高山被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因转化大豆的研究

采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功地将高山被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因导入到栽培大豆吉林 4 3和黑农37品种中。经农杆菌浸染和共培养后 ,在含 5 0mg/L卡那霉素的选择培养基上连续筛选 ,获得一批转基因植株。经PCR检测和Southern杂交分析 ,证明外源基因已导入并整合到大豆的基因组中。通过GC -MS对大豆种子进行脂肪酸色谱分析 ,结果表明 ,产生了γ -亚麻酸 ,其含量最高可达 18.2 3%。

转基因烟草表达高山被孢霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因的研究

将高山被孢霉ATCC16 2 6 6Δ6 脂肪酸脱氢酶 (D6D)基因亚克隆到植物表达载体pBI12 1中 ,构建了CaMV35S启动子驱动的植物表达载体pBMACL6。经根癌农杆菌LBA4 4 0 4的介导 ,采用叶盘法转化烟草Xanthi,得到一批转基因烟草植株。转基因植株的PCR和Southernblot分析表明 ,D6D基因已经整合到烟草基因组中。脂肪酸GC分析表明 ,与未转基因的烟草苗对照相比 ,转基因植株有D6D基因目标产物γ 亚麻酸的产生 ,说明高山被孢霉的D6D基因在烟草中得到了表达。

高山被孢霉Δ^6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的胞内表达

γ 亚麻酸 (GLA)作为人体必需的不饱和脂肪酸 ,具有重要的营养和药用价值。Δ6 脂肪酸脱氢酶是γ 亚麻酸合成途径中的关键酶。为了在毕赤酵母中建立一种新的合成γ 亚麻酸的表达体系 ,将高山被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因与胞内表达载体pPIC3 5K连接 ,SacⅠ线性化后电击法转化毕赤酵母SMD116 8,获得的转化子经PCR鉴定目的基因已整合到毕赤酵母的基因组中。用甲醇诱导表达 ,通过脂肪酸气相色谱和气相色谱 质谱 (GC MS)联用分析表明高山被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中获得表达 ,γ 亚麻酸含量占总脂肪酸的 16 2 6 %。

高山被孢霉Δ^6-脂肪酸脱氢酶基因在红冬孢酵母中的表达

以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)作为报告基因,将质粒pRH2304转化红冬孢酵母YM25235进行表达分析,荧光显微观察结果表明GFP在YM25235获得表达,建立了红冬孢酵母YM25235遗传转化方法。在此基础上,以高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因取代pRH2304中的GFP基因,构建重组质粒pRH2304MAD6,将其转化红冬孢酵母YM25235进行表达分析。PCR结果表明,高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因已经整合到YM25235基因组中,进一步的脂肪酸气相色谱分析结果表明,该基因编码产物催化n-6途径中的亚油酸转化成γ-亚麻酸,占细胞总脂肪酸的4.35%,但没有检测到催化n-3途径中的α-亚麻酸转化成十八碳四烯酸。

高山被孢霉ATCC16266Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达

Δ6 脂肪酸脱氢酶是形成γ 亚麻酸的关键酶。从含有高山被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pT MACL6中 ,酶切出 1 4kb的目的片段 ,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体 pYES2 .0 ,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒 pYMAD6 ,用醋酸锂方法转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INCSc1中 ,在SC Ura合成培养基中 ,选择得到酿酒酵母工程株YMAD6。在合适的培养基及培养条件下 ,加入外源底物亚油酸 ,经半乳糖诱导后 ,收集菌体。通过GC MS对酵母工程株进行脂肪酸色谱分析 ,结果表明 ,产生了 31 6 %的γ 亚麻酸。这是迄今为止 ,国内外Δ6 脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中表达量最高的报道。

高山被孢霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆、结构分析及其功能的研究

从高山被孢霉ATCC1 62 66总DNA中扩增出大小为 1 374bp和 1 947bp的两条特异片段 ,序列分析表明后者在细胞色素b5和组氨酸Ⅰ之间含有一大小为 5 73bp的内含子和两条分别为 1 97bp和 82 8bp的外显子。推导的氨基酸二级结构分析表明 ,该基因有两个长的跨膜疏水区和 3个组氨酸保守区。分别根据D6D内含子及组氨酸Ⅱ区、Ⅲ区的序列设计引物 ,制备不同的探针与高山被孢霉的基因组杂交 ,证明在其基因组中确实存在两个Δ6 脂肪酸脱氢酶基因 ,其中一个基因含有内含子。把不含有内含子的核基因MAGL6 1克隆到的酿酒酵母表达载体pYES2 0中 ,转化到酿酒酵母INVSc1中。对筛选得到的酵母工程菌株进行脂肪酸GC分析 ,检测到了γ 亚麻酸 ,说明克隆的D6D基因MAGL6 1能在酿酒酵母中进行功能性表达。

