nm23-H1基因及HMGB1、LC3Ⅱ在ALL早期诊断中的应用及对化疗敏感性的影响

目的分析骨髓单个核细胞(BMMNC)的nm23-H1基因及外周血高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、Ⅱ型微管相关蛋白轻链3(LC3Ⅱ)水平在急性淋巴细胞白血病(ALL)早期诊断中的应用价值及对化疗敏感性的影响。方法选取2017年1月至2018年10月间青海省中医院收治的120例ALL患者作为研究对象,依照患者细胞形态学分为L1、L2、L3组,选择本院同期体检健康者40例作为对照组;检测BMMNC中自噬相关蛋白5(Atg5)、BECLIN基因编码蛋白-1(Beclin-1)、nm23-H1基因编码蛋白-H1(nm23-H1)、转铁蛋白(TfR)、纤黏蛋白(FN)、LC3Ⅱ及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的mRNA转录水平,采用Wester blot法检测血清中高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、LC3Ⅱ、血小板源生性生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子A(VEGF-A)、血管内皮生长因子受体1(VEGF-R1)、血管内皮生长因子受体2(VEGF-R2)、血管内皮生长因子受体3(VEGF-R3)及GAPDH蛋白表达量;建立白血病细胞株分为K562组、HL-60细胞组、非肿瘤细胞对照组,检测HMGB1及GAPDH的mRNA及蛋白量表达,通过基因转染使白血病细胞高表达HMGB1,用阿毒素(ADM)、长春新碱(VCR)处理细胞并采用四唑盐比色法(MTT)检测细胞存活率。结果L3期患者BMMNC中Atg5、Beclin-1、nm23-H1、TfR、FN及LC3Ⅱ水平均显著高于L2组及L1组,差异具有统计学意义(P<0.05);L3期患者血清中HMGB1、LC3Ⅱ、PDGF、VEGF-A、VEGF-R1、VEGF-R2、VEGF-R3蛋白水平均显著高于L2组及L1组,差异具有统计学意义(P<0.05);Atg5 mRNA、Beclin-1 mRNA、TfR mRNA、FN mRNA、LC3ⅡmRNA、HMGB1及LC3Ⅱ水平是影响BMMNC中nm23-H1基因水平的独立性因素(P<0.05);K562组、HL-60细胞组及非肿瘤细胞组中HMGB1水平存在明显差异,且差异有统计学意义(P<0.05);ADM及VCR干预过表达HMGB1的K562及HL-60细胞细胞存活率显著高于野生型,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论BMMNC的nm23-H1基因及外周血HMGB1、LC3Ⅱ水平在评估患者病情是重要的生物学指标,且高表达HMGB1可能降低化疗敏感性。

胞外高迁移率组蛋白1对HTLV-1感染的T细胞中病毒复制的影响

目的探讨胞外的高迁移率组蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）对人T淋巴细胞白血病病毒1型（human T-cell leukemi int1，HTLV-1）感染的T细胞中病毒复制的影响。方法ELISA检测HTLV．1病毒阴性T细胞系Jurkat、MOLT4细胞及HTLV-1病毒阳性的T细胞系MT2、MT4细胞培养上清中的HMGBl水平；将HTLV-1的长末端重复序列荧光素酶报告基因pHTLV-1-LTR-luc转染病毒阳性细胞MT2，随后加入终浓度为0．25、0．50、0．75μs／ml的HMGBl多克隆抗体（PcAb）及其同型对照抗体，30、100、300ns／ml的重组人HMGB1蛋白（rhHMGB1）及其对照PBS，48h后检测荧光素酶活性；在病毒阳性细胞MT2中加入终浓度为0．25斗晷／ml的HMGBlPcAb及同型对照抗体，300ng／ml的rhHMGB1及对照PBS，real．timePCR检测病毒编码基因tax、poll、pol2、p19、gag、env。结果HTLv．1病毒阴性T细胞系和HTLV．1病毒阳性细胞系培养上清中的HMGBI水平无明显差异；0．25μg／ml的HMGBlPcAb可明显抑制HTLV-1-LTR的转录活性，而300ng／ml的rhHMGB1可明显促进HTLV．1．LTR的转录活性；real．timePCR检测显示0．25恤g／ml的HMGBlPcAb可明显抑制病毒编码基因poll,po／2、gag、e删的表达，300ns／ml的rhHMGB1可明显促进pol1、pol2、gag、env的表达。结论胞外的HMGB1可促进HTLV-1病毒感染T细胞的病毒复制。

