基于高分辨率熔解曲线分析技术探讨TNF-α基因多态性与银屑病的相关性

目的:运用高分辨率熔解曲线(HRM)分析技术分析TNF-α基因rs3093662位点的多态性与银屑病的相关性。方法:应用荧光定量PCR-HRM分析技术对我院收治的426例银屑病患者(研究组)和485例健康人(对照组)的TNF-α基因位点rs3093662的基因型及等位基因进行测定。结果:rs3093662的AG、AA、GG基因型频率在银屑病研究组和对照组分别是7.98%、92.02%、0.00%和4.54%、95.46%、0.00%,A、G等位基因频率在银屑病研究组和对照组分别是96.01%、3.99%和97.73%、2.27%,组间差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:TNF-αrs3093662的基因多态性可能与银屑病的发病相关,HRM分析技术检测基因多态性具有操作简单,敏感性高,成本低,适合在临床检测中推广应用。

高分辨率溶解曲线分析技术在大豆Ecotilling中的应用

将高分辨率溶解曲线(High Resolution Melting,HRM)技术运用在大豆Ecotilling中,对256份栽培大豆的大豆异黄酮合酶基因(IFS1)的外显子区域进行SNP筛查,并采用直接测序的方法对HRM检测结果进行验证。结果表明:模板均一化后的检测效果较未均一化的检测效果差异显著,野生型样本与待测样本按1∶1及1∶4比例混样溶解曲线阈值较高,其中1∶4混样适合高通量检测。HRM对IFS1基因外显子区域的检测结果与PCR产物测序的结果比对显示,对IFS1第5段外显子和第7段外显子检测的准确率分别达到91.2%和100%,表明该研究利用HRM技术建立的栽培大豆的Ecotilling技术体系是一种高灵敏度、高通量和低成本检测SNP的新方法。

高分辨率熔解曲线技术在胃及结直肠癌甲基化中的应用

DNA甲基化是表观遗传学中的研究热点,与胃及结直肠癌的发生发展,诊断治疗及预后密切相关。高分辨率溶解曲线技术(HRM)是基于实时荧光PCR基础上发展起来的一种新的实时定量技术,近年来在DNA甲基化检测中发展迅速。此文就HRM的技术在胃肠癌甲基化中的应用作一综述。

聚合酶链反应-高分辨率溶解曲线技术在常见沙门菌分型中的应用研究

目的建立沙门菌的聚合酶链反应-高分辨率溶解曲线(PCR-HRM)分型方法,结合DNA测序方法,比较PCR-HRM分型方法和血清学分型方法的一致性,评价该方法的临床应用价值。方法对全部32株沙门菌,先用传统的血清学分型技术进行分型,然后选择flj B、gyr B和ycf Q 3个基因为目的基因,用PCR-HRM技术对其进行分型,最后通过扩增上述3个目的基因并测序作为分型的金标准,比较血清学分型技术和PCR-HRM技术分型的一致率和正确率,分析两种方法不一致的可能原因。结果对32株所测沙门菌,血清学分型技术分出6个血清型,PCR-HRM分型技术分出5个曲线型,血清学分型技术和PCR-HRM分型技术的一致率为84.4%;以测序结果作为金标准,血清学分型技术的正确分型率为84.4%,PCR-HRM技术的正确分型率为96.9%,两种方法比较差异尚无统计学意义(P=0.156),但在本研究中PCR-HRM技术具有更高的分型正确率。结论 PCR-HRM分型方法具有简单、快速、灵敏度高和正确率高的优点,与传统的血清学分型方法具有良好的一致性,在建立标准操作规程之后,PCR-HRM技术在沙门菌分型中具有良好的应用价值。

高分辨率融解曲线技术检测冠心病患者IL-1β和IL-1Ra基因多态性

目的为探讨白细胞介素1β（IL-1β）和白细胞介素1受体拮抗剂（IL-IRa）基因单核苷酸多态性（SNP）与冠心病（CHD）易感及其血清学指标的相关性，应用高分辨率融解曲线分析（HRM）技术建立IL-1β和IL-1Ra基因SNP的分子诊断方法。方法建立IL-1B-511C〉T、IL-1β-31C〉T、IL-1β＋3954C〉T和IL-1RNT〉C这4个SNP位点的PCR-HRM检测方法，对260例CHD患者和274例健康对照进行比较研究，分析其与CHD易感及血清学指标的关系。结果上述4个SNP位点未发现与CHD易感有统计学差异，性别分层后发现男性IL-1β．31C〉T位点和女性IL-1β＋3954C〉T位点的等位基因频率，在病例组和对照组间存在差异；单倍型分析发现IL-1β-511T／IL-1β-31C／IL-1β＋3954C／IL-1RNT（TCCT）单倍型增加CHD发病风险（OR=1．217，95％CI：0．950—1．559，P=0．123），CTCC和玳T单倍型降低cHD发病风险（OR=0．612，95％CI：0．376～0．994，P=0．046；OR=0．365，95％CI：0．154～0．862，P=0．017）；病例组血清学指标的相关性分析未发现其与SNP位点之间有关联性。结论应用HRM技术建立的4个SNP位点PCR—HRM检测方法经测序验证和临床标本检测均能正确基因分型，实现了快速基因分型的均相检测。IL-1β-31C〉T、IL-1β＋3954C〉T位点和单倍型CTCC和TTCT与中国兰州地区汉族人群CHD易感性有关。

