新型高丝氨酸脱氢酶的挖掘与改造研究

高丝氨酸脱氢酶(homoserine dehydrogenase,HSD)是L-高丝氨酸和L-苏氨酸等天冬氨酸家族氨基酸生物合成的关键酶,然而由于其活性较低且受到L-苏氨酸等的反馈抑制作用,严重制约了L-高丝氨酸和L-苏氨酸等氨基酸的生物合成水平。该研究通过数据库检索,挖掘了8个不同来源的高丝氨酸脱氢酶。通过酶活测定分析法发现,来源于二穗短柄草(Brachypodium distachyon)的高丝氨酸脱氢酶BdHSD具有最高的催化活性,达到7.6 U/mg,且不受L-苏氨酸的反馈抑制,其催化最适pH值为10.5,最适催化温度为38℃。随后该研究进一步对BdHSD进行定向进化,提高BdHSD的催化活性。通过多轮筛选获得了3个具有更高催化活性的BdHSD突变体T186A、N283K、A137T/I188V,其中突变体T186A酶活性达到10.3 U/mg,比野生型提高了35.6%。通过L-高丝氨酸发酵分析发现,BdHSD突变体能有效提升L-高丝氨酸的合成水平。综上所述,该研究挖掘和改造了一个具有高效催化特性的高丝氨酸脱氢酶BdHSD,为L-高丝氨酸、L-苏氨酸和L-蛋氨酸等天冬氨酸家族氨基酸的高效生物合成提供了有力的催化元件。

N-酰基高丝氨酸内酯酶在肉鸡中应用的耐受性评价

本试验依据《饲料和饲料添加剂畜禽靶动物耐受性评价试验指南(试行)》对N-酰基高丝氨酸内酯酶(AHLase)在肉鸡中的应用进行耐受性评价。采用双因素试验设计,选取健康、体重接近的1日龄科宝肉仔鸡360只,随机分为3组,每组6个重复,每个重复20只鸡,公母各占1/2且分笼饲养。对照组饲喂基础饲粮,试验组在基础饲粮中分别添加500(AHLase-500)和5000 mg/kg(AHLase-5000)的AHLase。试验期42 d。结果表明:1)与对照组相比,AHLase-5000组公鸡1~21日龄的平均日采食量显著提高(P<0.05),22~42日龄以及1~42日龄的料重比显著降低(P<0.05);AHLase-5000组母鸡22~42日龄末重显著提高(P<0.05),而AHLase-500、AHLase-5000组1~42日龄母鸡的平均日采食量显著降低(P<0.05)。2)试验期内公鸡的平均日增重、平均日采食量显著高于母鸡(P<0.05)。1~21日龄公鸡的料重比有高于母鸡的趋势(P=0.075)。性别对1~21日龄肉鸡末重表现出趋于显著的影响(P=0.079)。3)随着AHLase添加水平的增加,1~21日龄肉鸡的平均日采食量显著提高(P<0.05),平均日增重有提高的趋势(P=0.052),而料重比显著降低(P<0.05);22~42日龄肉鸡的末重显著提高(P<0.05)。4)AHLase添加水平和性别在1~21日龄平均日采食量、22~42日龄平均日采食量以及1~42日龄料重比中均表现出显著互作效应(P<0.05);在22~42日龄料重比(P=0.069)以及1~42日龄平均日增重(P=0.064)中表现出互作趋势。5)饲粮中添加AHLase对肉鸡血常规和血清生化指标无显著影响(P>0.05)。6)饲粮中添加AHLase对肉鸡器官指数无显著影响(P>0.05),组织未观察到形态结构变化。由此可见,饲粮中添加5000 mg/kg的AHLase改善了肉鸡生长性能,对血液生理生化指标和内脏器官发育无显著影响,表明肉鸡对AHLase的耐受剂量在5000 mg/kg以上。

