拟南芥高丝氨酸激酶HSK的分子结构与同源建模研究

高丝氨酸激酶(EC 2.7.1.39)是拟南芥中合成甲硫氨酸和苏氨酸的关键酶之一。作者利用DNAMAN软件分析高丝氨酸激酶的氨基酸组成和等电点;利用生物信息学在线网站预测分析其疏水性、二级结构、跨膜结构域、信号肽区域、PEST序列、化学修饰位点及亚细胞定位等;利用SWISS-MODEL软件进行同源建模,使用Chimera(V1.8.1)做结构修饰处理,最后利用Molprobity4及ERRAT(V2.0)对建模结果进行结构质量分析。结果发现:HSK预测等电点为8.48,平均亲水性0.267;二级结构中α-螺旋占34.32%,不规则卷曲占48.11%,延伸链占17.57%;高丝氨酸激酶的预测模型经验证具有稳定的空间结构,符合立体化学规则。

大豆高丝氨酸激酶GmHSK基因的克隆与全生育期的表达分析

高丝氨酸激酶(HSK)是天冬氨酸代谢途径中的重要酶,控制赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸和异亮氨酸的生物合成。本研究从大豆Williams 82中克隆了大豆HSK基因GmHSK,该基因ORF长1083 bp,编码360个氨基酸,其分子量为37.64 kD,等电点为5.02。GmHSK基因与拟南芥中的HSK基因具相似编码产物,均具GHMP激酶超家族保守的ATP结合结构域。系统进化分析将植物的HSK蛋白分为2类,GmHSK与苜蓿的同源基因的进化关系最近,且与双子叶植物拟南芥、蓖麻等的HSK聚为一类。qRT-PCR分析表明,GmHSK在大豆全生育期的8个组织和器官中均表达,但表达水平不同。推测GmHSK基因不仅是大豆营养生长所必需,也在物质积累过程中起重要调控作用。研究结果为转基因育种提高大豆蛋白的含量与品质提供了有益的候选基因。

结核分枝杆菌H37Rv高丝氨酸激酶基因的克隆、表达及酶学性质分析

采用PCR方法克隆到结核分枝杆菌H37Rv的高丝氨酸激酶基因thrB,将其连接到pET-28a(+)表达载体中,在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中经丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导得到高效表达.用Ni.NTA His.Bind亲和层析柱对表达的活性重组蛋白进行了分离纯化,并对其酶学性质进行了研究.结果表明:重组结核分枝杆菌高丝氨酸激酶能以L-高丝氨酸和ATP为底物催化L-高丝氨酸生成O-磷酰-L-高丝氨酸,该酶的比活力为2.946 U/mg,对底物L-高丝氨酸和ATP的米氏常数分别为2.303 1 mmol/L和2.342 9 mmol/L.

产O-乙酰高丝氨酸的大肠杆菌构建与发酵测试

O-乙酰高丝氨酸(OAH)是具有潜在工业应用价值的前体化合物,可用于制备高丝氨酸与蛋氨酸等。以一株改造自苏氨酸产生菌的Escherichia coli Thr L为出发菌株,过表达OAH合成途径中的关键酶高丝氨酸脱氢酶基因thr A和高丝氨酸乙酰基转移酶基因met X,并利用不同强度的启动子组合优化这两个基因的表达水平,通过发酵培养基中的苏氨酸和酵母粉的浓度优化以提升OAH的产生菌株的生产性能。通过启动子组合优化结果发现,当thr A与met X均采用J23110启动子时,该重组菌株E.coliOAH4的OAH合成能力最强,摇瓶发酵50 h后,其OAH产量为1.54 g/L。当苏氨酸的浓度为2 g/L,酵母粉的浓度为6 g/L时,E.coli OAH4的发酵水平最高,摇瓶发酵50 h后,OAH的产量可进一步提升至1.98 g/L。本研究首次在E.coli中实现了OAH的合成,并通过发酵优化确定了OAH的最优发酵条件,为后续OAH生产应用研究奠定了基础。