丙型肝炎病毒高变区1合成肽抗原性验证

设计合成丙型肝炎病毒高变区 1合成肽 ,并验证其抗原性。应用计算机软件设计抗原肽 ,合成后免疫小鼠 ,检测小鼠血中抗体滴度 ;计算机模建抗原肽结构 ,预测其抗原性。 7条合成肽中 ,计算机模建显示第 4、5、6、7号肽具有较好的抗原性 ,酶联免疫吸附实验表明第 4、6、7号肽可使机体产生抗体 ,抗原性较强 ,二者结果基本相符。

对中国人群中III/2a型HCV高变区1序列变异规律的横断研究

目的研究中国丙型肝炎患者III/2a型丙型肝炎病毒(HCV)包膜蛋白E2/NS1高变区1(HVR1)序列变异的规律及意义。方法应用逆转录巢式PCR技术,从38例III/2a型HCV感染患者血清中 ,扩增HCV部分包膜区基因片断(nt1460～1582,HCV J6),纯化后直接采用双脱氧链末端终止法进行序列分析。结果本组III/2a型HCVHVR1位于氨基酸(aa)384～408位,与有关文献报道的结果(383～410或414位)略有差异。与HCV J ,河北株、HCV 1和HCV J6相应序列比较 ,核苷酸(nt)的同源性依次为 :32 %～56 %(平均45.4 %) ,41.7 %～60.0 %(50.7 %) ,41.3 %～62.7 %(53.3 %)和49.3 %～73.3 %(58.9 %) ;aa的同源性依次为 :16 %～48 %(33.5 %) ,28 %～60 %(42.5 %) ,24 %～64 %(45.3 %)和20 %～64 %(39.4 %)。我们在本组HVR1内发现 ,5个较保守的aa位点:385位为Thr,389 ,390和406位为Gly,403位为Phe,其中390位未见于其它报道。结论本组序列变异集中于aa384～408位 ,且以异义替换为主 ,构成了免疫逃逸的基础 ,但某些位点上序列相对保守,这些位点可能是HCV抗原表位的结构位点。对HVR1序列变异规律及其生物学意义的进一步研究 ,将有助于了解HCV的致病机制及疫苗的研制。

丙型肝炎病毒复合高变区1模拟表位蛋白的免疫原性分析

将丙型肝炎病毒高变区1(HVR1)模拟表位融合基因插入原核表达载体pGEX-4T-1,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,经亲和层析和凝胶过滤层析获得HCVHVR1模拟表位融合蛋白。用Westernblot和ELISA检测融合蛋白与HCV抗体阳性血清的结合情况。皮下注射免疫BALB/c小鼠,用ELISA检测小鼠血清中的抗HCV抗体水平及其与天然HCV高变区1合成肽的交叉反应。结果表明融合蛋白能与HCV抗体阳性血清特异结合,融合蛋白与HCV抗体阳性血清的结合频率为71.6%(25/35)。融合蛋白免疫小鼠后能有效诱导免疫应答,其诱生的特异性抗体最高滴度达104(免疫后第8周),且该抗体能同2条天然HCVHVR1合成肽发生交叉反应。本研究提示,HCV复合HVR1模拟表位融合蛋白在丙型肝炎疫苗的研发中可能具有潜在应用价值。

中国人群Ⅱ和Ⅲ型HCV高变区1序列变异规律的比较研究

目的 :比较中国人群 和 型丙型肝炎病毒 (HCV)包膜蛋白 E2高变区 1(HVR1)序列变异特点 ,并探讨其意义。方法 :应用逆转录巢式 PCR技术从 5 5例中国人 型、38例中国人 型 HCV感染患者血清中扩增 HCV部分包膜区基因片段[核苷酸 (nt) 144 9～ 15 86 (HCV- J)或 nt 146 0～ 15 82 (HCV - J6 ) ],纯化后直接采用双脱氧链末端终止法进行序列分析。 结果 :中国人群 、 型 HCV HVR1均位于氨基酸 (aa) 384～ 40 8位 ,内有 5个相同的保守位点 :385位 Thr,389、390、40 6位Gly,40 3位 Phe。此外 ,在 型 HVR1中 40 1位 Ser也相当保守。 、 型间变异特点相似 ,但部分位点的变异程度、氨基酸出现的种类与频率及高变区两端保守区序列仍有差异。 结论 :对 HVR1序列变异规律及其生物学意义的进一步研究将有助于了解

