高分辨率熔解曲线分析法检测结直肠癌组织K-ras基因突变及其临床意义

目的 K-ras基因在结直肠癌的发生、发展以及需要靶向药物治疗的药物选择方面具有重大临床意义。文中旨在探讨高分辨率熔解曲线分析法检测结直肠癌组织K-ras基因突变情况,并分析K-ras基因突变与临床病理参数的关系。方法收集179例结直肠癌患者的手术标本,检测结直肠癌组织中K-ras基因第12、13位密码子的突变情况,并分析K-ras基因突变与临床病理参数的关系。结果 179例结直肠癌组织标本中,K-ras基因突变率为43.02%（77/179）;在≥60岁组结直肠癌患者中K-ras基因突变率明显高于〈60岁组（55.17%vs 33.70%,P〈0.05）。多因素Logistic回归分析结果显示,年龄对K-ras基因突变有显著影响（OR=1.506,95%CI：1.028~2.011）。结论结直肠癌患者K-ras基因的突变与年龄相关,与性别、分化程度、病变部位及Dukes分期无关。

高分辨率熔解曲线分析法检测牦牛脂蛋白脂酶外显子7的多态性及与生长性状相关性分析

脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)是一个分子质量为54kb的糖蛋白,其活性受营养因素、激素水平等调节,因牦牛生存环境的特殊性,试验拟从分子水平研究天峻县牦牛脂蛋白脂酶外显子7(LPL-Exon7)基因的多态性,并与生长发育性状进行关联分析,从而为牦牛营养调控、品种资源保护和遗传育种提供科学理论依据。试验采集青海省海西州天峻县牦牛抗凝血106份,提取血样DNA,并利用PCR技术和高分辨率熔解曲线分析法对候选基因LPL-Exon7进行多态性分析,并于采血的同时对牦牛体重、体斜长、体高、胸围和管围等生长性状指标进行了相关性和遗传效应分析。结果表明,高原牦牛LPL-Exon7基因在高原牦牛和野血牦牛中都表现为多态,存在3种基因型,即AA、AB和BB,由1对等位基因A和B控制,A等位基因均为优势等位基因。经χ2检验,符合哈迪—温伯格(Hardy-Weinberg)定律,处于平衡状态(P>0.05)。该位点在高原牦牛和野血牦牛群体中公、母牦牛的多态信息含量为0.3588和0.2103、0.3219和0.3343,高原牦牛母牛的多态信息含量PIC<0.25,处于低度多态,高原牦牛公牛和野血牦牛公、母牛的多态信息含量均在0.25<PIC<0.50,处于中度多态。LPL-Exon7位点多态对牦牛的体重、体高和管围存在显著影响(P<0.05),对牦牛的体斜长和胸围无显著影响(P>0.05)。因此,初步推断牦牛LPL-Exon7可以作为牦牛标记辅助选择的遗传标记之一。

基于高分辨率熔解曲线分析技术探讨TNF-α基因多态性与银屑病的相关性

目的:运用高分辨率熔解曲线(HRM)分析技术分析TNF-α基因rs3093662位点的多态性与银屑病的相关性。方法:应用荧光定量PCR-HRM分析技术对我院收治的426例银屑病患者(研究组)和485例健康人(对照组)的TNF-α基因位点rs3093662的基因型及等位基因进行测定。结果:rs3093662的AG、AA、GG基因型频率在银屑病研究组和对照组分别是7.98%、92.02%、0.00%和4.54%、95.46%、0.00%,A、G等位基因频率在银屑病研究组和对照组分别是96.01%、3.99%和97.73%、2.27%,组间差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:TNF-αrs3093662的基因多态性可能与银屑病的发病相关,HRM分析技术检测基因多态性具有操作简单,敏感性高,成本低,适合在临床检测中推广应用。

利用高分辨率熔解曲线分析法检测结直肠癌中KRAS基因突变

目的探讨利用新的高分辨率熔解曲线分析法检测结直肠癌中KRAS基因突变的可行性。方法首先采用直接测序法检测15例III期结直肠癌患者中KRAS基因第2外显子上第12和13号密码子的突变情况,继而以高分辨率熔解曲线分析法对直接测序的结果进行验证。结果经直接测序,确认15例结直肠癌患者中有6例发生了KRAS基因突变(40%),突变患者的基因型为:GGT>GAT型占2例,GGT>GTT占2例,GGC>GAC型占1例,GGC>GAA占1例。通过高分辨率熔解曲线分析法对以上15例标本进行进一步验证,证实所有患者的突变情况㈦直接测序方法的结果完全吻合。结论新的高分辨率熔解曲线分析法在检测KRAS基因突变时比直接测序法具有耗时短,易操作的优点,并且检测成本低廉,适合在临床开展。

