为1×1011L-1,深度均为1.0mm,每处各注射细胞悬液1μL。DF12对照组注射DF12培养液,方法与剂量同上。模型组、正常组均不进行任何移植处理。③分别于移植后1,4,8周采用组织学、行为学方法和免疫印迹技术检测各组动物脊髓损伤区髓磷脂相关糖蛋白表达的变化。结果:实验选取40只SD大鼠均进入结果分析。①组织学检查嗜银染色结果:移植8周后除正常组外,其余各组均可见明显的神经纤维再生,但模型组、DF12对照组大部分纤维排列紊乱如乱发状,明显迂曲;而嗅鞘细胞组新生轴突明显,无论数量还是质量都优于模型组及DF12对照组。②移植后不同时间点各组下肢运动功能检测BBB评分结果的比较:移植1,4,8周,嗅鞘细胞组BBB评分均明显高于模型组、DF12对照组,且移植4,8周时差异有显著性意义[(5.25±1.28),(1.62±1.50),(2.25±1.03)分;(11.5±2.20),(4.37±1.84),(3.75±1.03)分;F=18.090～47.635,P均<0.01]。③髓磷脂相关糖蛋白westernblot检测结果:模型组、DF12对照组、嗅鞘细胞组脊髓损伤后髓磷脂相关糖蛋白的表达明显增强,均明显高于正常组(P<0.05);但嗅鞘细胞组明显低于模型组、DF12对照组(P<0.05)。结论:嗅鞘细胞移植可能通过降低脊髓损伤后损伤区髓磷脂相关糖蛋白的表达,从而促进损伤脊髓的修复。

脑缺血-再灌注损伤对大鼠脑组织髓磷脂相关糖蛋白表达的影响

目的探讨脑缺血-再灌注损伤对大鼠脑组织髓磷脂相关糖蛋白(MAG)表达的影响。方法应用线栓法制作大鼠脑缺血-再灌注损伤模型;采用免疫荧光化学和免疫印迹法研究大鼠脑缺血-再灌注损伤后MAG表达的定位和定量的变化。结果脑缺血-再灌注后4 h和24 h大鼠皮质区MAG的表达有增高趋势,但是差异无统计学意义;基底核区MAG的表达4 h即开始升高,但差异亦无统计学意义。缺血组基底核区MAG 24 h的表达与无缺血组比较,差异有统计学意义,(P<0.05)。免疫荧光实验显示,阳性表达在基底核的向质区域,与细胞核的复染发现,主要表达在细胞间。结论大鼠腑缺血再灌注后MAG的表达在皮质区有增加趋势,在基底核区的表达明显增高,24 h缺血组显著高于无缺血组。提示脑缺血-再灌注损伤不仅损伤神经元,其白质也存在损伤,干预白质损伤可能是脑缺血-再灌注损伤新的治疗靶点。

腺病毒介导神经生长因子和髓磷脂相关糖蛋白双基因在受损坐骨神经中的表达

背景:神经生长因子和髓磷脂相关糖蛋白能够促进损伤神经的结构与功能恢复,但目前未见通过转基因技术增加受损周围神经中神经生长因子与髓磷脂相关糖蛋白基因表达的报道。目的:探讨神经生长因子和髓磷脂相关糖蛋白双基因经腺病毒介导在大鼠损伤坐骨神经的共表达效果。方法:将40只SD大鼠随机分为正常对照组、坐骨神经损伤组、空病毒组、神经生长因子组和神经生长因子/髓磷脂相关糖蛋白组。后4组切断并缝合右侧坐骨神经建立坐骨神经损伤模型后,分别肌肉注射生理盐水、生理盐水、空腺病毒(1×108 PFU/次)、携带神经生长因子的腺病毒(1×108 PFU/次)和携带神经生长因子和髓磷脂相关糖蛋白的腺病毒(1×108 PFU/次),每2 d注射1次,连续注射3次。结果与结论:神经生长因子组和神经生长因子/髓磷脂相关糖蛋白组大鼠坐骨神经中神经生长因子表达水平显著高于空病毒组和正常对照组(P<0.05);神经生长因子/髓磷脂相关糖蛋白组大鼠坐骨神经中髓磷脂相关糖蛋白表达水平显著高于空病毒组、神经生长因子组和正常对照组(P<0.05)。提示腺病毒介导的神经生长因子/髓磷脂相关糖蛋白双基因可有效表达于大鼠损伤坐骨神经。