丙型肝炎病毒高变区1模拟表位的交叉反应性分析

研究丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)高变区1(Hypervariable region 1,HVR1)抗原表位的交叉反应性,获取高反应性的抗原表位。设计并合成5种HVR1模拟表位基因,构建编码HVR1模拟表位的表达载体,表达并纯化表位蛋白。ELISA法检测表位蛋白与35份HCV抗体阳性血清的交叉反应性。包装HCV假病毒(HCVpseudotype particles,HCVpp),评价表位蛋白免疫BALB/c鼠血清在假病毒感染Huh7.5细胞中的作用。结果表明,表达纯化的5种表位蛋白(P1、P2、P5、P6、P8)均可与HCV抗体阳性血清反应,阳性反应率分别为54.3%(P1)、62.9%(P2)、80%(P5)、68.6%(P6)、54.3%(P8)。表位蛋白P6、P8免疫BALB/c鼠血清对HCV假病毒感染Huh7.5细胞具明显的抑制作用。结果提示,选取的HVR1模拟表位在HCV感染免疫与疫苗研制中可能具有潜在的价值。

丙型肝炎病毒高变区1中介导感染的关键氨基酸残基鉴定

丙型肝炎病毒(HCV)包膜E2蛋白氨基端的高变区1(HVR1)由27个氨基酸组成,是HCV蛋白中变异频率最高的肽段。HVR1含中和抗体表位,同时对HCV细胞侵入起重要作用,其结构与功能的关系目前尚不清楚。本研究对H77株包膜蛋白基因中的HVR1进行了一系列缺失突变,然后将突变体表达质粒与假病毒包装质粒共转染人胚肾(HEK)293T细胞,用蛋白免疫印迹法检测细胞中HCV包膜E2蛋白的表达,用荧光定量聚合酶链反应检测培养上清液中的HCV假病毒(HCVpp)含量,以人肝癌细胞Huh7.5为靶细胞检测HCVpp的感染力。结果显示,缺失整个HVR1或HVR1中部分氨基酸残基对HCV包膜蛋白表达及HCVpp产量均无明显影响,但对HCVpp感染力产生不同影响。缺失第16～24位氨基酸残基导致HCVpp感染力增强,缺失第1～8位或1～12位氨基酸残基仅部分降低HCVpp感染力,缺失第13～15位和25～27位中的任意一个氨基酸残基均导致HCVpp感染力低于原型的5%。结果提示,HVR1中第13～15位和25～27位的6个氨基酸是介导HCV感染的关键氨基酸残基。

抗高变区1早期抗体反应与急性自限性丙型肝炎病毒感染相关

对丙型肝炎病毒(HCV)多聚蛋白不同区的抗体反应和T细胞介导的免疫反应已进行了研究。但到目前为止,尚未发现与急性自限性或持续性感染相关的预后指标。 针对HCV高变区1(HCR1)的抗体近来已被证明可在体外1中和相应的HCV分离株。