高分辨率熔解曲线分析法检测毛细胞白血病BRAF基因突变

目的探讨高分辨率熔解曲线分析（HRM）法检测毛细胞白血病（HCL）患者BRAFV600E基因突变的可行性及其意义。方法用HRM法检测4例初治确诊HCL患者BRAFV600E基因突变情况，并回顾性分析患者临床资料。结果HRM法分析4例HCL患者均发生BRAFV600E突变。测序结果与HRM分析结果一致。结论用HRM法检测临床样本BRAFV600E基因突变，具有操作简便、结果准确、成本低的优点，可用于临床辅助诊断。

建立PCR-高分辨率熔解曲线分析法检测淋巴瘤MYD88基因突变

髓系分化起始反应基因88（MYD88）位于染色体3p22，编码蛋白为Toll样受体（TLR）信号传导途径中的一个重要接头分子，结构上主要包括2个功能域：N端的死亡域（DD）和C端的Toll域（TIR），在天然免疫应答和炎症反应中发挥着重要的调控作用[1-2]。最近的研究发现39％活化B细胞（ABC）型弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者中存在MYD88基因的获得性突变[3]，其中位于TIR域的L265P突变发生率最高（29％）。高分辨率熔解曲线分析（High resolution melt—ing curve analysis，HRMA）是一种新型的突变分析技术，具有灵敏度高、特异性好、成本低廉、高通量检测的优点，已在临床上得到越来越多的应用[4]。

高分辨率熔解曲线分析技术检测BRAF基因V600E突变方法的建立及初步临床应用

目的建立高分辨率熔解曲线分析技术(high resolution melting,HRM)检测BRAF基因V600E突变的方法,并探讨其在临床检测中的应用价值。方法用所建方法检测16例甲状腺乳头状癌患者超声引导下细针穿刺抽吸活检标本,并与测序法结果进行比较分析。结果所建HRM检测方法 Ct值与Tm的CV值均较小,重复性好。HRM法BRAF基因V600E突变检测标本的结果与测序法相比较,突变检出率分别为43.75%和40.00%,敏感性为100.00%,特异性为90.00%。结论成功建立的HRM法检测BRAF基因V600E突变敏感性高,特异性强,重复性好,操作简便,节约时间,成本低,适合细针穿刺抽吸活检标本检测BRAF基因V600E突变。

高分辨率熔解曲线分析法检测胶质瘤中异柠檬酸脱氢酶1基因突变

目的采用高分辨率溶解曲线分析法检测胶质瘤中异柠檬酸脱氢酶1（IDH1）基因突变，探讨其应用于临床检测的可行性。方法首先采用高分辨率溶解曲线分析法检测9例胶质瘤患者中IDH1基因的突变情况，并以直接测序法对结果进行验证。结果通过高分辨率熔解曲线分析法，确认9例胶质瘤患者中有6例发生了IDH1突变，其中5例为R132H（CGT〉CAT），1例为R132C（CGT〉TGT），其余检测均为野生型。经直接测序对以上9例标本进行验证，证实所有患者的突变情况与高分辨率熔解曲线分析法的结果一致。结论应用高分辨率熔解曲线分析法检测临床样本IDH1突变与直接测序法比较具有操作简便、快速、结果准确的优点，适合在临床开展。

高分辨率熔解曲线分析(HRM)及其在植物种质资源鉴定中的应用

饱和荧光染料、未标记探针与实时荧光PCR结合产生的高分辨率熔解曲线分析(HRM)是一种新的实时定量技术,在核苷酸差异检测速度、灵敏度和准确性上具有突出的优点,近几年来在突变检测、遗传作图和基因分型等研究中发展迅速。本文对高分辨率熔解曲线分析的原理、特点及其在植物种质资源鉴定中的应用进行了综述。

高分辨率熔解曲线分析—分子诊断的新技术

高分辨率熔解曲线分析(High Resolution Melting,HRM)是近几年来在国际上刚兴起的单核苷酸多态性及突变研究工具.这种检测方法因其高通量、低成本、结果准确、不受检测位点的局限,并且实现了真正的闭管操作而受到普遍的关注.对HRM技术的原理和在分子诊断上的应用进行了阐述,并对最新研究进展作一综述.