N-酰基高丝氨酸内酯酶对肉仔鸡生长性能、屠宰性能和养分表观代谢率的影响

本试验旨在研究N-酰基高丝氨酸内酯酶对肉仔鸡生长性能、屠宰性能和养分表观代谢率的影响。选取健康、体重接近的1日龄科宝肉仔鸡600只,随机分为5组,每组6个重复,每个重复20只鸡,公母各占1/2且分笼饲养。对照组饲喂基础饲粮,试验组在基础饲粮中分别添加250、500、750、1 000 mg/kg的N-酰基高丝氨酸内酯酶。试验期42 d。结果表明:1)与对照组相比,饲粮中添加500 mg/kg N-酰基高丝氨酸内酯酶可以显著提高1~21日龄公鸡的平均日采食量(P<0.05),添加500、750 mg/kg N-酰基高丝氨酸内酯酶显著降低母鸡的料重比(P<0.05)。公鸡的平均日增重、平均日采食量和料重比均显著高于母鸡(P<0.05)。随着N-酰基高丝氨酸内酯酶添加水平的增加,肉鸡的平均日增重有提高趋势(0.05<P<0.10),料重比显著降低(P<0.05)。N-酰基高丝氨酸内酯酶添加水平和性别对料重比有显著互作效应(P<0.05)。2)与对照组相比,添加500、750、1 000 mg/kg N-酰基高丝氨酸内酯酶能显著降低22~42日龄公鸡的平均日采食量和料重比(P<0.05),母鸡的料重比有降低趋势(0.05<P<0.10)。公鸡的平均日增重、平均日采食量均显著高于母鸡(P<0.05),而料重比显著低于母鸡(P<0.05)。随着N-酰基高丝氨酸内酯酶添加水平的提高,肉鸡的平均日采食量有降低的趋势(0.05<P<0.10),而料重比显著降低(P<0.05)。3)与对照组相比,添加1 000 mg/kg N-酰基高丝氨酸内酯酶可以显著降低1~42日龄公鸡和母鸡的平均日采食量和料重比(P<0.05)。公鸡的平均日增重、平均日采食量均显著高于母鸡(P<0.05),而料重比显著低于母鸡(P<0.05)。随着N-酰基高丝氨酸内酯酶添加水平的提高,肉鸡的平均日采食量和料重比显著降低(P<0.05)。4)与对照组相比,添加500、750、1 000 mg/kg N-酰基高丝氨酸内酯酶显著提高肉鸡的屠宰率、全净膛率、半净膛率和胸肌率(P<0.05),显著降低腹脂率(P<0.05)。5)与对照组相比,N-酰基高丝氨酸内酯酶对干物质、粗蛋白质和能量表观代谢率有显著影响(P<0.05)。由此可见,饲粮中添加N-酰基高丝氨酸内酯酶显著改善了不同性别科宝肉仔鸡的生长性能、屠宰性能和养分表观代谢率。其中,添加500 mg/kg的N-酰基高丝氨酸内酯酶的效果最佳。

N-酰基高丝氨酸内酯酶对肉仔鸡血清生化、免疫指标以及肠道形态的影响

本试验旨在研究N-酰基高丝氨酸内酯酶对肉仔鸡血清生化、免疫指标和肠道形态的影响。选取1日龄健康、体重相近的科宝肉仔鸡600只,随机分为5组,每组6个重复,每个重复20只鸡。对照组饲喂基础饲粮,试验组在基础饲粮中分别添加250、500、750和1000 mg/kg的N-酰基高丝氨酸内酯酶。试验期42 d。结果表明:1)与对照组相比,饲粮中添加N-酰基高丝氨酸内酯酶显著提高21和42日龄肉鸡血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白和尿酸含量,以及21日龄血清尿素氮含量(P<0.05)。2)与对照组相比,饲粮中添加N-酰基高丝氨酸内酯酶显著提高21日龄肉鸡血清中碱性磷酸酶活性(P<0.05)。3)与对照组相比,饲粮中添加N-酰基高丝氨酸内酯酶显著提高21日龄肉鸡血清中脂蛋白含量,以及42日龄血清脂蛋白和胆固醇含量(P<0.05)。4)与对照组相比,饲粮中添加N-酰基高丝氨酸内酯酶显著提高21和42日龄肉鸡血清中免疫球蛋白A和免疫球蛋白M含量(P<0.05)。5)与对照组相比,饲粮中添加N-酰基高丝氨酸内酯酶显著提高肉鸡的胰腺指数(P<0.05)。6)与对照组相比,饲粮中添加N-酰基高丝氨酸内酯酶显著提高肉鸡十二指肠、空肠和回肠的绒毛高度和绒隐比(P<0.05),显著降低回肠隐窝深度(P<0.05)。综上所述,饲粮中添加N-酰基高丝氨酸内酯酶促进蛋白质和脂质在肉鸡体内的代谢和周转,并改善了肠道形态,其中添加500 mg/kg的N-酰基高丝氨酸内酯酶对肉鸡健康和生长的效果最佳。

