重组人血清白蛋白在汉逊酵母中的高密度发酵表达

考察了不同甲醇流加策略对重组汉逊酵母(Hansenula polymorpha)高密度发酵表达重组人血清白蛋白的影响.溶氧控制法不能有效地防止甲醇的过量流加,气相色谱离线检测法虽然控制了甲醇流加过量,但甲醇浓度的波动较大,利用甲醇传感器在线检测控制甲醇的流加可维持较恒定的甲醇浓度.在重组汉逊酵母表达人血清白蛋白的诱导阶段,采用甘油-甲醇混合补料的培养方式,限制性速率流加甘油以增加表达期间的能量供应,以溶氧水平作为甘油代谢指针来控制甘油限制性流加既维持菌体生长,又不会因发酵液中残余甘油及有害代谢产物阻遏蛋白表达.经甲醇甘油混合流加优化后,表达阶段细胞平均比生长速率控制于0.012 h^(-1)时,细胞干重达到150g/L,重组人血清白蛋白表达量达3.5g/L.

共表达透明颤菌血红蛋白对毕赤酵母产β-甘露聚糖酶发酵过程的影响

为了改善高密度发酵生产β-甘露聚糖酶过程中的溶氧限制,提高β-甘露聚糖酶产量,将VHb和β-甘露聚糖酶基因置于AOX1启动子调控之下,进行VHb和β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的共表达。经密码子优化合成VHb基因,插入表达载体p PICZαA,整合到β-甘露聚糖酶工程菌中,通过G418和Zeocin抗性筛选共表达VHb基因的重组酵母工程菌。在30 L发酵罐水平上分析共表达VHb菌株(VHb+)与初始菌株(VHb-)对β-甘露聚糖酶表达的差异。结果显示,限氧条件下,VHb+菌株的β-甘露聚糖酶的表达量比对照菌株VH b-高90%,且透明颤菌血红蛋白提高了甲醇耐受性,缩短发酵周期约40 h。

共表达伴侣蛋白对毕赤酵母产β-甘露聚糖酶发酵过程的影响

通过分别共表达伴侣蛋白PDI和Bip获得β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达。根据Gen Bank公布的毕赤酵母PDI和Bip序列设计引物,以酵母基因组为模板PCR扩增目的基因片段,插入表达载体p PICZαA,分别整合到β-甘露聚糖酶工程菌中,筛选共表达二硫键异构酶的重组酵母(PM115)和共表达免疫球重链结合蛋白的重组酵母(BM115),在30 L发酵罐水平上分析两种共表达伴侣蛋白菌株与初始菌株(GM115)对β-甘露聚糖酶表达的差异。相同工艺下,PM115与原始菌株相比未有提高,而BM115发酵产酶能力高于原始菌株,最高酶活达到40 900 U/m L,最高总蛋白表达量13.22 g/L,最高比酶活达到3 150 U/mg,分别比初始菌株提高38%,22%和18%。毕赤酵母基因工程菌GM115通过共表达伴侣蛋白Bip,提高了β-甘露聚糖酶的产量和比活力,达到工业化生产水平。