高山被孢霉△~6-脂肪酸脱氢酶基因在大豆中的表达

将从高山被孢霉中克隆的△6-脂肪酸脱氢酶基因与植物表达载体pBI121连接,构建了重组质粒pBMICL6,采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功地将该基因导入到栽培大豆吉林35、吉林43、吉林47、绥农10、绥农14和黑农37等品种中,获得了一批转基因植株。经PCR检测和Southern杂交分析,证明外源基因已导入并整合到大豆的基因组中。Northern杂交结果表明,该基因在转基因大豆的mRNA水平上获得表达。通过气相色谱(GC-MS)对大豆种子进行脂肪酸成分分析,发现转基因大豆产生了γ-亚麻酸,其含量最高可达25.165％。

根癌农杆菌介导深黄被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因转化大豆及其转基因植株再生

采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功的将深黄被孢霉△6 脂肪酸脱氢酶基因导入大豆。从发芽 5～ 7d的大豆无菌苗切取子叶节外植体 ,经农杆菌浸染和共培养后 ,在含 50mg L卡那霉素的选择培养基上培养 2～ 4周后 ,从子叶节处诱导出抗性不定芽。将不定芽转移到伸长培养基上 ,4～ 6周后长至 2～ 3cm高的再生苗。再将再生苗切下转入生根培养基 ,2～ 6周生根。生根后的再生植株经逐步锻炼移入花盆中 ,部分移栽成活的T0 植株能正常开花结荚。从T0 植株上收获T1种子 ,按株系种植。T0 和T1代经PCR检测和DNA分子杂交分析 。

深黄被孢霉M_(6-22) Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达

应用PCR技术 ,从含有深黄被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pTMICL6中 ,扩增出 1 38kb的目的片段 ,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2 .0 ,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYMID6,用醋酸锂方法转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVSc1中 ,在SC Ura合成培养基中 ,选择到酵母工程株YMID6。在合适的培养基及培养条件下 ,加入外源底物亚油酸 ,经半乳糖诱导后 ,收集菌体。通过GC MS对酵母工程株所含的全部脂肪酸进行色谱分析 ,结果表明 ,γ 亚麻酸的含量占酵母总脂肪酸的 8 69%。

深黄被孢霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在大豆中的表达

为在传统的油料作物大豆中产生γ 亚麻酸 ,从深黄被孢霉中克隆的Δ6 脂肪酸脱氢酶基因与植物表达载体pBI12 1连接 ,构建了重组质粒pBMICL6 ,采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功的将该基因导入到栽培大豆吉林 35、吉林 4 3、吉林 4 7、绥农 10、绥农 14和黑农 37等品种中 ,获得一批转基因植株。经PCR检测和Southern杂交分析 ,证明外源基因已导入并整合到大豆的基因组中。Northern杂交结果表明该基因在转基因大豆的mRNA水平上获得表达。对转基因大豆种子进行脂肪酸成分分析 ,结果表明Δ6 脂肪酸脱氢酶基因获得表达 ,产生了γ 亚麻酸 ,其含量最高可达 2 7 0 6 7% ,这是国内外深黄被孢霉Δ6

深黄被孢霉△~6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

γ－亚麻酸（ＧＬＡ，Ｃ１８：３△６，９，１２）是由△６－脂肪酸脱氢酶以亚油酸（ＬＡ，Ｃ１８：２△９，１２）为底物，在Ｃ６位脱氢形成的。由于在人体中，γ－亚麻酸是花生四烯酸、前列腺素类和白三烯类等生理活性物质的前体物，而深黄被孢霉是目前用于微生物发酵生产γ－亚麻酸的主要菌株。本文根据脂肪酸脱氢酶的保守区设计引物，利用反转录聚合酶链式反应从丝状真菌深黄被孢霉中克隆了编码△６－脂肪酸脱氢酶的ｃＤＮＡ，全长为１３７４个核苷酸，编码４５７ 个氨基酸，但与其他位点的脂肪酸脱氢酶不同的是， △６－脂肪酸脱氢酶在其序列的 Ｎ 端特有细胞色素 ｂ５（Ｃｙｔｂ５）区。这是国际上对深黄被孢霉△６－脂肪酸脱氢酶基因的首次报道。

