高密度蛋白微阵列芯片技术及其在疾病研究中的应用

许多具有高通量特点的蛋白质组学分析技术成为大规模研究蛋白分子间相互作用,快速高效地揭示机体许多生命活动现象的必备手段,并在近几年得到迅猛发展,高密度蛋白微阵列芯片(Protein microarrays chip)技术就是其中之一。大规模同时检测分析一个物种的蛋白,以及对这些蛋白进行亚细胞定位和相关功能的分析,同时提供不同蛋白间的相互作用是高密度蛋白微阵列芯片的用途之一。

一种高密度寡核苷酸微阵列芯片的制备技术

21世纪,生命科学将成为整个科学领域带动性学科,生物技术将成为人类解决食物、能源、环境等重大经济和社会问题的关键技术,生物产业仍以医药生物技术产业化为“龙头”,农业生物技术为核心,环境与海洋生物技术为两翼,成为世人关注的焦点。本期栏目刊发此类文章,目的在于:一方面向广大读者介绍未来生物技术领域一些基本常识;另一方面,希望加快中国家禽业生物技术的研究与应用。

微流控芯片电泳分离血清高密度脂蛋白亚类的研究

描述了一种微流控芯片电泳快速分离血清高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)亚类的方法.利用自制的微流控芯片,结合激光诱导荧光检测系统,40mmol/L Tricine、50mmol/L甲基葡胺(MEG)、0.2mmol/LSDS(pH8.5)为样品缓冲液,40mmol/L Tricine、50mmol/LMEG、0.01mmol/L SDS(pH8.5)为分离缓冲液,4min内HDL3和HDL2两种亚类得到基线分离.该法操作过程简单,重复性较佳,测试费用低廉,在临床HDL亚类的检测中具有较好的应用前景.

聚二甲基硅氧烷(PDMS)/玻璃微流控芯片电泳快速分离血清高密度脂蛋白亚类及临床应用研究

经梯度密度超速离心,高密度脂蛋白(HDL)分为HDL2和HDL3两亚型。HDL2抑制低密度脂蛋白(LDL)氧化功能受损是冠心病(CHD)发生发展的关键因素。因此,通过对HDL亚类进行分离,从而达到预测和诊断CHD的目的。本研究建立了用PDMS/玻璃微流控芯片快速电泳分离HDL亚类的方法。选择N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)、十二烷基硫酸钠(SDS)和羟丙基纤维素(HPC)共同修饰脂蛋白和泳道表面。在以含0.3 mmol/L SDS的50 mmol/L 3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)(pH 8.0)为样品缓冲液,含0.6%HPC的50 mmol/L MOPS(pH 8.0)为分离缓冲液,分离电压为260 V/cm的优化条件下,HDL2和HDL3在4 min内得到基线分离,二者的出峰时间和峰面积的相对标准差(RSD)分别是2.0%和2.7%,2.0%和2.9%,具有较好的重复性。临床标本研究发现,正常人血清标本可分离出HDL2和HDL3双峰,而CHD患者的HDL2峰面积显著减小,甚至消失。PDMS/玻璃微流控芯片分离HDL亚类是一种简单、快速、高效的用于分析CHD危险因子的方法。

高密度噬菌体抗体芯片对细胞表面蛋白的识别

采用正常人和白血病患者的白细胞对人源噬菌体抗体库进行淘选,以获得对两种细胞表面蛋白特异的抗体.通过pVIII展示系统,使抗体以多价展示于重组噬菌体颗粒表面,从上述两组中各挑选出48个克隆分别固定于环氧基片上,并以空白噬菌体和牛血清白蛋白作为对照,制成高密度噬菌体抗体芯片.取来自3名正常人和3名白血病患者的白细胞裂解物样品,用荧光染料Cy3标记,与噬菌体抗体芯片反应,对微阵共聚焦扫描得到的荧光图谱进行分析.在白血病白细胞表面蛋白的识别图谱中有8组斑点显著不同于正常图谱.由此表明,噬菌体抗体芯片可用于识别细胞表面蛋白.