实时荧光多重聚合酶链反应-高分辨率溶解曲线分析鉴别6种致腹泻性大肠埃希菌的研究

目的建立一种鉴别6种致腹泻性大肠埃希菌的实时荧光多重聚合酶链反应-高分辨率溶解曲线分析方法。方法根据6种致腹泻大肠埃希菌的8种特异性毒力基因设计8对引物,采用实时荧光多重聚合酶链反应后溶解曲线分析,根据曲线的峰值、高度、宽度、面积不同鉴别不同的致病菌。结果成功设计出8对引物,扩增出针对6种致腹泻大肠埃希菌的8种不同毒力基因,获得了特异性的溶解曲线。优化反应体系后在同一反应管中成功获得针对8种特异基因的溶解曲线,除肠侵袭性大肠杆菌、细胞致死膨胀性大肠杆菌具有相同的两种基因不能鉴别外,其中5种致腹泻性大肠埃希菌均可以明确鉴别。结论多重聚合酶链反应-高分辨率溶解曲线分析鉴别致腹泻性大肠埃希菌是一种简单、特异、高效的方法,在腹泻病与食源性疾病的暴发调查和日常监测中具有广泛的应用价值。

高分辨率熔解曲线技术检测耐利福平结核杆菌

目的建立1种基于荧光定量PCR扩增原理的联合高分辨率熔解曲线技术(qPCR-HRM),用于耐利福平结核杆菌(RR-TB)的快速检测。方法选取GenBank中结核杆菌rpoB基因序列(利福平耐药决定域),分别设计2对特异性引物rpoB-1R/F、rpoB-2R/F扩增rpoB基因的不同片段,构建荧光定量PCR反应体系,加入HRM饱和荧光染料监测扩增产物进行HRM分析。以H_(37)R_a菌株为阴性对照,检测240株临床诊断肺结核培养菌株对利福平(RFP)的耐药性;以传统的药敏实验结果为金标准,对qPCR-HRM法检测RR-TB的灵敏度、特异度、重复性进行评估。结果 qPCR-HRM法检测RR-TB灵敏度为84.8%,特异度为96.5%,批内、批间变异系数均<1%,检测时间为2h以内。结论 qPCR-HRM法检测RR-TB耗时较短、特异度强、灵敏度高、快速易操作,适合在有条件的基层医疗机构进行推广。

聚合酶链反应-高分辨率熔解曲线技术在下呼吸道细菌鉴定中的应用

为探讨聚合酶链反应-高分辨率熔解曲线(PCR-HRM)技术在检测呼吸道菌群中的应用,本研究用支气管镜从慢性阻塞性肺病患者下呼吸道采集分泌液,提取细菌总DNA,以16S通用引物27F/1492R扩增16S rDNA全长,PCR产物经电泳、纯化后连接到pGEMT-Easy载体上,构建16SrDNA克隆文库。然后以16S rDNA V3区通用引物338F/518R扩增克隆文库,V3区PCR-HRM分析在罗氏LightCycler 480实时荧光定量PCR系统中进行,采用HRM基因扫描软件分析数据。根据不同HRM图型,挑选克隆株测序并鉴定菌株。结果显示,PCR-HRM技术可灵敏区分下呼吸道不同细菌16SrDNA V3区,根据HRM图谱可极大减少克隆菌株测序样本,提示PCR-HRM技术可作为一种快速、高通量、敏感、经济的菌群多样性检测方法。

高分辨率熔解曲线分析技术检测BRAF基因V600E突变方法的建立及初步临床应用

目的建立高分辨率熔解曲线分析技术(high resolution melting,HRM)检测BRAF基因V600E突变的方法,并探讨其在临床检测中的应用价值。方法用所建方法检测16例甲状腺乳头状癌患者超声引导下细针穿刺抽吸活检标本,并与测序法结果进行比较分析。结果所建HRM检测方法 Ct值与Tm的CV值均较小,重复性好。HRM法BRAF基因V600E突变检测标本的结果与测序法相比较,突变检出率分别为43.75%和40.00%,敏感性为100.00%,特异性为90.00%。结论成功建立的HRM法检测BRAF基因V600E突变敏感性高,特异性强,重复性好,操作简便,节约时间,成本低,适合细针穿刺抽吸活检标本检测BRAF基因V600E突变。