向大豆导入深黄被孢霉△^6—脂肪酸脱氢酶基因的初步研究

通过农杆菌介导法 ,将深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因导入到栽培大豆吉育 4 3、黑农36、黑农 37等品种。采用多种外植体和感染方法 ,从子叶节和胚轴诱导出丛生芽与再生植株。经过在含 5 0mg L卡那霉素的筛选培养基中连续筛选 ,获得一批转基因植株。经PCR检测和DNA分子杂交分析 ,初步证明外源基因已导入并整合到大豆基因组中。

深黄被孢霉△~6-脂肪酸脱氢酶基因导入大豆

采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功地将深黄被孢霉△6 -脂肪酸脱氢酶基因导入大豆。从发芽 5 - 7d的大豆无菌苗切取子叶节外植体 ,经农杆菌浸染和共培养后 ,在含 5 0mg L卡那霉素的选择培养基上培养 2 - 4w后 ,从子叶节处诱导出抗性不定芽。将不定芽转移到伸长培养基上 ,4 - 6w后长至 2 - 3cm高的再生苗。再将再生苗切下转入生根培养基 ,2 - 6w生根。生根后的再生植株经逐步锻炼移入花盆中 ,部分移栽成活的T0 植株能正常开花结荚。从T0 植株上收获T1 种子 ,按株系种植。T0 和T1 代经PCR检测和DNA分子杂交分析 。

农杆菌介导法将深黄被孢霉△~6-脂肪酸脱氢酶基因(D6D)导入油菜的研究

△6-脂肪酸脱氢酶基因可将亚油酸转化为γ-亚麻酸。我们将克隆的深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因(D6D)插入植物表达载体pBI121,构建了重组质粒pBI121-D6DMI。通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导途径,将深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因导入了甘蓝型油菜恢复系,经过诱导分化获得抗卡那霉素的再生植株。PCR检测及Souther杂交结果表明,外源基因△6-脂肪酸脱氢酶基因已整合到油菜再生植株的基因组中。

深黄被孢霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因敲除及鉴定

以产油丝状真菌深黄被孢霉M6—22（Mortierella isabellina 6-22）为出发菌株，利用亚硝基胍诱变技术筛选到一株对潮霉素药物敏感的菌株Mortierella isabellina 6-22—4，同时构建了含有潮霉素抗性基因表达单元和深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因5’与3’端部分同源序列的重组质粒PD4M16，用于对深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的敲除.通过PEG／CaCl2介导的原生质体转化法，将质粒PD4M16转化入深黄被孢霉M6—22—4菌株．转化子经潮霉素抗性选择平板筛选、分子检测获得了一个△^6-脂肪酸脱氢酶基因缺失的突变株Mut6．气相色谱分析结果显示，该突变株γ-亚麻酸特征峰消失，相应地亚油酸产量显著增加．培养结果表明该突变株的菌落形态、颜色及生长状况与出发菌株M6—22或M6—22—4相比均有显著改变。

深黄被孢霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤氏酵母SMD1168中表达的研究

引物根据△6-脂肪酸脱氢酶（D6D）基因以及酵母蛋白表达载体pGAPZctA的多克隆位点进行引物设计，并在上游插入ECoRI位点、下游插入XhoI位点，从深黄被孢霉中克隆D6D基因，构建pMD18-T-D6D载体与pGAPZtxA—D6D载体。将重组质粒线性化，并将其电转导入到毕赤氏酵母（PichiapastorisSMD1168）中，Zeocin抗生素筛选高拷贝转化子，对重组菌进行诱导表达。经过Tricine—SDS—PAGE分析和蛋白质免疫印迹（Westernbloting）试验，证明△6-脂肪酸脱氢酶融合蛋白具有免疫学活性。结果成功构建了重组酵母pGAPZdA—SMD1168，为利用基因工程菌生产y-亚麻酸（GLA）奠定理论基础。