双酶偶联法测定发酵液中L-高丝氨酸的含量

L-高丝氨酸是一种重要的非蛋白质氨基酸,在食品、饲料、医药和化工等领域具有非常广泛的应用。近年来通过环境友好的微生物发酵法生产L-高丝氨酸受到广泛关注。在工业菌种迭代选育过程中存在大量的L-高丝氨酸发酵样品分析检测工作,但目前关于L-高丝氨酸检测方法的报道仍然较少。该研究将胱硫醚γ-裂解酶和乳酸脱氢酶偶联催化,建立了一种简单快速的L-高丝氨酸检测方法。通过对检测体系中各组分进行系统优化,确定了反应体系中最佳试剂浓度为胱硫醚γ-裂解酶12 U/mL,乳酸脱氢酶50 U/mL,NADH 0.5 mmol/L,磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate,PLP)0.1 mmol/L,检测温度为40℃,pH为7.5。该方法检测灵敏,在L-高丝氨酸质量浓度为0.005~0.1 g/L时具有良好的线性关系,R 2达到0.9982,能够满足发酵液中L-高丝氨酸产量的测定,为L-高丝氨酸高产菌种的选育提供了重要技术支撑。

产O-乙酰高丝氨酸的大肠杆菌构建与发酵测试

O-乙酰高丝氨酸(OAH)是具有潜在工业应用价值的前体化合物,可用于制备高丝氨酸与蛋氨酸等。以一株改造自苏氨酸产生菌的Escherichia coli Thr L为出发菌株,过表达OAH合成途径中的关键酶高丝氨酸脱氢酶基因thr A和高丝氨酸乙酰基转移酶基因met X,并利用不同强度的启动子组合优化这两个基因的表达水平,通过发酵培养基中的苏氨酸和酵母粉的浓度优化以提升OAH的产生菌株的生产性能。通过启动子组合优化结果发现,当thr A与met X均采用J23110启动子时,该重组菌株E.coliOAH4的OAH合成能力最强,摇瓶发酵50 h后,其OAH产量为1.54 g/L。当苏氨酸的浓度为2 g/L,酵母粉的浓度为6 g/L时,E.coli OAH4的发酵水平最高,摇瓶发酵50 h后,OAH的产量可进一步提升至1.98 g/L。本研究首次在E.coli中实现了OAH的合成,并通过发酵优化确定了OAH的最优发酵条件,为后续OAH生产应用研究奠定了基础。

谷氨酸棒状杆菌合成L-高丝氨酸的代谢改造与发酵条件探究

目的:本研究以谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032为底盘细胞,构建1株L-高丝氨酸合成菌株并分析溶氧环境对其产物合成的影响。方法:首先通过外源添加0~40 g/L的L-高丝氨酸分析谷氨酸棒状杆菌的产物耐受性;随后,通过基因thrB敲除阻断L-高丝氨酸的降解途径,获得谷氨酸棒状杆菌重组菌H1;在此基础上利用挡板摇瓶进行细胞培养以增强发酵过程中氧气供给能力。结果:与大肠杆菌相比,谷氨酸棒状杆菌对L-高丝氨酸具有更强耐受性。研究中通过敲除基因thrB构建了L-苏氨酸缺陷型谷氨酸棒状杆菌重组菌H1,发现基础培养基中加入0.5 g/L的L-苏氨酸后,该重组菌生长恢复正常水平。挡板摇瓶条件下重组菌H1的L-高丝氨酸产量增加至836.7 mg/L,较普通摇瓶产量44.6 mg/L提高了17.76倍。结论:通过阻断L-苏氨酸的合成,成功构建L-高丝氨酸合成菌株谷氨酸棒状杆菌H1,并且发现利用挡板摇瓶增强发酵过程中供氧能力是促进谷氨酸棒状杆菌高效合成L-高丝氨酸的有效手段,为后续提高L-高丝氨酸发酵产量提供了参考。

