注射用脑蛋白水解物对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞增殖与氧化损伤的影响

目的:探讨注射用脑蛋白水解物对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞的增殖与过氧化氢氧化损伤的影响。方法:采用MTT法,观察不同浓度的注射用脑蛋白水解物对体外培养的大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12)生长及过氧化氢损伤保护的作用。结果:注射用脑蛋白水解物对PC12细胞的增殖及氧化损伤的保护作用存在量效关系。结论:注射用脑蛋白水解物可促进PC12细胞生长,并可保护细胞减轻过氧化氢的损伤。

牵正散合大补阴丸对蛋白酶抑制因子Ⅰ诱导的帕金森病体外细胞模型大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞的增殖和凋亡的影响

目的观察牵正散合大补阴丸水煎剂对蛋白酶抑制因子I(proteasome inhibitor I,PSI)诱导的帕金森病体外细胞模型大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(pheochromocy-toma cells,PC12)增殖、凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法共设立9组,分别是模型组、模型加药组7组(PSI+Q0组,PSI+Q25组,PSI+D0组,PSI+D25组,P+D25+Q25组,P+D25+Q0组,P+Q25+D0组)以及空白对照组。流式细胞术检测牵正散合大补阴丸水煎剂对PC12细胞模型中细胞凋亡的影响;NBT核黄素比色法检测不同浓度药物处理PC12细胞模型后细胞上清液中总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)含量;蛋白免疫印迹法检测PC12细胞模型中泛素/蛋白酶体途径中相关因子TBP1-19、PA28α的表达水平。结果(1)与空白对照组相比,模型组与模型加药组细胞坏死、凋亡呈升高趋势;与模型组相比,P+Q25+D0组及P+Q0组、P+Q25组细胞坏死、凋亡趋势下降。(2)与空白对照组相比,模型组的SOD值降低(P<0.05);与模型组相比,各模型加药组SOD值升高(P<0.05)。(3)与空白对照组相比,模型组TBP1-19、PA28α蛋白的表达降低;与模型组相比,各模型加药组TBP1-19、PA28α蛋白的表达水平升高。结论牵正散、大补阴丸水煎剂及其合方均可改善PSI诱导的PC12细胞的细胞坏死及凋亡情况,可能是通过影响泛素/蛋白酶体途径中相关蛋白TBP1-19和PA28α的表达水平来改善PSI诱导的PC12细胞模型的凋亡和SOD活性,且不同浓度的合方对PSI诱导的PC12细胞模型保护程度不同。

基于IGF-1R/Akt/PGC-1α通路探讨芍药苷对H2O2诱导PC12细胞氧化损伤的保护作用

目的研究芍药苷(Paeoniflorin,PF)对过氧化氢(H2O2)诱导高分化大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12细胞)氧化损伤模型的保护作用及其机制。方法采用无血清H2O2体外诱导PC12细胞氧化损伤,并以不同浓度PF(100、200、300μmol·L-1)进行干预。采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率;倒置生物显微镜观察细胞形态;Annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡率;ELISA法检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量和总抗氧化能力(T-AOC);Western Blot法检测胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)、丝氨酸/苏氨酸激酶(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子-1α(PGC-1α)蛋白的表达水平。结果选择8μmol·L-1 H2O2作为模型复制浓度。与正常组比较,H2O2模型组细胞形态异常;细胞存活率明显降低、凋亡率显著升高(P<0.01);MDA含量增高(P<0.01),SOD活力及T-AOC降低(P<0.01);IGF-1R、Akt、pAkt及PGC-1α蛋白表达水平均明显下调(P<0.01)。与模型组比较,PF不同浓度组均能改善细胞形态,显著提高细胞存活率和降低细胞凋亡率(P<0.05,P<0.01);显著提高SOD酶活力和T-AOC(P<0.05,P<0.01),降低MDA含量(P<0.01,200、300μmol·L-1 PF组);明显上调IGF-1R、Akt及PGC-1α蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01),提高Akt蛋白的磷酸化(p-Akt)水平(P<0.05,P<0.01)。结论PF可能是通过提高IGF-1R的表达,激活Akt/PGC-1α信号转导通路,增强细胞抗氧化损伤能力,抑制细胞凋亡,从而发挥保护H2O2损伤的PC12细胞的作用。

