高分辨率溶解曲线分析技术在大豆Ecotilling中的应用

将高分辨率溶解曲线(High Resolution Melting,HRM)技术运用在大豆Ecotilling中,对256份栽培大豆的大豆异黄酮合酶基因(IFS1)的外显子区域进行SNP筛查,并采用直接测序的方法对HRM检测结果进行验证。结果表明:模板均一化后的检测效果较未均一化的检测效果差异显著,野生型样本与待测样本按1∶1及1∶4比例混样溶解曲线阈值较高,其中1∶4混样适合高通量检测。HRM对IFS1基因外显子区域的检测结果与PCR产物测序的结果比对显示,对IFS1第5段外显子和第7段外显子检测的准确率分别达到91.2%和100%,表明该研究利用HRM技术建立的栽培大豆的Ecotilling技术体系是一种高灵敏度、高通量和低成本检测SNP的新方法。

实时荧光多重聚合酶链反应-高分辨率溶解曲线分析鉴别6种致腹泻性大肠埃希菌的研究

目的建立一种鉴别6种致腹泻性大肠埃希菌的实时荧光多重聚合酶链反应-高分辨率溶解曲线分析方法。方法根据6种致腹泻大肠埃希菌的8种特异性毒力基因设计8对引物,采用实时荧光多重聚合酶链反应后溶解曲线分析,根据曲线的峰值、高度、宽度、面积不同鉴别不同的致病菌。结果成功设计出8对引物,扩增出针对6种致腹泻大肠埃希菌的8种不同毒力基因,获得了特异性的溶解曲线。优化反应体系后在同一反应管中成功获得针对8种特异基因的溶解曲线,除肠侵袭性大肠杆菌、细胞致死膨胀性大肠杆菌具有相同的两种基因不能鉴别外,其中5种致腹泻性大肠埃希菌均可以明确鉴别。结论多重聚合酶链反应-高分辨率溶解曲线分析鉴别致腹泻性大肠埃希菌是一种简单、特异、高效的方法,在腹泻病与食源性疾病的暴发调查和日常监测中具有广泛的应用价值。

高分辨率溶解曲线分析miRNA-196a2基因多态性与肺癌相关性

目的探讨microRNA-196a2基因多态性（rs1614913）与中国人群肺癌发病相关性。方法应用高分辨率溶解曲线（high resolution melting,HRM）分析技术对32例肺癌患者、27例肺部良性肿瘤患者及84例健康个体的microRNA-196a2基因多态性进行分析,并采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-restriction fragment length polymorphism,PCRRFLP）技术加以佐证。结果 micro-196a2在各组基因型分布均达到Hardy-Weinberg平衡。肺癌组C等位基因的分布频率高于对照组（P=0.0016）,OR=2.592（95%CI1.424～4.716）,说明C等位基因增加肺癌患病风险。结论 MicroRNA-196a2T/C（rs1614913）多态性增加肺癌的发病风险。MicroRNA-196a2基因多态性rs1614913可能是肺癌的一种有效的遗传标记物。