髓磷脂相关糖蛋白对周围神经影响的研究进展

髓磷脂相关糖蛋白(myelin associated glycoprotein,MAG)是一种定位于髓鞘轴突旁的施万细胞和少突胶质细胞上的跨膜糖蛋白,并在胶质和轴突之间发挥作用。它属于免疫球蛋白超家族中的唾液酸亚群,包含着5个免疫球蛋白样区域。MAG分为大、小两个亚型,这两个亚型在髓鞘形成和维持的不同阶段有着不同的表达。MAG的信号转导通路发生在髓鞘形成的少突胶质细胞或施万细胞以及有髓鞘轴突的轴浆中。它是一个双功能蛋白,对大多数神经元有抑制作用而对发育早期的背根神经节神经元有促进作用,即在神经发育的不同时期发挥不同的作用。随着对MAG研究的不断深入,通过调节其信号转导通路来促进神经再生成为这个领域研究的一个重点。

TNF-α和IFN-γ影响许旺细胞生长及髓鞘相关糖蛋白mRNA表达水平的研究

目的研究肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)对体外培养的许旺细胞(SCs)生长和髓鞘相关糖蛋白(MAG)mRNA表达水平的影响。方法建立许旺细胞与神经细胞(NCs)联合培养模型,绘制许旺细胞生长曲线,采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测TNF-α和INF-γ对MAGmRNA表达水平的影响。结果许旺细胞培养液中加入TNF-α和IFN-γ后,许旺细咆增殖数目明显增加且高于单纯许旺细胞培养组(q=7.476,P=0.000;q=6.631,P=0.000);而TNF-α组与IFN-γ组之间差异无统计学意义(q=0.846,P=0.411)。无神经细胞存在时,许旺细胞不表达MAG mRNA;经神经细胞诱导后,许旺细胞MAC mRNA表达阳性,且具有时间性;加入TNF-α和IFN-γ后,许旺细胞MAG mRNA表达水平明显升高,且高于单纯许旺细胞与神经细胞共培养组(q=8.128,P=0.000;q=6.614,P=0.000),而加人TNF-α和IFN-γ的许旺细胞与神经细胞共培养组之间差异无统计学意义(q=1.515,P=0.156)。结论 TNF-α和IFN-γ具有促进许旺细胞增殖作用,且可提高髓鞘特异性基因MAG mRNA表达水平。提示,这两种炎性干扰因子可通过影响许旺细胞及MAC mRNA表达水平而间接影响髓鞘修复,为研究炎性脱髓鞘性神经疾病慢性期髓鞘修复障碍的发病机制提供了新的思路。

中药基于髓鞘相关抑制因子促神经再生作用靶点的研究进展

目的:基于髓鞘相关抑制因子为中药促神经再生相关作用靶点的研究提供参考。方法:以"髓鞘相关抑制因子""促神经再生""中药""Myelin-associated inhibitor factors""MAIFs""Promote nerve regeneration""Traditional Chinese medicine""Chinese medicine""TCM"等为关键词,在中国知网、万方数据、维普网、PubMed、Web of Science等数据库中组合查询2005年1月-2020年1月发表的相关文献,介绍髓鞘相关抑制因子的组成及抑制神经再生的作用机制,并归纳中药基于髓鞘相关抑制因子促神经再生的靶点研究进展。结果与结论:共检索到相关文献96篇,其中有效文献49篇。髓鞘相关抑制因子包括勿动蛋白(Nogo)、少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白(OMgp)和髓磷脂相关蛋白(MAG),3种蛋白可通过与Nogo受体结合形成三聚体复合受体,激活Rho A产生Rho激酶,两者结合激活催化区,使肌球蛋白轻链磷酸化并抑制肌球蛋白轻链激酶活性,导致生长锥回缩、塌陷以及生长锥细胞骨架重排,从而抑制轴突生长;可活化单丝氨酸蛋白激酶1,导致丝切蛋白因子磷酸化后失活、解聚,从而抑制轴突导向;还可通过细胞膜上的G蛋白偶联受体激活蛋白激酶C,促进Ca2+内流,抑制轴突生长。中药复方侯氏黑散、脊髓康、复健片、滋阴固本方、补肾益髓方等,以及中药活性成分三七总皂苷、苦参素、山楂总黄酮等均可通过降低Nogo蛋白表达从而促神经再生;中药复方复健片、首乌仙海片以及中药活性成分木瓜苷均可通过降低OMgp蛋白表达从而促神经再生;中药复方髓复康、补阳还五汤可通过降低MAG蛋白表达从而促进神经再生。中药可基于髓鞘相关抑制因子Nogo、OMgp、MAG,调节其上下游通路相关因子表达,从而促进神经再生。后续可深入挖掘基于髓鞘相关抑制因子促进神经再生的中药复方或活性成分,以期为促神经再生的相关研究提供参考。