高分辨率熔解曲线分析在大肠癌筛查中的应用

目的探讨高分辨率熔解曲线分析(high-resolution melting,HRM)在利用粪便DNA筛查大肠癌中的作用。方法收集住院治疗的31例大肠癌患者、28例大肠腺瘤患者以及20例来医院体检的正常人新鲜粪便标本,应用HRM法检测粪便中APC、K-ras、p53基因的突变情况。结果 31例大肠癌患者粪便中APC基因突变检出率为41.9%(13/31),K-ras基因突变检出率为35.5%(11/31),p53基因突变检出率为54.8%(17/31),3个基因联合检出率为67.7%(21/31);28例大肠腺瘤患者粪便中APC基因突变检出率为25%(7/28),K-ras基因突变检出率为14.3%(4/28),p53基因突变检出率为46.4%(13/28),3个基因联合检出率为64.3%(18/28);20例正常对照粪便中APC基因突变检出率为5%(1/20),K-ras基因突变率为0(0/20),p53基因突变率为0(0/20)。大肠癌组和大肠腺瘤组基因突变检出率均高于正常对照组(P<0.05),而大肠癌和大肠腺瘤组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论利用HRM法检测粪便中APC、K-ras和p53基因突变在大肠癌筛查中具有潜在的应用价值。

高分辨率熔解曲线法在BIM基因2,903bp片段插入/缺失检测中的应用

背景与目的 BIM基因编码的蛋白属于BCL2蛋白家族的成员,作为凋亡调控因子参与多种细胞活动。BIM基因上2,903bp的插入缺失片段与非小细胞肺癌EGFR-TKI靶向用药的获得性耐药相关。建立并优化HRM方法有助于快速、准确地检测BIM基因2,903 bp片段的缺失,为临床工作提供指导性的意见。本研究建立与稳定了HRM的检测方法,并在30例肺癌样本以及30例正常对照样本中检测BIM基因缺失情况。方法设计、合成针对BIM基因片段缺失的引物,优化高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)分析方法。并选取部分样本通过普通PCR方法和直接测序法检测BIM基因缺失情况。野生型模板扩增产物其解链温度要高于缺失型产物的解链温度。野生型和缺失型产物的熔解曲线可见明显差异,相应的Tm值相差约2.5 oC。结果经过HRM基因突变分析方法,在30例肺癌样本中检测到1例为BIM基因纯合缺失型,7例为杂合缺失型,22例为野生型。在30例正常对照样本中检测,2例为杂合缺失型,28例为野生型。结论本研究建立的对BIM基因片段缺失的高分辨率熔解曲线法是一种,灵敏、准确、快速、高通量的方法。

高分辨率熔解曲线法检测JAK2基因V617F突变及其应用

目的探讨实时定量PCR方法和高分辨率熔解曲线法(HRM)在检测JAK2基因V617F突变中的应用。方法以JAK2基因V617F发生纯合突变的人红白血病细胞株(HEL)及不含JAK2基因V617F突变的人白血病细胞株(HL60)为阳性对照和阴性对照,优化HRM法检测条件,分别以优化的HRM法和直接测序法对63例临床疑似骨髓增殖性肿瘤(MPN)患者DNA标本进行JAK2基因V617F突变检测,评价2种检测方法结果的一致性。结果 HRM法可检出系列混合样本中5%的突变型等位基因突变,且重复性较高。以测序法为金标准,HRM法的敏感性和特异性均为100%,两种方法结果一致。结论 HRM法能够在单一闭管体系中实现对JAK2基因V617F突变的检测,具有较高的敏感性和特异性,可用于JAK2基因V617F突变的临床检测。

甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析筛查大肠癌的性能评价

目的评价通过甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(MS-HRM)检测粪便中人DNA甲基化筛查大肠癌(CRC)的性能。方法收集合格的新鲜粪便标本82例,其中CRC患者27例(CRC组)、进展期腺瘤(AA)患者25例(AA组)和结肠镜阴性的正常人30例(对照组),在LightCycler 480设备上应用MS-HRM技术检测上述粪便中vimentin基因的甲基化状态,并与粪便潜血试验(FOBT)的诊断性能相比较。结果 MS-HRM在CRC组、AA组和对照组中检测vimentin基因甲基化的阳性率分别为81.5%(22/27),80.0%(20/25)和6.7%(2/30)。FOBT在CRC组、AA组和对照组中的阳性率分别为37.0%(10/27),12.0%(3/25)和3.3%(1/30)。在病例组中,MS-HRM和FOBT的诊断敏感性分别为80.8%(42/52)和25.0%(13/52),前者显著高于后者(P<0.05);在对照组中两者的诊断特异性分别为93.3%(28/30)和96.7%(29/30),两者差异无统计学意义(P>0.05)。结论在CRC筛查中,MS-HRM技术检测粪便中vimentin基因甲基化状态的诊断性能明显优于FOBT,具有潜在的应用价值。