20例中国人HCVⅡ/1b型高变区1序列变异的动态观察

目的 动态研究中国人群HCVⅡ /1b型包膜蛋白E2 /NS1高变区 1(HVR1)序列变异规律、意义及影响因素。方法 应用逆转录巢式PCR技术从 2 0例HCVⅡ /1b型感染的中国病人血清中扩增了HCV部分包膜区基因片段 (nt144 9～ 15 86 ,HCV J) ,纯化后直接采用双脱氧链末端终止法进行序列分析。结果 中国人群HCVHVR1位于氨基酸 (AA) 384～ 410位 ,有 6个较保守的AA位点 :385位Thr,389、390、40 6位Gly ,40 3位Phe ,40 9位Gln。自然病程组核苷酸 (nt)变异率每年 [0～ 2 0 7(平均0 5 0 ) ]× 10 1个 /位点 ,AA变异率每年 [0～ 6 2 2 (平均 1 2 4) ]× 10 1个 /位点 ,干扰素治疗组nt变异率为每年 [0～ 5 0 3(平均 2 31) ]× 10 1个 /位点 ,AA变异率每年 [0～ 10 7(平均 4 40 ) ]× 10 1个 /位点。干扰素治疗对HVR1区变异有较强的免疫选择作用 ,HVR1变异率高低与慢性肝炎的临床病程有一定联系 ,肝炎活动期变异明显。结论 对HCVHVR1区变异规律及其生物学意义的进一步研究将有助于了解HCV慢性感染机理、制定新的治疗方案及疫苗设计等。

北京地区46例Ⅱ/1b型HCV高变区1的序列变异研究

目的研究北京地区Ⅱ／１ｂ型丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）包膜蛋白Ｅ２／ＮＳ１高变区１（ＨＶＲ１）序列变异规律及意义。方法应用逆转录巢式ＰＣＲ技术从４６例北京地区Ⅱ／１ｂ型ＨＣＶ感染病人血清中扩增了ＨＣＶ部分包膜区基因片断（ｎｔ１１１９～１２５８），纯化后直接采用双脱氧链末端终止法进行序列分析。结果北京地区Ⅱ型ＨＣＶＨＶＲ１位于氨基酸（ａａ）３８４－４０８位，与有关文献报道（３８３－４１０或４１４）略有差异。ＨＶＲ１序列与ＨＣＶ－Ｊ、台湾株、河北株、ＨＢ－１１相应序列比较，核苷酸同源性依次为４４０％～６６．７％（平均５７．７％），４８．０％～７２．０％（６０．０％），６０．０％～８５．３％（６９．８％）和５６．０％～８１．３％（６８．２％），氨基酸同源性依次为２０．０％－５６．０％（３８．２％），３２．０％～６４．０％（４５．７％），３６．０％～７６．０％（４９．８％）和４０．０％～７６．０％（５５．６％）。本组ＨＶＲＩ内发现６个较保守的氨基酸位点：３８５位Ｔｈｒ，３８９，３９０，４０６位Ｇｌｙ，４０１位Ｓｅｒ，４０３位Ｐｈｅ。结论对ＨＶＲ１序列变异规律及生物学意义的进一步研究有助于ＨＣＶ疫苗的发展。

丙型肝炎高变区1合成肽体外刺激HCV感染PBMC细胞因子分泌的研究

目的检测丙型肝炎病毒(HCV)高变区1(HVR1)模拟表位刺激自然感染患者外周血淋巴细胞后的细胞因子水平变化。方法细胞因子检测运用ELISA、流式细胞仪(FACS)淋巴细胞分类以及计算机模拟多肽抗原性。结果(1)1号和5号合成肽刺激HCV患者外周血单核细胞(PBMC)后,患者PBMC出现了明显的增殖;(2)培养上清中干扰素γ(IFNγ)、白介素4(IL-4)、白介素10(IL-10)都有不同程度的提高,白介素2(IL-2)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平并没有提高;(3)增殖细胞主要为CD4阳性淋巴细胞。结论我们设计的HCV高变区1合成肽引发的免疫因子的释放倾向于TH2类因子。