谷氨酸棒状杆菌高丝氨酸脱氢酶单突变体酶学性质表征

通过定点突变技术,提高高丝氨酸脱氢酶(homoserine dehydrogenase,HSD)的催化活性,减少通路中代谢产物对其产生的反馈抑制和阻遏作用。对HSD与底物高丝氨酸分子进行对接,通过其空间结构分析,选择Asp61和Gly25两个关键位点进行定点饱和突变,通过酶活力筛选,发现突变体A61L和G25G较野生型(wildtype,WT)酶活力显著提高。对这两个突变体进行酶动力学和酶学性质研究,结果显示:相较于WT,A61L和G25G的Km值降低,底物亲和力增强,酶活力分别提高到1.21、1.35倍;n值减小,正协同性增加;A61L和G25G最适温度与WT相同均为40℃;A61L最适pH值与WT相同为8.0,G25G最适pH值为8.5较WT提高;A61L和G25G酶活力半衰期较WT分别延长1h和减少0.5h;低浓度K^(+)、Mg^(2+)、Ca^(2+)对突变体和WT有激活作用;不同体积分数甲醇、乙醇、乙腈和二甲基亚砜对突变体和WT有明显抑制作用;在1~25mmol/L抑制剂浓度下,突变体受抑制作用较WT明显减弱。本研究获得酶活力提高、别构抑制减弱的突变体G25G和A61L,为优化HSD合成代谢途径和构建高产蛋氨酸、苏氨酸和异亮氨酸菌株提供了参考。

N-酰基高丝氨酸内酯半抗原衍生物及其全抗原的合成与鉴定

目的本研究旨在合成N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactone,AHL)全抗原,为建立AHL免疫检测新方法奠定基础。方法以γ-丁内酯和高丝氨酸内酯为原料,经保护、缩合、脱保护、氧化等一系列反应,获得N-丁酰高丝氨酸内酯、N-己酰高丝氨酸内酯和含有化学交联活性基团的羧基丁酰高丝氨酸内酯半抗原衍生物,用核磁共振氢谱和质谱方法进行结构确证,并采用活泼酯法合成N-酰基高丝氨酸内酯全抗原。结果质谱与核磁共振氢谱分析结果与理论预测相同,表明成功合成目标产物N-丁酰(己酰)高丝氨酸内酯和羧基丁酰高丝氨酸内酯半抗原衍生物;紫外吸收光谱扫描结果显示半抗原AHL已分别与载体牛血清白蛋白和鸡卵白蛋白交联,成功制备其全抗原。结论本实验成功合成了N-酰基高丝氨酸内酯半抗原衍生物和全抗原,为制备AHL相应抗体奠定了基础。

药物中间体L-高丝氨酸甲酯的不对称合成

研究了药物中间体L-高丝氨酸酯的不对称合成的方法。该方法不仅解决了通常发生在有机合成中多官能团羧酸的直接酯化的关键问题,而且在该合成反应中不用保护试剂CBZ或BOC就可以直接酯化,得到了构型保持的目的产物L-高丝氨酸酯。

一株降解N-酰基高丝氨酸内酯酵母菌菌株的分离鉴定及其降解特性

利用N酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactone,简称AHL)为唯一碳源和能源,筛选得到一株能够降解AHL的菌株R1。常规鉴定和18S rDNA序列分析表明,菌株R1属于红冬孢酵母菌(Rhodosporidium toruloides),定名为R.toruloidesR1。结果显示R.toruloidesR1能利用所测试的3种AHL作为唯一碳源和能源生长,具有降解AHL的能力,其对AHL依赖型胡萝卜欧文氏软腐病菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)的致病有一定的抑制作用。