高分辨率熔解曲线技术用于结核分枝杆菌临床分离株异烟肼耐药性的快速检测

目的评价高分辨率熔解曲线分析技术(high-resolution melting curve,HRM)检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的应用价值。方法 1)通过传统比例法药敏实验对本实验室保存的49株结核分枝杆菌进行异烟肼耐药性分析。2)进一步对该结核分枝杆菌进行异烟肼耐药相关基因KatG基因和inhA基因进行异烟肼耐药决定区测序分析,筛查突变位点。3)根据筛查到的突变位点设计高分辨率熔解曲线分析所用的特异性引物,对异烟肼耐药基因耐药决定区进行高分辨率熔解曲线分析检测DNA突变,评估用高分辨率熔解曲线分析技术对结核分枝杆菌异烟肼耐药性检测的效率。结果 1)比例法药敏结果显示,49株实验菌株中20株为异烟肼耐药株,29株为异烟肼敏感株。2)测序分析结果显示:(1)KatG基因出现了4种突变形式,分别是234单位点突变;234、315双位点突变;234、463双位点突变;234、315、463三位点联合突变。(2)inhA基因检测到3种突变,即-8位、-15位、-152位。3)(1)对耐药株的基因突变进行分析发现:20株异烟肼耐药株中11株存在KatG基因第315位密码子的突变、占异烟肼耐药株的55%;6株存在inhA基因-15(4株)位碱基、-8(1株)位碱基、-152(1株)位碱基的突变,共占异烟肼耐药株的30%;2株同时存在基因KatG315密码子和inhA-15位碱基的突变,占异烟肼耐药株的10%;1株均未检测到KatG基因和inhA基因的突变,占异烟肼耐药株的5%。通过基因突变检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的敏感性为95%、特异性为100%。(2)用高分辨率溶解曲线检测实验菌株耐药基因突变的结果显示,18株存在基因突变,24株不存在基因突变,检测的灵敏度为94.7%、特异性为80%。(3)以高分辨率熔解曲线检测到突变为耐药的判断标准,检出19株为耐药株,24株为敏感株。以比例法药敏结果为参照,检测的灵敏度为95%、特异性为82.76%。结论高分辨率溶解曲线用于结核分枝杆菌对异烟肼耐药性的检测具有较好的灵敏度,耗时短,在异烟肼耐药结核病的快速诊断方面具有一定的应用价值。

MN血型的高分辨率熔解曲线基因分型——附1例罕见Mc血型的鉴定

目的建立MN血型高分辨率熔解曲线（HRM）基因分型方法,进行MN血型基因分型,并探讨罕见Mc血型的鉴定方法。方法收集2013年1月—6月澳大利亚红十字血液服务中心献血者全血标本150例,提取基因组DNA,并利用HRM基因分型方法对MN血型进行基因分型;对HRM分型结果中出现的变异曲线标本,采用直接测序法对GYPA基因外显子2进行测序分析,确证其基因型;同时,利用单克隆抗-M及抗-N通过血清学方法检测待检标本的表型。结果150例标本中有149例标本的HRM基因分型结果与表型一致;只有1例标本的熔解曲线形态与3个对照标本均不同,提示在扩增片段存在变异位点,血清学结果显示该标本表型为M＋N-;但是,该标本的GYPA基因外显子2测序结果显示其在M抗原的1个特异性SNP位点中存在杂合突变：c.7172GT〉AG,p.Gly5Glu,根据该结果判断其基因型为MMc。结论HRM基因分型方法能对MN抗原进行准确分型。Mc是介于M与N抗原之间的1种抗原,能与大多数抗-M及少数抗-N反应,因此,仅利用1种抗-M和抗-N试剂容易导致Mc抗原的漏检,基因分型方法更容易发现Mc血型。

高分辨率熔解曲线技术在胃及结直肠癌甲基化中的应用

DNA甲基化是表观遗传学中的研究热点,与胃及结直肠癌的发生发展,诊断治疗及预后密切相关。高分辨率溶解曲线技术(HRM)是基于实时荧光PCR基础上发展起来的一种新的实时定量技术,近年来在DNA甲基化检测中发展迅速。此文就HRM的技术在胃肠癌甲基化中的应用作一综述。

利用高分辨率熔解曲线(HRM)分析梨微卫星标记

以西洋梨(Pyrus communisL.)‘NainVert’的一个矮生型实生系与‘茌梨’(Pyrus bretschneideri Rehd.)的F1杂交群体为试材,对分别源自梨和苹果基因组的4个微卫星(即SSRs)序列多态性进行了高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)分析。结果显示,在测试群体中,TsuENH042和Hi15a13存在两种分型,TsuENH081存在3种分型,而Hi08d09只有1种类型。因此,HRM分析技术可以作为筛查果树微卫星标记多态性或对其进行基因分型的有效手段在相关研究中加以应用。

高分辨率熔解曲线HRM在SNP检测中的应用

自然界生物具有丰富多样性,其本质在于DNA序列的多样性,单核苷酸多态性(SNP)是DNA序列多样性的基本单位,亦为生物进化和选择的动力源。越来越多的研究表明,SNP与人类的疾病、动植物的生长性状显著相关,对SNP的检测亦逐渐成为疾病检测和生物分子育种的重要手段。与传统的SNP检测技术相比较,高分辨率熔解曲线(HRM)具有高通量、高灵敏度、高特异性、快速、操作简单和重复性好的特点,能够快捷、有效筛查生物群体中的SNP位点,将逐渐成为SNP检测的主流技术。本文对HRM原理、方法、特点和应用进行综述,以飨读者。