荧光纳米粒子Ru(bpy)_3/SiO_2的制备及其应用于蛋白质微阵列芯片检测HIV p24抗原

以三联吡啶钌(Ru(bpy)3)为内核材料,通过反相微乳液法合成了表面带氨基的核壳结构荧光纳米粒子Ru(bpy)3/SiO2,利用透射电子显微镜、荧光光谱、紫外-可见光谱等手段进行表征,并进行了光稳定性、荧光分子泄露与纳米粒子表面氨基测定等实验,结果表明:所合成的纳米粒子表面带氨基活性基团,每毫克纳米粒子约含385nmol氨基,纳米粒子呈规则球形,大小均一,单分散性好,平均粒径为(70±6)nm,具有很好的光稳定性。用100W氙灯在最大发射波长照射90min后,其荧光强度仅衰减8%;在水溶液中不易发生染料泄露,连续超声1h后,染料泄露少于0.05%。以合成的纳米粒子作荧光探针标记链霉亲和素后应用于蛋白质微阵列芯片检测HIV p24抗原。结果显示,荧光强度与p24浓度呈良好的正相关性,检出限为3.1μg/L。本纳米粒子作为新型荧光探针,可应用于高灵敏检测的蛋白质微阵列芯片及荧光免疫分析等系统。

高密度脂蛋白亚类的检测方法

高密度脂蛋白（highdensitylipoprotein，HDL）是一种由脂质和蛋白构成的在形状、密度、颗粒大小、电荷和理化特性等方面具有较大异质性的一类脂蛋白。HDL具有抗动脉粥样硬化（atherosclerosis，As）作用已无争议。2002年美国胆固醇教育计划成人治疗组第3次指南指出，HDL胆固醇（HDL-C）小于40mg／dl时为异常，是冠心病（coronaryheartdisease，CHD）的重要危险因素之一。

蛋白质微阵列芯片在临床分析中的应用

蛋白质微阵列芯片能够高通量监测生物毒素、分析宿主-微生物相互作用和抗原-抗体相互作用、筛选疾病生物标志物,因此有望成为体外诊断的主要技术之一并在病原体感染、自身免疫性疾病、神经退行性疾病和癌症等疾病的精准医疗中发挥重要作用。本文通过对最近发表的相关研究成果分析,总结了蛋白质微阵列芯片在临床分析中新进展,分析了其在实际应用中所面临的技术挑战并探讨了相应的解决方案。

蛋白质微阵列芯片技术及其在抗体筛选中的应用

微阵列是一种可用于生物学研究的大规模、高通量的重要分析技术.近年来,蛋白质微阵列技术已经在蛋白质组的功能研究、疾病诊断以及药物开发中显示出巨大的潜力[1,2],例如可用于抗原-抗体、蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸、蛋白质-脂质、蛋白质-小分子以及酶-底物等之间相互作用的分析等.影响蛋白质微阵列分析性能的主要因素包括蛋白质分子识别的特异性、蛋白质的固定化技术以及检测方法等.……

可视化微阵列蛋白芯片法同时检测蜂蜜中3种农药残留

目的建立可视化微阵列蛋白芯片法同时检测蜂蜜中多菌灵、啶虫脒、蝇毒磷3种农药残留含量的分析方法。方法依次向制备好的微孔板芯片里加入50μL标准品工作液和50μL相应的抗体,在25℃、600 r/min下反应30 min;再向每孔中加入50μL纳米银标记的羊抗鼠IgG, 37℃、600 r/min下反应30 min;最后显色并用芯片专用软件(MiELISA)进行自动化分析。结果该方法对多菌灵、啶虫脒、蝇毒磷的定量检测范围分别为0.4~6.4、0.3~4.8、0.75~12 ng/mL,相关系数r>0.99,检测限分别为3.21、2.47、2.52 ng/mL,准确度为83.6%~126.4%,变异系数均<10%,且三者之间具有极低的交叉反应;向不同种类的空白蜂蜜中添加2种不同浓度的标准品时,检测结果具有较高的准确度和重复性。结论本研究建立的可视化微阵列蛋白芯片检测法操作简便,检测限低,准确度、重复性、特异性均很好,且具有高通量、多指标同时检测等优点,适用于蜂蜜中多菌灵、啶虫脒、蝇毒磷3种农药残留同时检测。

