神经生长因子通过抑制内质网应激促进外周神经损伤后髓鞘碎片的清除

神经生长因子(never growth factor,NGF)可促进损伤外周神经的修复并加速轴突和髓鞘的再生,但对外周神经损伤前期作用的研究报道较少。本研究主要探究在损伤外周神经前期,NGF能否加速施旺细胞(Schwann cells,SCs)对髓鞘碎片的清除及其调控机制。将坐骨神经损伤的Wistar雄性大鼠连续5 d给予NGF治疗,并运用分子生物学检测手段分析损伤坐骨神经内部髓鞘碎片的清除,细胞的凋亡及内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)的表达和变化。免疫荧光分析结果显示,与模型组相比,NGF给药组显著加速髓鞘碎片的清除,并促进SCs的增殖(46.33±5.68 vs.66.69±8.76,P<0.05 for MPZ;47.58±4.52 vs.37.69±2.50,P<0.01for GFAP)。TUNEL免疫组化证实,NGF可有效抑制SCs的凋亡(25±4 vs.37±6,P<0.05),Western印迹结果显示,模型组坐骨神经内部内质网应激水平被过度激活,给予NGF治疗后,相关蛋白质表达被逆转(1.03±0.03 vs.1.24±0.07,P<0.01 for PDI;1.16±0.16 vs.1.48±0.10,P<0.05 for GRP-78;1.33±0.11 vs.1.76±0.17,P<0.01 for Caspase-12;1.01±0.05vs.1.39±0.16,P<0.01 for CHOP)。上述结果证实,NGF可通过抑制内质网应激减少神经组织内细胞的凋亡,并加速髓鞘碎片的清除,促进外周神经损伤的修复。

温肾通督方对脊髓损伤后微血管内皮细胞吞噬髓鞘碎片的影响

目的:探究温肾通督方对脊髓损伤后微血管内皮细胞(MECs)吞噬髓鞘碎片的影响及其作用机制。方法:采用改良A11en’s法制备脊髓损伤小鼠模型,1、3、7d后通过HE染色和尼氏染色观察损伤脊髓的病理改变。利用ELISA法检测损伤脊髓和血清中MCP-1、IL-6、IL-1β、TNF-α的表达水平,通过3D激光共聚焦观察损伤脊髓中MECs吞噬髓鞘碎片情况,采用多重免疫荧光染色检测脊髓损伤后MECs中HDAC6、LC3B、NLRP3表达。结果:与模型组比较,温肾通督方明显减少脊髓损伤后炎症细胞的浸润和神经元的固缩坏死;显著降低脊髓和血清中MCP-1、IL-6、IL-1β、TNF-α的水平(P<0.01,P<0.05);促进MECs吞噬髓鞘碎片,并能下调HDAC6、NLRP3表达,上调LC3B表达(P<0.01)。结论:温肾通督方可能通过抑制HDAC6促进MECs吞噬髓鞘碎片,并能同时阻断NLRP3通路的信号转导,共同改善炎性微环境,促进脊髓损伤修复。

基于HDAC6介导的自噬-溶酶体途径探究温肾通督方对微血管内皮细胞吞噬髓鞘碎片的影响

目的 基于组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)6介导的自噬-溶酶体途径,探究温肾通督方影响微血管内皮细胞(MECs)吞噬髓鞘碎片的作用机制。方法 通过CCK-8法检测温肾通督方冻干粉干预后MECs的增殖状态,筛选其最佳干预浓度;构建体外类血管结构,并建立髓鞘碎片与类血管结构共培养模型;将实验分为空白组(MECs)、模型组(MECs与髓鞘碎片共培养)、Tubastatin-A组(MECs与髓鞘碎片共培养+HDAC6抑制剂Tubastatin-A)以及温肾通督方组(MECs与髓鞘碎片共培养+温肾通督方冻干粉),通过免疫荧光染色法检测MECs吞噬髓鞘碎片的情况,并利用激光共聚焦进行拍照分析;通过Western Blot法检测MECs微管稳定系统(HDAC6、Kinesin5、Dynein)及自噬-溶酶体途径(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62、Beclin1)相关蛋白的表达。结果 免疫荧光结果表明,与模型组比较,Tubastatin-A组和温肾通督方组都可显著促进MECs吞噬髓鞘碎片(P<0.05)。Western Blot结果表明,与空白组比较,模型组HDAC6的蛋白表达显著增高(P<0.05);与模型组比较,Tubastatin-A组和温肾通督方组HDAC6的蛋白表达显著降低,而Kinesin5、Dynein、Beclin1、p-ULK1/ULK1的蛋白表达显著增高(P<0.05);与Tubastatin-A组比较,温肾通督方组HDAC6、Kinesin5、Dynein、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p-ULK1/ULK1的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论 MECs吞噬髓鞘碎片会导致HDAC6的表达上调,但并不会影响MECs微管稳定系统及自噬-溶酶体途径;Tubastatin-A及温肾通督方均可通过抑制HDAC6的表达增强MECs微管系统的稳定,进而激活自噬-溶酶体途径,促进MECs吞噬髓鞘碎片。