髓鞘结合糖蛋白抑制神经干细胞向神经元分化和轴突生长

目的:观察来源于胚胎大鼠海马神经细胞的特征;观察髓鞘结合糖蛋白(MAG)对神经干细胞的增殖、分化及神经元轴突生长的影响。方法:从胚胎鼠的海马提取细胞进行体外培养,应用免疫荧光染色法检测神经干细胞(NSCs)标志蛋白nestin和doublecortin的表达。应用BrdU掺入法检测不同剂量的MAG-Fc对NSCs增殖的影响。免疫荧光染色法观察各种亚型神经细胞的比例并比较神经元样细胞的轴突长度。结果:来自SD大鼠16d胚胎海马的细胞明显表现出神经干细胞的特征。神经干细胞分化7d后,对照组新生成的β-tubulinⅢ阳性细胞的比例为18.17%±2.79%,其轴突长度为(136.27±33.66)μm。MAG-Fc(200μg/L)处理后,β-tubulinⅢ阳性细胞比例和轴突长度分别显著减少为10.05%±3.42%(P<0.01)和(84.87±24.94)μm(P<0.01)。增殖实验表明,不同浓度的MAG-Fc对神经干细胞的BrdU整合比率无明显影响(P>0.05)。结论:MAG-Fc对神经干细胞向神经元样细胞的分化及其轴突的生长均有抑制作用,但对神经干细胞的增殖无明显影响。

骨髓间充质干细胞移植治疗对大鼠脑梗死后神经再生抑制因素的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)静脉移植对大鼠脑梗死后Nogo-A、少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白(OMgp)和髓磷脂相关糖蛋白(MAG)蛋白的影响。方法实验动物分成假手术组、损伤对照组、溶剂对照组和移植组,各组再分为3d、7d、14d和21d组。全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs,线栓法制作大鼠脑梗死模型。移植组自大鼠尾静脉注射BMSCs悬液1ml,溶剂对照组注射磷酸盐缓冲液(PBS)。对各组动物进行神经功能缺损程度评分,免疫组化方法检测Nogo-A、OMgp和MAG的表达水平。结果移植组7、14和21d神经功能恢复优于对照组;移植组术后3、14和21d Nogo-A蛋白表达较对照组降低(P<0.05);移植组7、14和21d OMgp蛋白表达较对照组降低(P<0.05);移植组术后3、7、14和21d MAG蛋白表达较对照组降低(P<0.05)。结论 BMSCs移植可促进大鼠脑梗死后的神经功能恢复,其作用机制与下调Nogo-A、OMgp和MAG的表达有关。

Nogo/NgR网状通路干预治疗脊髓损伤研究进展

目前,脊髓损伤的治疗仍是临床医学尚未解决的难题之一,由于伤后脊髓轴突再生困难,患者很难得到有效地治疗。研究证明中枢神经系统轴突再生困难可能与胶质瘢痕和微环境中的抑制因子有关,而后者可能发挥更为重要的抑制作用。

IN-1以及联合NT-3对大鼠脊髓损伤后NF表达变化的影响及意义

目的探讨大鼠脊髓损伤后给予髓磷脂相关生长阻逆蛋白抗体(IN-1)以及和神经营养素3(NT-3)联合作用后神经元中丝蛋白(neurofilaments,NF)的表达有无变化。方法健康Sprague-Dawley(SD)大鼠18只,平均随机分为损伤对照组、IN-1组及IN-1和NT-3联合作用组。各组分别在术后28天取材行HE染色、免疫组化染色检测NF表达的变化。结果联合组NF染色灰度值明显小于其他两组(P<0.05或P<0.01)。结论IN-1及联合应用NT-3后可以促进脊髓损伤后轴突的再生,促进运动功能的恢复。