高分辨率溶解曲线检测9种食源性致病菌方法的建立

当今食源性疾病已成为一个全球关注的食品卫生问题,常见的细菌性食物中毒的病原菌有:致病性大肠杆菌(特别是出血性大肠杆菌O157:H7)、沙门氏菌、志贺氏菌、致病性弧菌(包括霍乱弧菌和副溶血弧菌)、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、空肠弯曲菌以及阪崎克罗诺杆菌等。单独检测一种致病菌已无法满足现今社会对同时高效检测多种致病菌的要求,为建立一种同时对上述9种食品中常见致病菌的检测方法,本研究分别以上述9种菌的特异性基因为靶基因,创新性地结合一对通用引物,建立能同时检测多种食源性致病菌的多重HRM-real time PCR检测体系。结果表明该多重HRM-real time PCR检测体系通过两管PCR反应可对上述9种食品中常见致病菌进行有效的检测与区分,且具有良好的特异性和灵敏度。

高分辨率溶解曲线分析与基因测序检测粪便DNA对大肠癌筛查作用的比较

目的用基因测序评价高分辨率溶解曲线分析(high-resolution melting,HRM)检测粪便DNA的可靠性。方法收集2009年3月～2009年9月在惠州市中心人民医院住院的39例大肠癌患者的新鲜粪便标本约1 g,应用HRM法和基因测序法检测粪便中apc、k-ras、p53基因的突变情况,并对结果进行统计学分析。结果应用HRM在39例大肠癌患者粪便中检出apc基因突变22例,检出率为56.41%(22/39),经测序HRM阳性的22例标本均发现有基因突变,HRM阴性的标本未发现有基因突变者;检出k-ras基因突变14例,检出率为35.90%(14/39),经测序HRM阳性的14例标本均发现有基因突变,HRM阴性的标本末发现有基因突变者;检出p53基因突变24例,检出率为61.54%(24/39),经测序HRM阳性的24例标本均发现有基因突变,HRM阴性的标本未发现有基因突变者。结论 HRM法与基因测序的一致率较高,提示HRM法检测粪便DNA突变筛查大肠癌具有潜在的临床应用价值。

扩增子测序结合高分辨率溶解曲线鉴定花生单核苷酸多态

异源四倍体花生(Arachis hypogaea L.)包含两套基因组,分别来自二倍体祖先A.duranensis(A基因组)和A.ipaensis(B基因组)。相对于二倍体,异源四倍体SNP的鉴定和分析面临更多挑战,因为在SNP的鉴定和分析过程中,通常需要同时分析两套基因组中相同位点的DNA序列。本研究以12个花生品种和2个二倍体祖先为材料,通过扩增子重测序EST和GSS(各100条序列)开发SNP。结果显示共检测出18个EST-SNPs和44个genomic-SNPs,出现频率分别为1 SNP/2 557 bp和1 SNP/1 011 bp。为了进一步评估和应用所开发的SNP,采用高分辨率溶解曲线方法对96个花生品种进行SNP基因分型。EST-SNP在供试品种中的多态性信息量介于0.021~0.413,平均为0.172。Genomic-SNP的多态性信息量介于0.08~0.478,平均为0.249。本研究表明采用扩增子测序和HRM方法能够从异源四倍体花生中准确鉴定SNP,且所开发的SNP信息量丰富,能够用于花生遗传育种研究。

聚合酶链反应-高分辨率溶解曲线技术在常见沙门菌分型中的应用研究

目的建立沙门菌的聚合酶链反应-高分辨率溶解曲线(PCR-HRM)分型方法,结合DNA测序方法,比较PCR-HRM分型方法和血清学分型方法的一致性,评价该方法的临床应用价值。方法对全部32株沙门菌,先用传统的血清学分型技术进行分型,然后选择flj B、gyr B和ycf Q 3个基因为目的基因,用PCR-HRM技术对其进行分型,最后通过扩增上述3个目的基因并测序作为分型的金标准,比较血清学分型技术和PCR-HRM技术分型的一致率和正确率,分析两种方法不一致的可能原因。结果对32株所测沙门菌,血清学分型技术分出6个血清型,PCR-HRM分型技术分出5个曲线型,血清学分型技术和PCR-HRM分型技术的一致率为84.4%;以测序结果作为金标准,血清学分型技术的正确分型率为84.4%,PCR-HRM技术的正确分型率为96.9%,两种方法比较差异尚无统计学意义(P=0.156),但在本研究中PCR-HRM技术具有更高的分型正确率。结论 PCR-HRM分型方法具有简单、快速、灵敏度高和正确率高的优点,与传统的血清学分型方法具有良好的一致性,在建立标准操作规程之后,PCR-HRM技术在沙门菌分型中具有良好的应用价值。