糖与蛋白质相互作用的微阵列芯片研究

糖类（Carbohydrates）与相应蛋白质（如，凝集素lectins等）之间的相互作用广泛存在于各种生物进程中，如细胞间的信息传递，细胞增殖和差异化以及肿瘤细胞的转移，免疫响应等。以糖类为媒介的细胞与细胞间的识别作用是生物分子识别的重要组成，并对不同组织细胞功能分化和有序发展起重要作用。此外，糖缀合物还与许多疾病，如癌症、细菌和病毒感染等有着密切的关系。

抗可提取性核抗原抗体蛋白质微阵列芯片的临界参考值研究

目的建立自身抗体蛋白质微阵列芯片化学发光法的临界参考值研究方法。方法利用阳性对照品和"临界值公司一级参考品"的信号比值确定各自身抗体指标的"临界值系数",利用每次实验中阳性对照品的信号值与"临界值系数"确定各自身抗体指标的临界参考值(cut-off),并对实验结果作判定。结果利用此方法确定的抗可提取性核抗原(ENA)抗体蛋白质微阵列芯片的临界参考值,使产品中各指标的检测特异度均达到98.75%以上,产品在混合性结缔组织病、系统性红斑狼疮、干燥综合征、进行性系统硬化症、多肌炎/皮肌炎病例样本中阳性检出率分别达到了100%、100%、95.56%、100%、100%和100%。结论本研究建立的自身抗体蛋白质微阵列芯片化学发光法临界参考值确定方法是科学合理的,有效地消除了实验过程中人为因素,判定结果具有可靠性、可重复性。

高密度脂蛋白亚组分分布异常与2型糖尿病早期肾损害的关系初步研究

目的首次探讨2型糖尿病肾病不同分期高密度脂蛋白亚组分HDL-2b、 HDL-3分布异常,分析高密度脂蛋白亚组分与2型糖尿病早期肾损害之间的关系。方法对社区流行病学调查中筛查出来的2型糖尿病肾病及其他疾病和对照组人群进行系统体检、超声放射检查及血、尿分析,同时应用本团队前期建立的具有国际专利的微流控芯片技术检测分析高密度脂蛋白亚组分分布,并测量体表标志BAI并检测空腹胰岛素、 C肽、糖尿病5种自身抗体、尿微量白蛋白定量及微量白蛋白/肌酐比值,进行糖尿病肾病(DN)分期,采用多独立样本参数分析比较糖尿病肾病不同分期高密度脂蛋白亚组分HDL-2b和HDL-3的分布差异。结果与正常社区人群相比,2型糖尿病肾病患者存在高密度脂蛋白亚组分HDL-2b、 HDL-3分布异常,其中HDL-2b分布异常分别与甘油三酯和空腹胰岛素呈负相关,而与高密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白A/载脂蛋白B呈正相关,差异均具有显著意义(P <0.05或P <0.01);而HDL-3分布异常分别与尿微量白蛋白、甘油三酯和空腹胰岛素呈正相关,与高密度脂蛋白胆固醇呈负相关,差异均具有(P <0.05或P <0.01)。与正常人群相比,原发性高血压、原发性高尿酸血症前述高密度脂蛋白亚组分分布无显著改变(P>0.05)。结论本研究在国内外首次应用微流控芯片技术检测分析社区人群高密度脂蛋白亚组分分布,发现2型糖尿病肾病患者早在微量白蛋白出现之前即存在高密度脂蛋白亚组分分布异常,并且高密度脂蛋白亚组分不同分布与微量白蛋白尿具有相关性,提示后者在2型糖尿病肾损害发生发展机制中可能发挥作用,需要进一步研究得以证实。