献血人群中丙型肝炎病毒第1高变区抗体检测及意义

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)第一高变区(HVR1)抗体检测在献血者血液筛查中的意义。方法采用融合F4HVR1抗原检测不同血清样本中的抗-HVR1的存在情况,并与现有C、NS3、NS4、NS5抗体进行比较。结果在HCV-RNA阳性样本中,HVR1抗体的阳性率为96.8%;在90份可疑HCV感染血清中HVR1抗体的阳性率为61.1%,与C区、NS3区接近,高于NS4区、NS5区(P<0.05),共检测出4份单独HVR1抗体阳性血清。结论在现有HCV诊断试剂基础上,对献血人群进行HCV-HVR1抗体的检测可以提高血液筛查灵敏度,减少HCV的经血传播。

丙型肝炎病毒RNA高变区准种复杂性与干扰素疗效关系的初步探讨

目的探讨丙型肝炎病毒高变区1(HCV HVR1)准种复杂性与干扰素疗效的关系,为临床选择应用干扰素抗病毒治疗的适应症及预测疗效提供理论依据。方法采用基因芯片法进行HCV基因分型;采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(SSCP)进行HVR1准种复杂性检测。结果治疗前HCV HVR1准种的SSCP条带数(复杂性)≤3者,经干扰素治疗后,HCV RNA阴转率为77.78%,>3者HCV RNA阴转率为21.43%,两者差异具有统计学意义(P<0.01);治疗有效组SSCP条带数为2.44±0.73,无效组为4.50±0.65,两者差异具有统计学意义(P<0.01)结论感染HCV基因型lb型的慢性丙型肝炎患者HVR1准种复杂性程度越高,对干扰素无应答的可能性越大,是预测干扰素疗效的一个重要因素。

慢性丙型肝炎患者HCV HVR1准种异质性与干扰素疗效关系的研究

目的:研究HCVHVR1准种异质性与干扰素疗效以及与HCVRNA载量之间的关系,为临床选择应用干扰素抗病毒治疗适应症及预测疗效提供理论依据。方法:采用核苷酸序列测定法进行HCV基因分型;分别采用单链构象多态性聚合酶链反应法(SSCP)及克隆测序法进行HVR1准种异质性检测;采用荧光特异性PCR法进行HCVRNA载量检测。结果:14例1b型慢性丙肝患者干扰素治疗前5例为SSCP低复杂性(SSCP条带数≤3),9例为高复杂性(SSCP条带数>3),干扰素治疗应答组SSCP条带数明显少于无应答组。1b型患者中无应答组HVR1变异株的数目(准种数)和基因的差异性(每个基因位点的平均变异率)均明显高于应答组。HVR1准种异质性程度与HCVRNA含量无正相关关系。结论:感染HCV基因型1b型的慢性丙型肝炎患者HVR1准种异质性程度越高对干扰素无应答的可能性越大。HVR1准种的复杂性程度与HCVRNA含量无关,是预测干扰素疗效的一个独立因素。

慢性丙型肝炎自然病程中丙型肝炎病毒准种演化及其临床意义

目的探究慢性丙型肝炎患者在自然病程中HCV准种变异、组成变化及其与病程的关系。方法对未接受特异性抗病毒治疗的11名慢性丙型肝炎患者进行病程跟踪、血样采集、HCV病毒载量及主要肝功生化指标检测,并对HCV HVR1区进行基因扩增、克隆和测序,所获得序列用于HCV准种变异、组成变化其病程的相关性分析。结果通过631克隆的序列测定与分析,发现在慢性丙型肝炎自然病程中,HVR1的准种存在3种变化模式:稳定型、快变型和慢变型。感染者体内准种的平均遗传距离、有意突变率均与主要肝功生化指标存在显著的负相关性,而与病毒载量不存在相关性。结论因个体差异、免疫选择压力不同等原因,在慢性感染者体内HCV准种演化,随着病程进展,呈现不同的变化模式。鉴于准种平均遗传距离、有意突变率与肝功生化指标之间的相关性,准种的演化可作为评价病情和病程预后的参考指标。