少根根霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因油菜中的表达

【目的】验证少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因油菜中的表达情况,为进一步基因工程化生产γ-亚麻酸打下基础。【方法】将少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因和植物表达载体pCPN2301连接,构建重组表达质粒pCPNRAD6,采用农杆菌介导的油菜子叶节转化法,将该基因导入甘蓝型油菜H165,获得转基因植株,最后通过气相色谱检测基因的表达情况。【结果】PCR、GUS组织化学染色和Southern杂交分析结果表明,目的基因已经整合到油菜基因组中,Northern杂交分析进一步表明目的基因在RNA水平获得表达,气相色谱分析检测到转基因油菜叶片中γ-亚麻酸和十八碳四烯酸生成,证明目的基因获得功能表达。同样,用改变少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的转译起始密码子周边序列的基因RAD6-1所构建的转基因酵母中,也得到类似的结果,而且各种目的脂肪酸的含量均有提高。【结论】初步建立了少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因油菜中的表达体系。

少根根霉Δ_-~6脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达(英文)

Δ6- 脂肪酸脱氢酶是一种膜整合蛋白,也是多不饱和脂肪酸合成途径中的限速酶。在前期工作中,通过RT PCR和RACE技术,从少根根霉NK300037中克隆到一个潜在编码Δ6- 脂肪酸脱氢酶的序列,序列和功能分析结果表明该序列具有一个长度为1377bp、编码由458个氨基酸组成、大小为52kD的新的Δ6- 脂肪酸脱氢酶基因。把少根根霉Δ6- 脂肪酸脱氢酶基因(RAD6)亚克隆到表达载体pPIC3.5K,构建重组表达载体pPICRAD6,并转化到毕赤酵母菌株GS115进行表达。提取酵母细胞总脂肪酸和进行甲酯化,经气相色谱和气相色谱质谱连用分析表明,目的基因的编码产物能将C16∶1、C17∶1、C18∶1、亚油酸和α- 亚麻酸在Δ6和7位间特异性脱氢而引入一个新的双键,生成更高不饱和的脂肪酸,该催化反应没有链长特异性,只有键位特异性。此外,按Kozak序列特点,改变目的基因转译起始密码子周边序列结构,并把改变后序列导入毕赤酵母GS115中进行功能表达分析,结果表明在毕赤酵母中这种改变同样能提高目的基因的表达水平。综合所有分析结果表明,巴斯德毕赤酵母更适合用来综合分析Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的功能。

少根根霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达

根据真菌Δ6 脂肪酸脱氢酶保守的氨基酸序列设计简并引物进行RT PCR ,获得一个 5 93bp的cDNA片段 ,再根据获得的部分序列设计基因特异性引物 ,通过cDNA末端扩增技术 (RACE)获得该cDNA的 3′和 5′序列 ,从而得到全长为 14 82bp的cDNA序列。序列分析结果表明 ,该序列具有一个长度为 1377bp、编码 4 5 8个氨基酸的开放阅读框 ,所编码蛋白质的大小为 5 2kD。与报道的Δ6 脂肪酸脱氢酶一样 ,推测的氨基酸序列具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的 3个组氨酸保守区和疏水结构 ,在其氨基酸序列的N 末端具有类似于细胞色素b5的血红素结合区。该序列为一个新的编码Δ6 脂肪酸脱氢酶的基因 ,为了验证其功能 ,把开放阅读框序列RAD6亚克隆到表达载体 pYES2 0 ,构建重组表达载体pYRAD6 ,并转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVScl进行表达。通过气相色谱(GC)和气相色谱 /质谱 (GC MS)分析表明 ,该序列在酿酒酵母中获得表达。所编码的酶具有Δ6 脂肪酸脱氢酶活性 ,能将外源性的底物亚油酸转化为γ 亚麻酸 ,γ 亚麻酸的含量占酵母总脂肪酸的 3 85 %。

转译起始密码子周边序列的改变对Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因表达的影响

将少根根霉中Δ6_脂肪酸脱氢酶基因 (RAD6 )的起始密码子周边序列作适当的修改 ,并把修改后获得的片段(RAD6_1 )亚克隆到表达载体pYES2 0 ,构建重组表达载体pYRAD6_1。经测序验证 ,把pYRAD6_1转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVScl进行表达分析 ,同时以空载体pYES2 0和出发序列所构建的pYRAD6作为对照。通过气相色谱 (GC)和气相色谱 质谱 (GC_MS)分析表明 ,在pYRAD6和pYRAD6_1转化的酿酒酵母中生成γ_亚麻酸 ,而pYES2 0中没有检测到。其中 ,pYRAD6_1转化的酿酒酵母γ_亚麻酸表达量占细胞总脂肪酸含量的 5 2 3% ,而对照pYRAD6转化的酿酒酵母中表达量只占 2 6 4 %。