Preso在PC12细胞氧化应激损伤中的作用

目的通过建立大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株(PC12)氧化应激损伤模型,研究一类新型结构蛋白脊椎形态发生突触后致密物质95(PSD-95)相关调节因子(Preso)在氧化应激损伤中的作用以及有可能的作用方式。方法建立PC12细胞氧化应激损伤模型,通过Western blot法检测损伤后Preso蛋白表达变化;通过干涉Preso蛋白表达,四甲基啖唑蓝(MTT)检测细胞存活率及乳酸脱氢酶(LDH)检测细胞损伤程度评价Preso在氧化应激损伤中的作用;使用地佐环平(MK-801)阻断离子型谷氨酸受体(NMDAR)激活,然后通过MTT法检测细胞存活率及LDH法检测细胞损伤程度,分析Preso在氧化应激损伤中可能起作用的途径。结果氧化应激损伤能够使Preso蛋白表达增高,而干涉Preso蛋白表达能够有效提高氧化应激损伤后细胞存活率,而抑制NMDAR激活会削弱干涉Preso蛋白表达的细胞保护作用。结论 Preso对于氧化应激损伤起到了促进的作用,干涉Preso表达可减轻细胞氧化应激损伤;Preso蛋白很可能通过结合突触后致密物质95进而促进NMDA受体激活,起到加重细胞氧化应激损伤作用。

姜黄素及其代谢修饰产物对PC12细胞氧化损伤的保护作用

为比较姜黄素及其两种主要代谢修饰产物(四氢姜黄素和姜黄素-β-D-葡糖苷酸)对H2O2诱导的大鼠肾上腺嗜铬瘤PC12细胞氧化损伤的保护作用,细胞经上述受试物处理后,采用噻唑蓝法测定细胞存活率,2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐荧光探针测定活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)含量,试剂盒检测细胞内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,Western Blot测定细胞内抗氧化相关蛋白的表达。结果表明:姜黄素及其代谢产物能够显著降低氧化损伤的PC12细胞内ROS含量和MDA水平,显著提高SOD活力(P<0.05),上调肾脏细胞质和细胞核中Nrf2蛋白表达量,激活下游血红素氧合酶-1和腺嘌呤二核苷酸醌氧化还原酶蛋白表达。总体来看,姜黄素代谢修饰后的产物抗氧化损伤作用弱于姜黄素。实验结果为揭示姜黄素的健康功效机制提供了实验依据。

益母草碱对缺糖/缺氧损伤PC12细胞的保护作用

目的研究盐酸益母草碱对缺糖/缺氧损伤大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞株(PC12)的保护作用。方法采用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)+缺糖建立PC12细胞缺糖/缺氧损伤模型(oxygen and glucose deprivation,OGD),MTT法检测各组细胞存活率,流式细胞仪检测各组细胞内活性氧含量。结果与模型组相比,25μmol·L-1盐酸益母草碱显著提高细胞存活率,降低细胞内的活性氧含量。结论盐酸益母草碱对PC12细胞缺糖/缺氧损伤模型有明显的保护作用。