脂多糖干预对大鼠周围神经损伤后瓦勒变性的影响

目的探讨脂多糖对于大鼠坐骨神经损伤瓦勒变性早期髓鞘碎片清除的影响。方法将50只Wistar大鼠随机分成假手术组(10只),模型组(20只)和脂多糖LPS组(20只),LPS组及模型组横断大鼠右侧坐骨神经后,行神经外膜端端吻合;假手术组仅游离出坐骨神经,然后关闭切口。LPS组大鼠在神经断端显微注射LPS(2 g/L)1μL,模型组及假手术组大鼠注射同等体积生理盐水。于术后1.5、24 h和7 d取术侧坐骨神经。实时定量PCR(qRT-PCR)检测坐骨神经中白介素1β(IL-1β)mRNA、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA水平;免疫荧光法检测坐骨神经中CD68+巨噬细胞的表达;HE染色观察坐骨神经的病理变化;油红O染色观察坐骨神经脱髓鞘程度;LFB染色观察坐骨神经髓鞘变化;坐骨神经功能指数(SFI)评价大鼠运动功能的恢复情况。结果实时定量PCR显示,与假手术组相比,术后1.5 h模型组IL-1βmRNA和MCP-1 mRNA的表达均明显升高(P<0.001,P<0.001),与模型组相比,术后1.5 h LPS组IL-1βmRNA和MCP-1mRNA的表达明显升高(P<0.001,P<0.001)。术后24 h模型组IL-1βmRNA和MCP-1m RNA的表达均明显升高(P<0.001,P<0.001),与模型组相比,术后24h LPS组IL-1βmRNA和MCP-1 mRNA的表达明显升高(P<0.01,P<0.01)。免疫荧光可见,与模型组相比,术后7 d LPS组中CD68+细胞表达显著上调(P<0.05)。术后7 d坐骨神经HE染色可见,LPS组坐骨神经断端较多炎性细胞浸润,许旺细胞增殖活跃,模型组神经断端炎性细胞和许旺细胞较少。术后7 d坐骨神经ORO染色可见,与模型组相比,LPS组断端远侧脱髓鞘程度较高。术后7 d坐骨神经LFB染色可见,模型组和LPS组坐骨神经断端均出现脱髓鞘反应,但与模型组相比,LPS组神经断端残余髓鞘碎片明显减少(P<0.05)。SFI显示,与模型组相比,LPS组大鼠在术后10、20、30、40和50 d分别不同程度升高,术后20 d明显增高,差异有显著性(P<0.05)。结论脂多糖通过激活固有免疫系统加快大鼠坐骨周围神经损伤后瓦勒变性早期髓鞘碎片的清除。

泡沫细胞及其调控对脊髓损伤病理进程影响的研究进展

脊髓损伤是一种严重致残性疾病,其病理生理过程主要包括原发性损伤和继发性损伤,原发性损伤主要由瞬时机械损伤引起,继发性损伤主要由长期的炎症级联反应导致。在原发性机械损伤和继发性炎症损伤对髓鞘的破坏下,损伤局部存在大量富含胆固醇的髓鞘碎片,这些髓鞘碎片主要被骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)吞噬。由于BMDMs自身胆固醇的处理能力有限及外排功能不足,其胞内会形成大量由中性脂肪构成的脂质小滴,使得BMDMs表现出"泡沫样"形态,发展为泡沫细胞。泡沫细胞进一步加重损伤局部炎症,使得炎症迁延,并促进局部瘢痕的形成,从而阻碍神经再生及感觉、运动功能恢复。目前,对脊髓损伤中泡沫细胞的形成、作用机制及干预措施尚无较完整的总结。为此,笔者就泡沫细胞对脊髓损伤病理进程影响及其调控的研究进展进行综述,为脊髓损伤的相关基础研究及临床治疗提供新的思路。

成纤维细胞生长因子10通过Rho A/ROCK信号通路稳定微管并维持神经元生存

目的探讨成纤维细胞生长因子10(FGF10)对神经元损伤的保护作用及其潜在的分子机制。方法剥离新生SD乳鼠的脑组织并提取其中的皮层神经元,将其种植于含L-多聚赖氨酸的孔板上进行培养,并分为正常组、髓鞘碎片组和髓鞘碎片+FGF10组,其中髓鞘碎片组神经元在培养4 h后添加一定含量的髓鞘碎片溶液(终浓度为10μg/mL),而髓鞘碎片+FGF10组神经元同时在培养基内添加髓鞘碎片和FGF10溶液(终浓度为4.3 nmol/L)。培养1周后,应用TUNEL染色、流式细胞术检测各组神经元的凋亡情况,应用活/死细胞染色、CCK-8法检测各组神经元的生存情况,应用Western blotting、免疫荧光双标染色检测各组神经元内凋亡相关蛋白、微管相关蛋白和RAS同源基因家族成员A(Rho A)/Rho A相关蛋白激酶(ROCK)信号通路相关蛋白的表达。结果与正常组相比,髓鞘碎片组中TUNEL染色所示神经元凋亡率明显升高,流式细胞术所示早期神经元凋亡率明显升高,活化半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)蛋白表达明显升高,Bcl-2/Bax值明显降低,活/死细胞染色所示神经元死亡率明显升高,CCK-8法所示神经元生存率明显降低,乙酰化微管蛋白/酪氨酸微管蛋白(Ace/Tyr-tubulin)值明显降低,Tau蛋白表达明显降低,Ace/Tyr-tubulin荧光强度比值明显降低,Rho A、ROCK蛋白表达明显升高,Rho A荧光强度值明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与髓鞘碎片组相比,髓鞘碎片+FGF10组中TUNEL染色所示神经元凋亡率明显降低,流式细胞术所示早期神经元凋亡率明显降低,活化caspase-3蛋白表达明显降低,Bcl-2/Bax值明显升高,活/死细胞染色所示神经元死亡率明显降低,CCK-8法所示神经元生存率明显升高,Ace/Tyr-tubulin值明显升高,Tau蛋白表达明显升高,Ace/Tyr-tubulin荧光强度比值明显升高,Rho A、ROCK蛋白表达明显降低,Rho A荧光强度值明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论FGF10可能通过抑制Rho A/ROCK信号通路进而促进神经元内微管稳定,从而对抗神经元在髓鞘碎片环境下发生的凋亡并提高其生存率。