高分辨率熔解曲线检测结核分枝杆菌对利福平耐药性研究

目的评价高分辨率熔解曲线(high resolution melt,HRM)技术检测结核分枝杆菌对利福平耐药性的临床应用价值。方法用传统结核分枝杆菌药敏试验对新疆石河子大学人畜共患病实验室保存的50株临床分离菌进行耐药性检测。以rpoB基因的利福平耐药决定区为靶标设计引物进行高分辨率熔解曲线分析,判断分离出的结核分枝杆菌是否对利福平耐药。应用SPSS 17.0分析,以传统结核分枝杆菌药敏试验结果为标准,计算两种方法的符合率。用χ~2检测分析比例法药敏结果与高分辨率熔解曲线检测结果的差异性。用Kappa检测分析两种结果的一致性。结果药敏试验结果显示,50株菌中有1株为非结核分枝杆菌;49株中有20株同时对利福平和异烟肼耐药、1株仅对利福平耐药;HRM检测结果显示,21株对利福平耐药,28株为敏感株。以传统药敏试验为参考,HRM检测利福平耐药性的敏感性为86.36%,特异性为92.59%,经Kappa检验显示,两种方法检测结果具有高度一致性。结论 HRM可快速检测结核分枝杆菌对利福平的耐药性,具有较高灵敏度,在耐药结核病的早期诊断上有一定的应用价值。

基于DNA条形码和高分辨率熔解曲线技术快速鉴别肉苁蓉

目的:基于DNA条形码技术建立肉苁蓉样品的高分辨率熔解曲线(HRM)鉴定方法。方法:通过聚合酶链式反应(PCR)对肉苁蓉的ITS和ITS2序列进行扩增;利用MEGA 6.06软件通过建树法进行NJ树聚类分析;通过ITS2序列利用Primer Premier 5软件进行引物设计;对经设计、合成的8对引物通过HRM实验进行筛选;建立肉苁蓉的HRM鉴定方法。结果:通过ITS和ITS2序列的NJ树聚类分析可以有效区分3种肉苁蓉(肉苁蓉、管花肉苁蓉及采自乌兹别克斯坦的肉苁蓉相近种),且肉苁蓉和管花肉苁蓉各自的栽培品与野生品不存在明显差异;经过Primer Premier 5软件进行引物设计共选出8对引物进行合成;通过HRM预实验筛选出引物Ysr-2为最佳实验引物;确立了有效鉴定3种肉苁蓉样品的HRM方法。结论:通过DNA条形码和HRM技术均能有效鉴定3种肉苁蓉样品,且结果一致,起到互相验证的作用,为肉苁蓉及其他中药民族药品种的快速鉴定提供了可以参考的依据。

绵羊FecB基因高通量HRM检测方法的建立及准确性评价

为了建立绵羊FecB基因高通量检测HRM方法并对其准确性进行检验,实验首先采用基因组PCR产物直接测序法,分别筛选出BB、B+和++基因型基因组各2份,参照HRM原理分别设计检验引物H1和H2并进行系统检验分析。分析结果发现,使用H1引物扩增效率及特异性良好,但不能分辨BB基因型,而使用H2引物扩增效率及特异性良好,且能够有效识别3种基因型。扩大检验群体发现,使用H2引物的HRM技术重复性良好。以基因组PCR产物直接测序结果为参考标准,检验HRM方法的准确性发现BB基因型检验敏感度为75%,B+和++基因型敏感性分别为96.2%和100%,总体准确率为96.9%,证实该方法能够满足育种实践对检测技术准确性的要求。绵羊FecB基因HRM检验方法的建立为高繁殖性状肉羊育种提供了新的技术工具。