Nogo-A受体拮抗剂NEP1-40对新生大鼠HIBD中神经元轴突再生的影响

【目的】观察Nogo-A受体拮抗剂NEP1-40对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(hypoxic ischemic brain dam-age,HIBD)后神经再生的影响。【方法】将7日龄Wistar新生大鼠(n=100只)随机分为10组,2个不同时段(6 h、24h)的缺氧缺血性脑损伤模型组(HIBD组)、HIBD后NEP1-40治疗组(NEP1-40组)及神经节苷脂治疗组(GM-1组)和相应时段的空白对照组及假手术对照组,用免疫组化(SP法)的方法观察各组阳性细胞的表达情况。【结果】HIBD组两时段的阳性细胞数表达均显著高于同时段假手术组;NEP1-40治疗组能抑制HIBD后Nogo-A的表达,与同时段模型组对比差异有显著性;神经节苷脂治疗组Nogo-A的表达在6 h时与HIBD组差异无显著性,在24 h时较HIBD组低但高于NEP1-40组(P<0.05)。【结论】Nogo-A在缺氧缺血性脑损伤中表达显著增高,它可以抑制中枢神经损伤后的再生,NEP1-40能拮抗这一作用,从而促进缺氧缺血性脑损伤后神经的再生。

髓鞘相关抑制分子和视神经再生

哺乳动物视神经损伤后不能成功再生,除了视网膜神经节细胞再生能力低下外,与中枢神经系统中存在抑制微环境密切相关。少突胶质细胞产生的髓鞘相关抑制分子是构成这种抑制微环境的重要成分。目前已经鉴定的抑制分子主要有 Nogo、髓磷脂相关糖蛋白及少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白,他们通过同一受体复合体转导抑制信号。通过阻滞抑制分子及其受体或改变神经元的内在状态,可以克服抑制分子的抑制作用,促进视网膜神经节细胞轴索再生,为人类视神经损伤修复带来希望。

Nogo受体及其拮抗剂与神经节苷脂在新生大鼠HIBD中的作用

目的观察Nogo-A受体拮抗剂NEP1-40及神经节苷脂对新生大鼠缺血缺氧性脑损伤后神经再生的作用。方法将100只7日龄新生大鼠随机分为10组:在6 h、24 h两个时间段分别设空白对照组,假手术组,缺氧缺血性脑损伤(HIBD)模型组,HIBD后NEP1-40治疗组及神经节苷脂治疗组,用原位杂交的方法观察各组别Nogo-A mRNA的表达情况。结果HIBD组两时段的Nogo-mRNA表达均高于同时段空白组及假手术组,差异有统计学意义;NEP1-40治疗组能抑制HIBD后mRNA的表达,与同时段模型组对比差异有统计学意义;神经节苷脂治疗组mRNA的表达在6h时与HIBD组无明显差异,在24h时较HIBD组低但高于空白组。P值均<0.05。结论Nogo-A mRNA在缺氧缺血性脑损伤后表达显著增高,其编码的Nogo-A可抑制中枢神经损伤后的再生,NEP1-40能拮抗这一作用,从而可能在促进缺氧缺血性脑损伤后神经再生中起到作用。神经节苷脂GM-1在缺氧缺血性脑损伤后也可抑制Nogo-A mRNA的表达,有稳定细胞膜、减轻细胞水肿、促进神经再生的作用。

丙烯酰胺染毒对大鼠坐骨神经MBP和MAG表达的影响

目的:通过检测染毒大鼠坐骨神经中髓鞘碱性蛋白(MBP)和髓磷脂相关糖蛋白(MAG)表达量的变化,探讨丙烯酰胺(ACR)对大鼠周围神经系统的毒性影响。方法:成年雄性SD大鼠32只,随机分为对照组、9、18、36 mg/kg ACR组,每组8只,灌胃染毒21 d后取材。每周一次步态评分,记录大鼠步态改变;利用HE染色和劳克坚牢蓝染色,观察坐骨神经及其髓鞘的改变;通过免疫组织化学方法检测蛋白MBP和MAG表达量的变化。结果:大鼠步态得分与染毒剂量和染毒时间呈正相关; HE染色显示随染毒剂量增大,坐骨神经神经纤维排列紊乱、髓鞘结构发生改变、轴突数目减少;劳克坚牢蓝染色结果显示与对照组相比,染毒组髓鞘染色较浅、着色不均,髓鞘变细;免疫组化结果显示,MBP和MAG在坐骨神经中的表达量均随染毒剂量增大而下降。结论:ACR染毒对大鼠坐骨神经髓鞘的毒性损伤,可能与MBP和MAG蛋白表达量的下降有关。

Rho-ROCK信号通路研究进展

Ras同源基因-Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶(Ras homolog gene/a Rho-associated coiled coil-forming proteinkinase,Rho-ROCK)信号途径是中枢神经系统中普遍存在的一条通路,是介导抑制性信号阻断中枢神经细胞再生的重要途径。中枢神经损伤后再生困难的重要原因是其周围环境中存在强烈抑制再生的物质,并通过该途径介导神经再生障碍。熟悉Rho-ROCK信号通路及这些抑制性介质的作用,对研究神经损伤后再生与修复等具有重要意义。