B族Ⅰ型清道夫受体在丙型肝炎病毒入侵细胞中的作用

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)入侵宿主细胞是由多种受体分子介导的多步骤过程,其中B族Ⅰ型清道夫受体(SR-BⅠ/SCARB1)被认为是最先与HCV作用的受体。SR-BⅠ能够与HCV包膜糖蛋白E2相结合,在此过程中位于E2蛋白氨基末端的高变区1(hypervariable region 1,HVR1)起关键作用。SR-BⅠ与HCV的相互作用不仅能够介导HCV的细胞入侵,还能降低抗体对HCV的中和作用,有助于HCV的免疫逃避。因此,深入研究SR-BⅠ在HCV入侵细胞过程中的作用机制,有望发现在HCV感染的初始环节能够高效地阻断HCV入侵细胞的靶分子,从而预防和治疗HCV的感染。本文就SR-BⅠ的生物学特性、SR-BⅠ与HCV的相互作用对病毒入侵细胞的影响及机制等方面的最新进展作一综述。

丙氨酸氨基转移酶不合格献血者中不同区段丙型肝炎病毒抗体的筛查

目的探讨丙氨酸氨基转移酶(ALT)不合格献血者丙型肝炎病毒不同功能区抗体的检出情况。方法收集献血前乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和ALT筛查中ALT不合格的血清样本,采用融合F4HVR1抗原检测样本中的第1高变区(HVR1)抗体,并与现有的C、NS3、NS4、NS5区抗体进行比较。结果在2035份ALT不合格样本中,共检测出34份阳性样本,其中HVR1区单独阳性2份,C区3份,NS3区4份,NS5区1份。结论丙型肝炎病毒各区段抗体筛查对提高输血安全性具有积极的作用。

丙型肝炎

HCV高变区1串联模拟表位基因免疫研究，慢性丙型肝炎患者自身抗体检测及意义(附82例慢性丙型肝炎病例分析)，白细胞介素-10启动区基因多态性与慢性丙型肝炎的相关性。

丙型肝炎病毒受体SR-BⅠ的研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)是经血液传播而引起急、慢性肝炎的主要致病因子之一,是导致肝硬化、肝细胞癌等终末期肝病的主要原因。位于HCV包膜E2蛋白N端的第1高变区(HVR1),是介导E2蛋白与B族Ⅰ型清道夫受体(SR-BⅠ)结合及HCV感染细胞的关键肽段。研究表明,HCV可能利用了SR-BⅠ受体的某些生理功能入侵细胞,进行细胞-细胞间传播。因此,HVR1与SR-BⅠ相互作用的研究除了能深入了解HCV吸附和入侵细胞机制,同时也为治疗和预防HCV感染提供了新的靶点。

丙型肝炎病毒E2蛋白DNA疫苗诱导小鼠产生中和抗体的研究

目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)包膜E2蛋白DNA疫苗诱导小鼠产生中和抗体的可行性。方法构建截除疏水性羧基末端的HCV包膜蛋白表达质粒pCI-1b661以及同时截除疏水性羧基末端和高变区1(HVR1)的表达质粒pCI-1b661Δ,转染293T细胞,以Western blot和ELISA检测细胞内和培养上清中的HCVE2蛋白,将两种表达质粒及空载体分别肌注免疫BALB/c小鼠,以ELISA检测小鼠血清中的HVR1抗体,以HCV假病毒颗粒(HCVpp)分析小鼠血清的中和活性。结果 2种表达质粒均能表达分泌性截短型E2蛋白。pCI-1b661免疫的8只小鼠血清中均可检测到HVR1抗体,而pCI-1b661Δ免疫血清中未检测到HVR1抗体。pCI-1b661和pCI-1b661Δ免疫血清对HCVpp的中和率分别为(78.5±13.8)%和(38.7±6.5)%,差异有显著性(P<0.01)。pCI-1b661免疫组小鼠血清的中和率与HVR1抗体水平呈正相关(r=0.967,P<0.01)。结论表达截短型E2蛋白的DNA疫苗能诱导产生HCV中和抗体,其主要成员为HVR1抗体。