转铁蛋白介导人参皂苷Re脂质体的构建及其对Aβ_(25-35)处理PC12细胞损伤的影响

目的探讨转铁蛋白(Tf)介导人参皂苷Re脂质体(Tf-LC-Re)的构建及其对Aβ_(25-35)处理PC12细胞损伤的影响。方法采用EDC/NHS水相缩合法构建Tf-LC-Re、人参皂苷Re脂质体(LC-Re)和FITC标记的Tf-LC-Re(FITC-Tf-LC-Re)。取对数生长期PC12细胞随机分为空白对照组,Aβ_(25-35)模型组,人参皂苷Re+Aβ_(25-35)组、LC-Re+Aβ_(25-35)组、Tf-LC-Re+Aβ_(25-35)组(人参皂苷Re终浓度为0.1、1、10、100μmol/L或5、10、20μmol/L),分别采用MTT法和流式细胞仪检测各组细胞存活率及凋亡率。取对数生长期PC12细胞,分别加入含终浓度为5、10、20μmol/L人参皂苷Re的FITC+Re、FITC-LC-Re、FITC-Tf-LC-Re、FITC-Tf-LC-Re+Tf(20μg/m L),孵育30 min后加入20μmol/L Aβ_(25-35),继续培养24 h,通过胞内药物定量法评价PC12细胞对人参皂苷Re、LC-Re及Tf-LC-Re的摄取行为(荧光强度)。结果含终浓度为0.1、1、10、100μmol/L人参皂苷Re的人参皂苷Re+Aβ_(25-35)组、LC-Re+Aβ_(25-35)组、Tf-LC-Re+Aβ_(25-35)组细胞存活率均高于Aβ_(25-35)模型组(P<0.05或<0.01),且含相同终浓度人参皂苷Re的Tf-LCRe+Aβ_(25-35)组均高于人参皂苷Re+Aβ_(25-35)组和LC-Re+Aβ_(25-35)组(P均<0.01)。Aβ_(25-35)模型组细胞凋亡率高于空白对照组(P<0.01),含相同终浓度人参皂苷Re的Tf-LC-Re+Aβ_(25-35)组细胞凋亡率均低于人参皂苷Re+Aβ_(25-35)组及LC-Re+Aβ_(25-35)组(P均<0.01)。含相同终浓度人参皂苷Re的FITC-Tf-LC-Re组荧光强度均高于FITC-LC-Re组及FITC-Tf-LC-Re+Tf组(P<0.05或<0.01)。结论成功构建Tf-LC-Re;人参皂苷Re、LC-Re、Tf-LC-Re均可抑制Aβ_(25-35)对PC12细胞的损伤,且Tf-LC-Re效果最好。

聚核糖性死亡在低氧复合丙泊酚致PC12细胞损伤中的作用

目的探讨聚核糖性死亡在低氧环境下丙泊酚致PC12细胞损伤中的作用。方法采用经神经生长因子(nerve growth factor,NGF)诱导分化后的PC12细胞模型,用随机数字表法将细胞分为对照(NC)组(正常培养)、脂肪乳空气对照(CA)组、脂肪乳低氧对照(CH)组、丙泊酚空气(PA)组、丙泊酚低氧(PH)组、3-AB(PARP-1抑制剂)组。采用乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒检测上清液中LDH的水平;流式细胞技术检测细胞凋亡;RT-qPCR法检测多聚ADP核糖聚合酶1(poly ADP-ribose polymerase 1,PARP-1)、细胞凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF)蛋白的mRNA表达水平;Western blot检测PARP-1、多聚ADP核糖(polymerized ADP-ribose,PAR)及AIF蛋白表达水平;细胞免疫荧光技术检测AIF核质分布。结果与NC、CA组比较,PA、PH组LDH水平及细胞凋亡增多(P<0.01),PARP-1和AIF的mRNA和蛋白表达均升高(P<0.05),胞质PAR聚合物形成增多(P<0.01),AIF核迁移显著增加(P<0.01);与CH、PA组比较,PH组LDH水平及细胞凋亡增多(P<0.01),PARP-1 mRNA和蛋白表达均升高(P<0.01),胞质PAR聚合物形成增多(P<0.01),AIF核迁移增加(P<0.01);使用PARP-1抑制剂3-AB预处理可降低低氧复合丙泊酚引起的LDH水平及细胞凋亡增加(P<0.01),同时抑制PARP-1、AIF和PAR蛋白表达上调(P<0.01)。结论低氧环境下丙泊酚可导致PC12细胞发生聚核糖性死亡,抑制聚核糖性死亡可缓解低氧复合丙泊酚对PC12细胞的损伤。