丁苯酞对急性一氧化碳中毒大鼠脑组织Nogo／NgR表达的调节作用

目的探讨轴突生长抑制蛋白（Nogo）、髓磷脂相关糖蛋白（MAG）及其共受体Nogo受体1（NgR1）在急性一氧化碳（CO）中毒大鼠脑组织中的表达，以及丁苯酞（NBP）对CO中毒的神经保护作用。方法60只SD大鼠按随机数字表法分为正常对照组、CO中毒组和NBP治疗组．每组各20只。CO中毒组和NBP治疗组大鼠用高压氧舱法建立急性CO中毒模型并给予高压氧治疗，NBP治疗组大鼠在此基础上给予NBP（6mg／100g）灌胃。分别在中毒后1d、3d、1周、4周（每组每时间点取5只大鼠），应用免疫组化染色及免疫荧光染色双标法观察各组大鼠脑组织Nogo、MAG及NgR1的表达变化。结果随着中毒后病程的延长，CO中毒组大鼠脑组织Nogo、MAG及NgR1表达亦逐渐增加，在中毒后4周仍可观察到。给予NBP治疗能明显降低大鼠脑组织Nogo及NgR1蛋白的表达，其水平与CO中毒组相应时间点比较差异均有统计学意义（P〈0．05）；NBP治疗组大鼠脑组织MAG表达水平较CO中毒组相应时间点略有升高，但差异无统计学意义（P〉0．05）。结论CO中毒后脑损伤及脑组织脱髓鞘改变可能与CO诱导Nogo、MAG及NgR1蛋白表达改变有关。NBP能明显下调Nogo及NgR1（而不是MAG）的表达水平，从而对CO中毒后脑损伤有积极的保护作用。

NGF/MAG双基因共表达腺病毒修复大鼠周围神经损伤的实验研究

目的构建携带NGF及髓磷脂相关糖蛋白（myelin associated glycoprotein,MAG）基因序列的双基因共表达腺病毒（adenovirus expressing NGF and MAG,Ad-NGF-MAG）,探讨其在大鼠坐骨神经损伤修复中的作用。方法将NGF和MAG共同克隆至5型腺病毒穿梭质粒p CA 13,并在HEK 293细胞中包装得到重组腺病毒Ad-NGF-MAG并测序鉴定。取雄性SD大鼠32只,体质量180~200 g;随机分成4组（n=8）：对照组（正常对照）、空病毒组（Ad组）、单独表达NGF组（Ad-NGF组）和共表达NGF、MAG组（Ad-NGF-MAG组）。Ad组、AdNGF组和Ad-NGF-MAG组大鼠制备右侧坐骨神经损伤模型后,分别于术侧腓肠肌注射空腺病毒、Ad-NGF及AdNGF-MAG（1×108 PFU）,隔天1次,共3次。对照组仅暴露右侧坐骨神经后关闭切口,术后对应时间点注射生理盐水10μL。术后31 d,分别行坐骨神经功能指数（sciatic nerve function index,SFI）、神经电生理检测;切取坐骨神经标本,行RT-PCR及Western blot检测NGF及MAG m RNA及蛋白表达水平,以及组织学观察。结果实验成功构建重组腺病毒Ad-NGF和Ad-NGF-MAG。32只大鼠术后均成活,切口Ⅰ期愈合。Ad-NGF-MAG组SFI、神经传导速度、诱发电位波幅、潜伏期均明显优于Ad-NGF组和Ad组,但未达对照组水平,比较差异均有统计学意义（P〈0.05）。Ad-NGF-MAG组内MAG m RNA和蛋白表达最高,NGF m RNA和蛋白表达高于对照组和Ad组,比较差异均有统计学意义（P〈0.05）。组织学观察显示,对照组神经连续性好,Ad组神经纤维层次混乱,Ad-NGF组神经纤维层次结构清晰,局部断端再生良好,但神经纤维结构紊乱;Ad-NGF-MAG组神经纤维生长有序,神经直径较Ad-NGF组粗,神经纤维结构良好。结论坐骨神经损伤后修复过程中,腺病毒介导NGF与MAG共表达,既可促进神经纤维生长,又可抑制神经异常分支形成,促进神经结构与功能的恢复。