羊乳中牛乳成分的环介导等温扩增高分辨熔解检测

为了提高检测效率,节省时间、试剂和样本,建立了基于高分辨率熔解曲线(high-resolution melting,HRM)的双重环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术用于羊乳中牛乳成分的检测。通过引物设计优化,牛引物目标产物的T m值在80℃,羊引物目标产物的T m值在83℃,由于在传统熔解曲线中峰型有交叉重叠,同时检测存在干扰,因此使用HRM技术,实现了2种不同动物源性成分的有效区分。该方法特异性好,不需要针对牛、羊源性成分单独进行检测,当体系中存在其中一种或两种都存在时都可将其快速检出,且对其他物种没有交叉反应及假阳性现象的发生,成功应用于市售羊乳及其制品的检测。

基于PCR-HRM的水稻氮高效基因NRT1.1B功能标记开发及应用

水稻对氮肥的高效与合理利用是发展绿色农业的重要保障。培育含有氮高效基因的水稻品种,是提高氮肥利用率最经济有效的途径。本研究开发了一个用于HRM(高分辨率熔解曲线)高通量检测硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的分子功能标记。利用此标记对78份山东地方水稻品种进行NRT1.1B基因分型,发现有13个水稻品种为含有NRT1.1B的高效单倍型,表明NRT1.1B在山东省水稻品种中分布较少。利用测序分析验证,测序结果与本标记分型结果一致。可见,本研究开发的功能标记能够快速准确鉴定出NRT1.1B基因型,可为筛选和培育氮高效水稻新品种提供有力的技术支撑。

应用高分辨溶解曲线(HRM)技术分析猪微卫星多态性

为了验证利用高分辨熔解曲线（high-resolution melting curve analysis,HRM）技术对猪微卫星标记进行基因分型的可行性和可靠性,使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）方法对5个微卫星（SSRs）位点多态性进行检测,再使用HRM技术对这5个微卫星（SSRs）位点进行基因分型测定,最后对1个微卫星的所有基因型进行单克隆测序。结果表明：在样本测试中,使用HRM技术分辨出S0107和SW1953位点均有8种基因型,SW72位点有6种基因型,SW29位点有5种基因型,SW2155位点有4种基因型,其结果与利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法检测的结果完全吻合,并且SW72位点的所有基因型克隆测序结果与HRM检测一致。这些结果提示,HRM分析技术可作为筛选猪微卫星标记多态性和对其进行基因分型的有效手段。

胶质瘤MGMT启动子甲基化定量检测的MS-HRM方法建立及评估

目的建立甲基化特异高分辨率溶解曲线(Methylation sensitive high resolution melting curve,MS-HRM)定量检测胶质瘤MGMT基因启动子甲基化的方法,用于指导胶质瘤患者术后化疗及预后判断。方法从标本库随机选取胶质瘤组织37例,提取DNA进行甲基化修饰,应用MS-HRM方法和甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)进行MGMT基因启动子区甲基化检测。结果 MSP方法检测显示部分甲基化标本29例(78.4%),较甲基化(13.5%)和未甲基化(8.1%)差异显著。MS-HRM发现MGMT基因启动子甲基化水平在10%~25%和25%~50%的标本分别有14例(37.8%)和17例(49.5%)。结论成功建立MS-HRM检测胶质瘤MGMT启动子甲基化的方法,该方法特异性高、灵敏度强和可重复性,有望应用于临床胶质瘤MGMT启动子甲基化高通量定量检测,以指导个体化治疗。

基于HRM方法筛选乳腺癌组织MYBL2基因突变热点区域

MYB家族成员--MYBL2基因,是一个重要的原癌基因,可通过多种途径抑制细胞凋亡并参与细胞周期调控,但其在乳腺癌发生和发展中的作用尚不明确.本试验通过采用高分辨率熔解曲线法(HRM),结合DNA测序分析检测MYBL2基因第5、8、13和14外显子在乳腺癌组织中的突变情况.结果显示有12例(约占32%)乳腺癌组织在MYBL2基因第8号外显子第1472位存在A→G的突变,导致编码氨基酸序列发生S→G的突变;而外显子5、13和14未检测到突变.结果提示MYBL2基因的8号外显子的突变可能与乳腺癌的形成和发展有密切联系.