α-硫辛酸对缺血再灌注诱导的PC12细胞应激性凋亡抑制作用的研究

目的:探讨α-硫辛酸(α-LA)抑制缺血再灌注诱导的大鼠肾上腺嗜铬神经瘤细胞(PC12)内质网应激性凋亡的分子机制。方法:传代培养PC12细胞分为正常组(Control组)、氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)4 h组(OGD4组)、OGD 4 h后复氧不同时间段组(OGD4+R6、OGD4+R12、OGD4+R18以及OGD4+R24组)、在OGD4 h后复氧阶段给予不同浓度(0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、5和10 mmol/L)α-LA共同复氧培养24 h作为α-LA处理组(OGD/R+α-LA组);Control组细胞在完全培养基、正常氧培养箱中培养,OGD/R组和OGD/R+α-LA组细胞按相应方法进行培养处理;蛋白免疫印迹法检测各组PC12细胞中内质网应激[葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(CHOP)]和凋亡[B淋巴细胞瘤-2相关X(Bax)、裂解型胱天蛋白水解酶3(Cleaved-caspase3)]相关分子的表达;细胞活性检测试剂盒-8(CCK-8试剂盒)检测各组PC12细胞的存活率,分析α-LA作用的有效工作浓度。结果:与Control组比较,OGD4 h后复氧不同时间段均诱导了PC12细胞发生内质网应激性的凋亡,表现为内质网应激相关分子GRP78、CHOP和凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase3的表达伴随复氧时间段的延长而逐渐升高(P<0.05),在OGD4+R24组升高最明显(P<0.05);与Control组比较,OGD4+R24组细胞的存活率明显下降(P<0.05);与OGD4+R24组比较,OGD/R+α-LA组α-LA在0.05~5 mmol/L浓度范围内增加了细胞的存活率(P<0.05),0.5 mmol/L时细胞存活率升高最明显(P<0.05),10 mmol/L时细胞存活率明显降低(P<0.05);与OGD4+R24组比较,OGD/R+α-LA(0.5 mmol/L)组凋亡分子Bax、Cleaved-caspase3以及内质网应激相关分子GRP78、CHOP表达明显降低(P<0.05)。结论:缺血再灌注诱导了PC12细胞发生内质网应激性的凋亡,α-LA能够降低缺血再灌注诱导的PC12损伤,其机制可能与降低了缺血再灌注诱导的内质网应激性凋亡有关。

黄芩素对过氧化氢致PC12细胞损伤的保护作用研究

目的:研究黄芩素(BAI)对过氧化氢(H2O2)损伤的神经细胞的保护作用。方法:用体外细胞培养法,预先孵育24h,以500μmol·L-1H2O2复制大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株(PC12)不可逆氧化损伤模型,观察BAI对其影响,并在损伤时分为移除药物和不移除药物2种情况进行分析;通过MTT微量比色法测定细胞活度,并测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的含量。结果:预先给予BAI作用24h后,在造模时不论是否移除药物,BAI对损伤细胞均有显著的保护作用,尤以不移除药物的效果更为显著。镜下观察,BAI组细胞形态出现一定程度上的边缘模糊,单个细胞体积变大,有少许细胞融合的状态发生;MTT法测定细胞活度升高,培养液中LDH含量降低,与模型组比较差异显著。结论:BAI能显著减轻PC12细胞损伤,其作用机制可能在氧化-抗氧化环节,与BAI能够减轻呼吸链阻断造成的自由基堆积、抗氧化和清除自由基的能力有关。