高分辨率熔解曲线分析技术检测血清游离DNA的EGFR基因突变

目的利用高分辨率熔解曲线分析技术(high resolution melting,HRM)检测石蜡包埋组织和血清游离DNA的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突变,分析两者之间的关系,并探讨其临床应用价值。方法利用HRM技术检测EGFR基因突变的方法,检测200例非小细胞肺癌患者石蜡包埋标本和200例相应的血清游离DNA,并将二者结果进行比较分析。结果HRM法检测非小细胞肺癌患者石蜡包埋组织DNA的EGFR基因突变总检出率为43.5%,血清游离DNA的EGFR基因突变总检出率为25.0%,HRM法检测血清游离DNA的EGFR基因突变与检测石蜡包埋组织DNA的EGFR基因突变相比,敏感性为57.5%,特异性为100%。结论 HRM法检测血清游离DNA的EGFR基因突变为无法获取肿瘤组织标本的患者提供了新的检测机会。

高分辨率熔解曲线分析用于大肠肿瘤分子检测

基于流行病学和病理学证据,目前认为绝大多数大肠癌（CRC）是从腺瘤逐步演变而来,进而形成人们普遍接受的＂正常-小腺瘤-大腺瘤-癌＂癌变模式,推动这进程是许多特定基因突变和（或）表观遗传学改变的逐步累积效应这些特异性分子的改变可用作大肠肿瘤标志物。而寻求高效、准确、价廉的检测方法是肿瘤分子标志物检测的热点。

检测AKT1基因E17K突变的高分辨率熔解曲线法(HRM)

建立并优化HRM方法检测AKT1基因的E17K(49G>A)突变,并在85例非小细胞肺癌中应用该法检测AKT1基因的E17K突变。设计、合成针对AKT1基因的E17K突变的引物、探针,优化不对称PCR条件及高分辨率熔解曲线(HRM)基因突变分析方法。对85例非小细胞肺癌标本提取的基因组DNA,应用HRM基因突变分析方法和直接测序的方法检测了AKT1基因的E17K突变情况。经优化后,设计的引物在不对称PCR反应条件下可扩增出良好的条带。检测探针与野生型模板的扩增产物杂交后,其解链温度要高于与突变型产物杂交的解链温度。野生型和突变型的质粒模板所产生的熔解曲线可见显著差异,相应的Tm值相差约3.5℃。经HRM基因突变分析方法和直接测序法检测,在85例非小细胞肺癌标本检测到1例AKT1基因的E17K位点为杂合突变型,其余均为野生型。本研究建立的对AKT1E47K突变检测的HRM方法是一种灵敏、准确、快速的方法。另外,本研究仅在非小细胞肺癌患者中发现频率极低的AKT1E47K突变。

高分辨率熔解曲线分析检测大肠癌患者粪便基因突变与临床病理参数的关系

目的初步探讨高分辨率熔解曲线分析检测大肠癌患者粪便DNA突变与临床病理参数的关系。方法收集2009年3月～2009年9月在本院住院的39例大肠癌患者的新鲜粪便标本约1g,应用HRM法检测粪便中APC、K-ras、P53基因的突变情况,并对结果进行统计学分析。结果大肠癌患者粪便中APC、K-ras、P53基因的突变与大肠癌患者性别、年龄、分化状态、病变部位、Dukes分期和有无淋巴结转移无关。结论未发现粪便APC、K-ras和P53基因突变情况与大肠癌患者的临床病理参数具有相关性。

不同操作平台、染料间高分辨率熔解曲线分析技术检测粪便基因突变的性能差异

目的探讨在不同操作平台、染料间高分辨率熔解曲线分析(HRM)技术检测粪便基因突变的性能差异。方法收集合格的粪便125份,其中大肠癌40份,晚期腺瘤35份,正常对照50份,在LightCycler 480与Rotor-Gene 6000平台设备上,分别使用Resolight或Eva Green染料,检测K-ras基因突变率的差异,所有样品均行测序。结果测序发现,大肠癌组、晚期腺瘤组、正常对照组K-ras基因突变率分别是40%、31.4%、0%。在LightCycler 480平台,用Resolight/Eva Green染料突变检出率分别为40%/45%、31.4%/34.2%、0%/0%。在Rotor-Gene 6000平台,用Resolight/Eva Green染料突变检出率分别为42.5%/47.5%、34.2%/37.1%、0%/0%。在各组中,不同操作平台、染料间突变检出率差异无统计学意义(P>0.05)。HRM检测粪便基因突变敏感度达100%。结论 HRM在不同操作平台、染料间的突变检出率差异无显著性。

高分辨率熔解曲线分析对38例孤独症DRD_2基因外显子突变检测

目的对孤独症患者DRD2基因全部外显子进行突变筛查。方法构建孤独症患者纳入研究组(38例)和对照组(95例和1 000例)3个DNA混合池,对DRD2基因的9个外显子合成了15对引物,将3个DNA混合池样本分别进行聚合酶链扩增及COLDPCR扩增,用Light Scanner高分辨率熔解曲线分析系统进行两次熔解曲线对比。结果在孤独症患者DRD2基因外显子未发现突变。结论孤独症的病因并非源于DRD2基因外显子的突变。