HPLC-MS法检测N-酰基-高丝氨酸内酯类信号分子

建立了HPLC-MS检测群体感应信号分子N-酰基-高丝氨酸内酯类(N-acyl-homoserine lactones,AHLs)化合物的方法。利用该方法对细菌发酵液中的AHLs进行分析,结果表明,样品只需简单的处理,在没有标样的条件下,可以对样品中任意的AHLs分子进行定性分析。该方法简单、高效,检测的灵敏度明显大于经典的TLC-B iosensor检测AHLs的方法,为从复杂混合物中鉴定AHLs提供了有效手段。

芽孢杆菌酰基高丝氨酸内酯酶基因的克隆及表达

N -酰基高丝氨酸内酯 (N -acyl-homoserinelactones,AHLs)作为细菌群体应答系统 (Quorum -sensing)中的关键信号分子 ,其浓度是决定许多动、植物病原菌致病基因的表达的关键因子。酰基高丝氨酸内酯酶基因可以水解AHLs分子的内酯键 ,使AHLs失去生物活性 ,从而减弱致病菌的危害。该研究旨在从芽孢杆菌中克隆酰基高丝氨酸内酯酶基因并获得纯化蛋白。根据已知酰基高丝氨酸内酯酶基因的保守序列设计引物 ,利用PCR方法从 2株芽孢杆菌的基因组DNA中克隆出两个基因SS1和SS10。利用在基因库中进行同源比对 ,结果表明SS1和SS10编码的蛋白产物SS1和SS10均为酰基高丝氨酸内酯酶。将两个基因在大肠杆菌中诱导表达 。

气相色谱-质谱法检测细菌中N-酰基高丝氨酸内酯类信号分子

建立了N-酰基高丝氨酸内酯类(N-acyl-homoserine lactones,AHLs)群体感应信号分子的气相色谱-质谱(GC-MS)检测方法,并优化了检测条件。在优化条件下,采用选择离子扫描模式(SIM)从细菌Pseud-oalteromonas sp.NJ6-3-1培养液中检测到3种AHLs(N-己基高丝氨酸内酯(C6-HSL)、N-辛基高丝氨酸内酯(C8-HSL)和N-十四基高丝氨酸内酯(C14-HSL))。与传统的薄层层析-生物传感器(TLC-biosensor)和高效液相色谱法(HPLC)相比,该方法更加简单、高效,只需对培养液样品进行简单处理,即可定性检测样品中的AHLs分子。该方法为从复杂基质中检测和鉴定AHLs信号分子提供了有效手段。

谷氨酸棒杆菌高丝氨酸脱氢酶编码基因hom的敲除

以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)标准菌株ATCC13032染色体为模板,设计引物PCR扩增高丝氨酸脱氢酶编码基因(hom),在hom基因内部插入一段来源于质粒pET28a的卡那霉素抗性基因(Km),得到基因元件hom::Km;通过电击转化法将hom::Km转入出发菌株替换原菌株的hom,在含卡那霉素的平板上挑取阳性转化子,通过PCR验证得到高丝氨酸脱氢酶缺陷的重组菌。发酵结果表明重组菌C.g-hom::Km-8发酵60h赖氨酸产量达到4.7g/L,是出发菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13032(0.7g/L)的6.7倍。