人类S-亚硝基化蛋白组微阵列芯片检测研究进展

NO通过对蛋白质的S-亚硝基化修饰广泛参与细胞生理活动的调节,然而S-亚硝基化底物尚不完全清楚。来自约翰霍普金斯医学院细胞工程院的研究团队近期利用自发研制的人类高密度蛋白微阵列芯片对16,368种人类蛋白进行了亚硝基化检测,并确定了834种潜在可被亚硝基化修饰的蛋白质,其中95种蛋白质中131条肽链上的138个半胱氨酸残基被证实为亚硝基化位点。传统对亚硝基化位点的研究存在物种偏差以及检测靶点数量的局限,而本研究应用的人类蛋白组芯片在很大程度上克服了以上缺陷。

基于免疫金银染色的蛋白质与抗原分子微阵列技术

目的 研制适于自身抗体检测的蛋白质与抗原分子微阵列。方法 利用氧化型琼脂糖凝胶膜结合戊二醛分子衍生的活性表面 ,制作蛋白质与抗原分子微阵列 ,建立了检测血清自身抗体的胶体金免疫金银染色方法 (IGSS)。结果 在未经选择的风湿病患者中 (包括SLE ,RA和MCTD) ,检出多种自身抗体阳性 ,其中又以子宫内膜抗体 (EmAb)、抗ssDNA抗体、抗TG抗体、抗TPO抗体和RF等的检出频率较高 ;但心磷脂抗体 (ACA)、抗LSP和抗精子抗体 (AsAb)均为阴性。经初步方法学对比考证 ,实验结果与ELISA有较好的一致性 (达 90 % )。结论 本法具有方法敏感 ,结果直观和实验条件易于控制等特点 ,为发展可视化阵列芯片提供了一种很好的模式。

应用微阵列技术筛选HBV前-S1蛋白的反式调节基因谱

目的 阐明前 S1蛋白的表达对乙型肝炎病毒 (HBV)感染肝细胞基因表达谱的影响。方法 以含有HBV全基因组的质粒G376 7(GenBank号 :AF384 371)作为模板 ,应用PCR扩增前 S1蛋白编码基因片段 ,以常规的分子生物学技术构建表达载体 pcDNA3 1(- ) preS1,以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2 ,提取总mRNA ,逆转录为cDNA ,与转染空白表达载体pcDNA3 1(- )的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较。结果 在 115 2个基因表达谱的筛选中 ,发现有 30个基因表达水平显著上调 ,38个基因表达水平显著下调。结论 前 S1基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响。DNA芯片技术是分析反式调节靶基因的有效技术途径。

蛋白质微阵列检测抗原抗体相互作用

为了制备蛋白质微阵列和研究芯片表面抗原 抗体的相互作用 ,研究了如何在玻片表面固化蛋白质和用荧光染料 (Cy3,Cy5 )对蛋白质进行标记 .结果表明 ,在醛基修饰的玻璃表面 ,通过共价偶联的方法将抗原或抗体固定到芯片表面 ,能使二者保持其特异性结合能力 .同时 ,荧光标记后的抗原或抗体仍然具有特异性结合能力 .蛋白质微阵列是通过机械手在玻片表面排阵制作的 .芯片上的荧光信号获取采用了激光共焦荧光扫描系统 .用不同浓度的抗原探针阵列 ,对其相应的抗体靶分子的特异性结合进行了分析和研究 .此外 ,还通过在玻片表面固定兔IgG和固定鼠IgG ,对羊抗兔和羊抗鼠抗体与其相应抗原的特异性相互作用进行了检测 .

微阵列芯片技术的应用进展

自90年代中期基因芯片问世以来．先后出现了多种以微阵列技术为核心的生物芯片，如蛋白质芯片、组织芯片和细胞芯片等。这些芯片的技术日趋成熟，且多已商品化。随着人类基因组工程的完成，人们逐渐将目光更多地投向基因功能、表达调控和表达后机制与疾病关系的研究。但对于大量功能未知的基因，原有的实验室技术效率低下，显得有些力不从心。而生物芯片技术作为一项新兴技术，为研究基因的表达、调控和功能提供了一个全新的平台。本文对近年来几种生物芯片技术在医学领域应用的进展作一介绍。