HTLV-1 Tax蛋白对T细胞中HMGB1调控的影响

目的探讨人T淋巴细胞白血病1型病毒（humanT—cellleukemiavirus1，HTLV-1）Tax蛋白对人高迁移率族蛋白1（highmobilitygroupbox1，HMGB1）基因转录调控的影响。方法提取TaxN和TaxP细胞总RNA和蛋白质，通过real—timePCR和Westernblot分析HMGB1mRNA和蛋白质的表达情况；利用脂质体介导方法，将6个含有不同长度HMGB1调控序列的pGL3-HMGB1-luc瞬时转染至TaxN和TaxP细胞，观察HMGB1基因在不同T细胞中的转录活性；pCMV—Tax与pGL3-HMGB1-luc瞬时共转染至Jurkat细胞，观察Tax蛋白对HMGB1基因的转录调控影响；染色体免疫共沉淀（ChIP）找寻Tax蛋白影响HMGB1基因转录调控的区段。结果TaxP细胞中HMGB1mRNA和蛋白质表达水平高于TaxN细胞。TaxN和TaxP细胞中HMGB1调控趋势基本相似，均表现出3号质粒（pHLuc3，含有-504～＋83HMGB1区段）的相对荧光素酶活性（HMGB1／neo）最高，但是6号质粒（含有-1163-＋83HMGB1区段）却表现出TaxP细胞HMGB1的转录活性明显高于TaxN细胞。pCMV．Tax与pGL3．HMGB1．Luc报告基因共转染到Jurkat细胞也显示，6号质粒（pHLuc6）中Tax促进HMGB1基因的转录。ChIP分析证实了Tax蛋白可能富集在HMGB1的-1163—-1043区段。结论-504—-383可能是HMGB1基因转录激活的关键启动子区，Tax蛋白可能富集在HMGB1的-1163～-1043区段促进HMGB1基因转录。

rhHMGB1对HTLV-1＋MT2细胞中HMGB1相关受体表达的影响

目的探讨重组人高迁移率族蛋白1（recombinant human HMGB1，rhHMGB1）对人T淋巴细胞白血病病毒1型（HTLV-1）感染的T细胞中与HMGB1相关膜受体表达的影响。方法病毒阳性细胞MT2中加入终浓度为1μg／ml的人源化重组人rhHMGB1蛋白或等体积的PBS，培养24h后，以流式细胞术、免疫印迹、免疫荧光检测膜受体晚期糖基化终产物受体（receptor for advanced glycosylation end products，RAGE）、T细胞相关免疫球蛋白黏蛋白3（T cell immunoglobulin mucin3，TIM-3）、Toll样受体4（Toll like receptor4，TLR4）的表达及分布。结果流式细胞术检测结果显示1μg／ml rhHMGB1刺激MT2细胞后，与对照相比RAGE表达下降，TLR4的表达明显升高（P〈0．05）；免疫印迹检测结果显示1μg／ml rhHMGB1刺激MT2细胞后，细胞总蛋白和胞质中，膜受体RAGE和TLR4表达均明显升高（P〈0．05），而TIM-3的表达没有明显变化；免疫荧光检测结果显示rhHMGB1刺激MT2细胞后TLR4和RAGE的荧光强度均有增加，而TIM-3的荧光强度没有明显变化，且TLR4、TIM-3集中于细胞膜，而RAGE则集中于细胞质，细胞膜表达较少。结论胞外的HMGB1可促进HTLV-1感染T细胞RAGE和TLR4的表达。