中国明对虾血浆蛋白质组学研究中高丰度蛋白的超速离心去除技术

应用超速离心技术对中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)血浆样品进行处理,比较去除和未去除高丰度蛋白血浆的双向凝胶电泳(2-DE)图谱。结果表明:对虾血浆高丰度蛋白经去除后,血浆样品中的低丰度蛋白得到较好的分离和浓缩。未处理样品的2-DE图谱分离的蛋白质170个,而去除高丰度蛋白后血浆2-DE图谱上分辨率增高,分离出蛋白质点520个,一些低丰度蛋白质被有效分离出来。研究证实,超速离心技术可有效去除对虾血浆高丰度蛋白(血蓝蛋白),提高低丰度蛋白的检出敏感性,为对虾等甲壳动物的血浆蛋白质组学研究提供了基础保障。

去除高丰度蛋白质后水牛卵泡液的双向电泳差异分析

以广西沼泽型水牛卵泡液为研究对象,用试剂盒免疫去除成熟及未成熟水牛卵泡液高丰度蛋白质后,采用已建立并优化的双向电泳体系对卵泡液蛋白质样品进行分离。软件分析发现,21个差异表达蛋白质与成熟卵泡液相比,10个蛋白质点表达上调,7个蛋白质点表达下调,3个蛋白质点缺失,1个蛋白质点在水牛未成熟卵泡液中特异性表达。经质谱分析,最终鉴定出3个蛋白质点:硫酸化糖蛋白、转铁蛋白和触珠蛋白。该研究成功分离并鉴定的水牛卵泡液差异蛋白质,为揭示水牛卵母细胞发育的微环境及其成熟机制提供试验依据。其中转铁蛋白对于水牛卵泡液的发育成熟具有十分重要的促进作用,而其它2个蛋白质对水牛卵泡液的成熟相关机制还尚未清楚,有待于进一步的试验研究。

免疫去除血清高丰度蛋白对组织蛋白质组鉴定的影响

目的分析去除组织中血清高丰度蛋白对组织蛋白质组鉴定的影响。方法用去除12种血清高丰度蛋白抗体柱处理人甲状腺和垂体组织样品,所得到的低丰度蛋白和原样分别进行液质联用分析,分别进行多肽和蛋白质水平的定性定量分析。结果甲状腺和垂体组织中血清高丰度蛋白分别被除去了92.11%±12.87%和78%±25%。所鉴定到的多肽和蛋白与原样品相比,甲状腺组织的非冗余性多肽提高了70%、蛋白数目提高了16.5%,垂体的非冗余性多肽提高了21.9%,鉴定蛋白数目无明显变化。结论去除组织中的血清高丰度蛋白法可以显著的提高肽段和蛋白的鉴定效率,更适用于血管密集的样品。

蛋白质分离和鉴定的新技术新方法研究进展

综述了国家重大科学研究计划"蛋白质分离和鉴定新技术新方法"课题的研究进展:高丰度蛋白质去除方面,采用强阳离子交换色谱(SCX)和反相色谱(RPLC),构建二维液相色谱分离系统;利用分子印迹技术制备高丰度蛋白质印迹聚合物.低丰度蛋白分离富集方面,采用新型功能材料磷酸化蛋白质/多肽、糖基化蛋白质/多肽、蛋白质/多肽实现对低丰度蛋白质的选择性富集.多维、多模式、阵列式的蛋白质高效分离方面,利用循环分离体积排阻色谱(csrSEC)和RPLC的联用构建多维分离系统;构建弱阴弱阳离子混合色谱-固定化酶反应器-RPLC-电喷雾质谱系统.高灵敏鉴定新技术新方法方面,发展液质联用接口技术,以中空纤维膜为根本,设计以此为核心的集成化样品预处理装置;新发展多肽衍生试剂,能够将肽段在质谱的检测灵敏度提高1—2个数量级;在靶体材料方面,采用复合核壳纳米功能靶体材料;在质谱数据处理方法方面,基于遗传算法发展筛选标准优化策略.这些新技术和新方法为蛋白质组研究提供了有效的方法.选择性吸附材料的研制为蛋白质组学研究中高丰度蛋白质去除和低丰度蛋白质富集提供了新的途径,进而避免了复杂体系对目标蛋白质鉴定的干扰.以多维、多模式、阵列式的蛋白质高效分离技术为核心构建的平台,实现了蛋白质组的高效、高通量、高可靠性分离;以液相色谱/质谱联用为核心的高灵敏鉴定的新技术新方法的发展,提高了低丰度蛋白质的质谱鉴定灵敏度和准确度.

双向电泳分离技术的比较和优化

目的:比较优化人血清蛋白双向电泳(2-DE)分离技术,提高2-DE对血清蛋白的分辨能力。方法:收集健康人群标本,分别进行多次双向电泳,比较高丰度蛋白的去除前后及传统的考马斯亮蓝染色和SYPRO-ruby荧光染色两种不同的染色方法等因素对双向电泳图谱质量的影响。结果:考马斯亮蓝染色和SYPRO-ruby荧光染色相比,血清2-DE图谱检测到平均蛋白质点数分别是(324±25)(n=3)和(785±30)(n=3);去除高丰度蛋白前后比较,未做处理的血清、去除蛋白和IgG血清的2-DE图谱检测到平均蛋白点数分别是(501±25)(n=3)和(813±22)(n=3)。结论:去除高丰度蛋白并结合SYPRO-ruby荧光染色可以大大提高血清低丰度蛋白的解析能力。此方法优化了血清蛋白质2-DE技术,为进一步开展疾病血清蛋白质组研究奠定了基础。

蛋白质组研究中低丰度蛋白质的富集与鉴定技术

随着分离技术、质谱设备与生物信息学的发展,对复杂蛋白质组的深度覆盖研究已不再是遥不可及,对8 000个基因产物的规模化鉴定已经趋于常规化。然而,更深一步的蛋白质组覆盖,就遇到了低丰度蛋白质分离、鉴定等更高的挑战。因此,针对低丰度蛋白质鉴定方法与相关分离分析技术的发展,本文综述了改善低丰度蛋白质鉴定效率的三种方法的最新进展,包括蛋白质的高分辨分离与质谱分析策略、低丰度蛋白质的选择性富集方法和高丰度蛋白质的消减策略等。针对生物体系蛋白质组成的深度鉴定研究,逐步用于探索生命体在不同条件下蛋白质组的表达与修饰的动态变化,并最终发现具备重要生理与病理功能的调控性蛋白质、寻找候选药物靶标。