高分辨率熔解曲线技术常用的仪器和荧光染料

高分辨率熔解曲线技术(HRM)是近年来发展迅速的一项用于基因突变扫描与检测的新技术。由于具备快速、简便、价廉、高通量和闭管均相检测等优点,HRM已被广泛地应用于突变基因的扫描、基因分型、遗传配型以及法医学鉴定等领域,并受到越来越多的关注且发展迅速。本文就该技术常规应用时的相关仪器与荧光染料的发展及应用进行分析总结。

高分辨率熔解曲线分析技术检测血清游离DNA的EGFR基因突变

目的利用高分辨率熔解曲线分析技术(high resolution melting,HRM)检测石蜡包埋组织和血清游离DNA的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突变,分析两者之间的关系,并探讨其临床应用价值。方法利用HRM技术检测EGFR基因突变的方法,检测200例非小细胞肺癌患者石蜡包埋标本和200例相应的血清游离DNA,并将二者结果进行比较分析。结果HRM法检测非小细胞肺癌患者石蜡包埋组织DNA的EGFR基因突变总检出率为43.5%,血清游离DNA的EGFR基因突变总检出率为25.0%,HRM法检测血清游离DNA的EGFR基因突变与检测石蜡包埋组织DNA的EGFR基因突变相比,敏感性为57.5%,特异性为100%。结论 HRM法检测血清游离DNA的EGFR基因突变为无法获取肿瘤组织标本的患者提供了新的检测机会。

高分辨率溶解曲线分析miRNA-196a2基因多态性与肺癌相关性

目的探讨microRNA-196a2基因多态性（rs1614913）与中国人群肺癌发病相关性。方法应用高分辨率溶解曲线（high resolution melting,HRM）分析技术对32例肺癌患者、27例肺部良性肿瘤患者及84例健康个体的microRNA-196a2基因多态性进行分析,并采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-restriction fragment length polymorphism,PCRRFLP）技术加以佐证。结果 micro-196a2在各组基因型分布均达到Hardy-Weinberg平衡。肺癌组C等位基因的分布频率高于对照组（P=0.0016）,OR=2.592（95%CI1.424～4.716）,说明C等位基因增加肺癌患病风险。结论 MicroRNA-196a2T/C（rs1614913）多态性增加肺癌的发病风险。MicroRNA-196a2基因多态性rs1614913可能是肺癌的一种有效的遗传标记物。

应用非标记探针高分辨率熔解曲线技术检测人巨细胞病毒UL97基因H520Q突变

目的建立非标记探针高分辨率熔解曲线分析技术(HRMA)检测人巨细胞病毒(HCMV)UL97基因H520Q突变。方法构建HCMV UL97野生型以及H520Q突变质粒,非标记探针HRMA分型技术检测H520Q突变。结果直接从PCR产物得到的熔解曲线峰形无法区分野生型及H520Q突变型,应用非标记探针HRMA技术可以明显增加实验的敏感性及准确性,可成功区分从野生型到含有不同量的H520Q突变的基因型。结论非标记探针HRMA技术是一个敏感、经济的检测H520Q突变的基因分型方法。

基于高分辨率熔解度曲线技术的金银花真伪鉴别方法研究

金银花为常用大宗中药材,具有清热解毒功效,有些不法商家将价格便宜近十倍的山银花当金银花销售和使用,严重危害市场。为鉴别中药材金银花真伪,本研究基于高分辨率熔解曲线技术(High Resolution Melting,HRM),建立了金银花真伪分子鉴定方法。提取样品总DNA,对金银花及其伪品山银花的叶绿体基因组标志性核酸位点进行PCR扩增及HRM分析,并与标准样品的曲线作对比,判断供试金银花真伪。标志性核酸位点分型包括G/G、A/A两种,其中G/G型为金银花真品,A/A型为金银花伪品。本研究建立的基于HRM技术的金银花真伪鉴别方法具有快速、高通量的优点,为中草药监管和应用提供技术支撑。