高丝氨酸内酯酶AI-96对嗜水气单胞菌NJ-1浸浴攻毒斑马鱼保护效应的研究

为评价斑马鱼口服高丝氨酸内脂酶AI-96对嗜水气单胞菌NJ-1浸浴攻毒的保护效应,实验设置基础料与实验料两组饲料,实验料是在基础料中按3 U/g饲料添加N酰基高丝氨酸内酯酶AI-96(以下简称AI-96),通过高浓度(2.5×108cfu/mL)及低浓度(0.7×108cfu/mL)两组剂量的嗜水气单胞菌NJ-1(以下简称NJ-1)分别浸浴攻毒斑马鱼,在12 h、24 h、3 d、7 d和14 d取鳃丝、肠道壁、肝和肾样,采用实时荧光定量PCR法检测取样器官中NJ-1量,并统计攻毒周期内的死亡率,来评价高丝氨酸内酯酶AI-96的保护力。结果显示:在攻毒周期内所取组织内均检测到NJ-1,按菌数肠>鳃>肝>肾,其中高NJ-1剂量未加酶组各组织NJ-1数量均分别明显高于低剂量处理组。在高剂量攻毒条件下,加酶组各组织NJ-1数量均显著低于未加酶处理组(P<0.05),鳃除外;在低剂量攻毒条件下,未加酶组的NJ-1数量在鳃(3 d)、肠(0.5、1、3、7及14 d)、肝(3 d)和肾(7 d)显著高于加酶组(P<0.05),其余差异不显著(P>0.05)。此外无论在高、低剂量攻毒条件下,加酶组的死亡率均低于未加酶组,其中低剂量攻毒7 d及以后其死亡率显著低于对照(P<0.05)。结果表明,口服AI-96可以有效预防NJ-1≤0.7×108cfu/mL范围内的侵袭。

微生物群体感应调节信号分子N-酰化高丝氨酸内酯研究进展

近10年来,小分子介导的微生物群体感应调节受到广泛关注。介导微生物群体感应调节的信号分子包括AIP、AI-2、DKPs、DPD、N-酰化高丝氨酸内酯(AHL)等,其中AHL成为研究热点,研究表明其具有潜在的抗菌、抗肿瘤、免疫抑制和诱导细胞凋亡等作用。目前对AHL介导微生物群体感应调节机制研究较多,而对于此类化合物的合成及其构效关系研究还处于初步阶段。本文就AHL类似物的群体感应调节机制、构效关系、生物合成和化学合成方法加以综述。

大肠杆菌中高丝氨酸琥珀酰基转移酶的同源模建与对接研究

利用同源模建和分子动力学模拟方法,模建了大肠杆菌中高丝氨酸琥珀酰基转移酶的三维结构.分析了活性位点的组成,从结构上佐证了Cys142而不是Lys47为亲核进攻的残基,并通过与其天然底物琥珀酰-辅酶A的对接研究,从理论上确认了对复合物形成起到重要作用的氨基酸残基.

拟南芥高丝氨酸激酶HSK的分子结构与同源建模研究

高丝氨酸激酶(EC 2.7.1.39)是拟南芥中合成甲硫氨酸和苏氨酸的关键酶之一。作者利用DNAMAN软件分析高丝氨酸激酶的氨基酸组成和等电点;利用生物信息学在线网站预测分析其疏水性、二级结构、跨膜结构域、信号肽区域、PEST序列、化学修饰位点及亚细胞定位等;利用SWISS-MODEL软件进行同源建模,使用Chimera(V1.8.1)做结构修饰处理,最后利用Molprobity4及ERRAT(V2.0)对建模结果进行结构质量分析。结果发现:HSK预测等电点为8.48,平均亲水性0.267;二级结构中α-螺旋占34.32%,不规则卷曲占48.11%,延伸链占17.57%;高丝氨酸激酶的预测模型经验证具有稳定的空间结构,符合立体化学规则。

N-己酰高丝氨酸内酯对马铃薯生长及抗软腐病能力的影响

[目的]研究细菌个体间通讯信号N己-酰高丝氨酸内酯(C6-HSL)是否可以影响植物的生长和抗病能力。[方法]以马铃薯脱毒苗为试验材料,C6-HSL为诱导剂研究了经不同浓度C6-HSL处理后,马铃薯生长、抵抗胡萝卜软腐欧文氏菌浸染的情况,特别研究了C6-HSL对植株标志性防御酶活性和H2O2含量的影响。[结果]不同浓度的C6-HSL能明显抑制马铃薯的出根率和生根数,而对株高、茎节数及叶片大小没有影响;植物标志性防御酶类中POD和SOD的活性以及H2O2的产生量经C6-HSL诱导后显著提高,而PAL和PPO的活性则没有明显变化;抗病试验中,经C6-HSL诱导的马铃薯植株能有效抑制胡萝卜软腐欧文氏菌的侵染,发病率明显低于对照组。[结论]细菌AHL有可能成为一种新的植物抗病激活剂。