MN血型的高分辨率熔解曲线基因分型——附1例罕见Mc血型的鉴定

目的建立MN血型高分辨率熔解曲线（HRM）基因分型方法,进行MN血型基因分型,并探讨罕见Mc血型的鉴定方法。方法收集2013年1月—6月澳大利亚红十字血液服务中心献血者全血标本150例,提取基因组DNA,并利用HRM基因分型方法对MN血型进行基因分型;对HRM分型结果中出现的变异曲线标本,采用直接测序法对GYPA基因外显子2进行测序分析,确证其基因型;同时,利用单克隆抗-M及抗-N通过血清学方法检测待检标本的表型。结果150例标本中有149例标本的HRM基因分型结果与表型一致;只有1例标本的熔解曲线形态与3个对照标本均不同,提示在扩增片段存在变异位点,血清学结果显示该标本表型为M＋N-;但是,该标本的GYPA基因外显子2测序结果显示其在M抗原的1个特异性SNP位点中存在杂合突变：c.7172GT〉AG,p.Gly5Glu,根据该结果判断其基因型为MMc。结论HRM基因分型方法能对MN抗原进行准确分型。Mc是介于M与N抗原之间的1种抗原,能与大多数抗-M及少数抗-N反应,因此,仅利用1种抗-M和抗-N试剂容易导致Mc抗原的漏检,基因分型方法更容易发现Mc血型。

应用高分辨率熔解曲线分析技术快速产前诊断致死性骨发育不良Ⅰ型2例报告

致死性骨发育不良(Thanatophoric dysplasia,TD)是常见的致死性骨骼发育不良疾病,属常染色体显性遗传病,发生率约为活产的(0.21~0.30)/10000[1]。主要表现为严重短肢、短指/趾、头大、前额突出、鼻梁塌陷、胸廓狭窄、小肋、腹膨隆。

海洋碳汇高分辨率检测技术综述和展望

为助推我国碳中和目标的实现以及提升我国在海洋碳汇领域的国际话语权,文章以海洋碳汇机制为切入点,系统梳理高分辨率生物和化学检测技术及其扩展应用。研究结果表明:海洋惰性溶解有机碳库对于海洋增汇具有重要意义,这对溶解有机碳汇资源高分辨率检测技术提出新的要求;目前具有“指纹特征”的高分辨率检测技术主要包括流式细胞和功能基因芯片生物检测技术以及光谱和质谱化学检测技术,此外结合稳定碳同位素标记技术实现生物溯源和化学检测的链接,均具有重要应用前景。

高分辨熔解曲线技术及其临床应用进展

高分辨率熔解曲线(HRM)技术是一种通过饱和荧光染料实时监测双链DNA的熔解过程,以此反映扩增子DNA序列特性的基因分析新技术。该技术具有快速、高效、高特异性、污染小、廉价等优点,目前已广泛应用于临床医学、生命科学、法医学、药材和食品鉴定领域。本文对高分辨率熔解曲线技术及其在临床医学的应用进行综述。

高分辨率溶解曲线检测9种食源性致病菌方法的建立

当今食源性疾病已成为一个全球关注的食品卫生问题,常见的细菌性食物中毒的病原菌有:致病性大肠杆菌(特别是出血性大肠杆菌O157:H7)、沙门氏菌、志贺氏菌、致病性弧菌(包括霍乱弧菌和副溶血弧菌)、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、空肠弯曲菌以及阪崎克罗诺杆菌等。单独检测一种致病菌已无法满足现今社会对同时高效检测多种致病菌的要求,为建立一种同时对上述9种食品中常见致病菌的检测方法,本研究分别以上述9种菌的特异性基因为靶基因,创新性地结合一对通用引物,建立能同时检测多种食源性致病菌的多重HRM-real time PCR检测体系。结果表明该多重HRM-real time PCR检测体系通过两管PCR反应可对上述9种食品中常见致病菌进行有效的检测与区分,且具有良好的特异性和灵敏度。

高分辨率熔解曲线分析技术检测结核分枝杆菌的耐药性

目的高分辨率熔解曲线(High resolution melting,HRM)技术检测结核菌耐药的结果评价。方法收集自2011年1月至2012年12月期间在深圳市第三人民医院住院进行抗痨治疗的结核病患者的痰标本134例,应用全自动快速分枝杆菌培养鉴定药敏系统BACTC-MGIT 960进行快速检测,获得所需要的结核菌培养药敏结果。针对利福平耐药相关rpo B基因的利福平耐药决定区区域和异烟肼耐药相关基因kat G315位点和inh A-15位点分别进行HRM扩增分析,从而获得利福平耐药决定区、kat G315、inh A-15的基因突变信息,进而判断各菌株是否存在利福平和异烟肼的耐药。结果 134株结核菌临床分离株经结核菌药敏实验判定,有28株对利福平耐药,27株对异烟肼耐药,23株同时对利福平和异烟肼耐药。以结核菌药敏结果为金标准,HRM检测利福平耐药敏感性为96.4%(27/28),特异性为97.2%(103/106),阳性预测值为90.0%(27/30),阴性预测值为99.0%(103/104);异烟肼耐药敏感性为88.9%(23/27),特异性为97.6%(101/107),阳性预测值为79.3%(23/29),阴性预测值为96.2%(101/105)。结论 HRM快速检测结核菌耐药,具有较高的特异性、灵敏度、阳性预测值和阴性预测值,能够满足临床需求。