猪生长激素基因在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达及产物的N-糖基化分析

利用含有强启动子PAOX 1 和α MF信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体质粒pPICZαA构建出含PST基因的重组质粒pPICZαA pST。通过电击将经SacⅠ酶切后线性化的pPICZαA pST质粒转化到巴斯德毕赤酵母X 33菌中 ,并筛选Mut+ 表型的重组菌。表达产物的SDS PAGE和Westernblot结果表明 ,分泌于胞外的PST蛋白分子量比天然PST分子量稍大 ,而胞内的PST蛋白分子量与天然PST大小相同。将经SacⅠ酶切后线性化的pPICZαA pST再次转化重组酵母细胞X 33 pPICZαA pST(Mut+ ) ,所得表达产物的SDS PAGE和Westernblot结果显示 ,PST基因的表达水平明显提高 ,且表达产生的蛋白均可发生正确的抗原 抗体结合反应 ,表达量达 95 6mg L。将发酵液上清进行N 糖基化分析 ,显示rPST无N

雅致放射毛霉羧肽酶Y在毕赤酵母中的高效分泌表达

分别构建以2种启动子表达雅致放射毛霉羧肽酶Y的重组毕赤酵母菌株GS115,通过提高抗生素浓度筛选到具有不同拷贝数羧肽酶Y基因的重组菌株,通过对蛋白表达量的比较筛选出高效分泌表达菌株。在筛选得到的重组菌株中共表达伴侣蛋白binding protein(BIP)、protein disulfide isomerase(PDI)、endoplasmic oxidoreductin 1(ERO1),分别将羧肽酶Y酶原的分泌表达量提高到1. 87倍、1. 72倍和1. 26倍。体外羧肽酶Y酶原可以由胰蛋白酶激活。该研究实现了雅致放射毛霉羧肽酶Y在毕赤酵母中的高效分泌表达,为其工业化应用提供了技术支持。

传染性法氏囊病毒免疫原基因在毕赤酵母中的高效分泌表达

从国内分离的鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)众多流行株中获得超强毒株(vvIBDV),应用RT-PCR方法,扩增得到IBDV主要保护性抗原VP2基因的开放编码框,克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZαA,将该重组质粒pPICZαA-VP2以电转化方法转入毕赤酵母X-33感受态细胞中,通过PCR鉴定、表型筛选和抗生素浓度梯度筛选,获得高拷贝阳性重组酵母菌株X-33-pPICZαA-VP2。经摇瓶诱导表达试验获得稳定高效分泌表达的酵母工程菌,表达量为0.459mg/ml,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹(Western-blot)以及动物试验表明,重组酵母工程菌表达的目的蛋白具有鸡传染性法氏囊病病毒天然蛋白的生物活性和免疫原性。

重组人组织因子在毕赤酵母中的高效分泌表达的研究

目的构建含有人组织因子(h TF)基因的毕赤酵母高效表达系统,实现胞外高效分泌表达。方法全基因合成h TF胞外区序列,PCR扩增该基因片段,经Xho I和Xba I双酶切后,和表达载体p GAPZa A相连,并电转化毕赤酵母SMD1168H。在YPD培养基中进行表达,取培养基上清进行SDS-PAGE检测,并利用Western进行确证,通过BCA法检测胞外蛋白表达量。结果在毕赤酵母中成功表达人组织因子,通过Western确证目的蛋白分子量大小正确,BCA法检测摇瓶表达胞外总蛋白达1 g/L,Bandscan软件分析目的蛋白占胞外总蛋白80%以上。结论本研究实现了截短型人组织因子在毕赤酵母中的高效分泌表达,获得了具有与完整因子相同凝血活性的截短型组织因子。

毕赤酵母分泌表达系统的研究进展

毕赤酵母表达系统是一种新的,极具潜力的真核表达系统,具有其他系统不可比拟的优点,在生物医药领域正在得到越来越广泛的应用。本文综述了该蛋白表达系统的一些特征及影响其表达的相关因素。

巴斯德毕赤酵母表达的突变型人白细胞介素-2的发酵条件与纯化研究

在以前的研究中,通过蛋白质工程技术获得了三突变体白细胞介素_2基因(编码12 5位半胱氨酸→丙氨酸;18位亮氨酸→蛋氨酸;19位亮氨酸→丝氨酸) ,并在毕赤酵母中加以表达。进一步优化表达条件,其最适诱导条件:80 %以上的通气,诱导2d ,初始pH6 0 ,甲醇终浓度为1 0 %。在上述条件下表达量占菌体总蛋白的30 %以上,大约2 0 0mg L。建立了一套从毕赤酵母表达上清中分离纯化分泌型表达蛋白IL_2的方法,经离心,超滤浓缩,强阳离子交换S柱和分子筛层析得到纯化的突变型和野生型IL_2 ;其得率为2 7% ,纯度达电泳纯并且HPLC检测只有一个峰。纯化的突变蛋白对CTLL_2细胞具有刺激性;与野生型IL_2相比,在各种温度条件下储存的突变蛋白保留有更高的活性;突变型IL_2的活力是野生型的4～5倍,具有更高的利用价值。

抗HER2人源化单克隆抗体在乳酸克鲁维酵母中的高效表达及其产物分析

目的:在乳酸克鲁维酵母中实现抗HER2人源化单克隆抗体的表达。方法:应用PCR扩增抗HER2人源化单克隆抗体的轻、重链基因,将扩增产物分别克隆入酵母表达载体pYES2/ochI和pPICZαA/ura3,经限制性内切酶以及DNA序列测定分析插入片段正确后,将重组质粒转化乳酸克鲁维酵母(Δura3)。转化子用半乳糖诱导,经间接ELISA和Western blot鉴定所表达产物的产量以及和抗原结合的活性。结果:构建了抗HER2人源化单克隆抗体轻、重链表达载体pYES2/ochI+αL和pPICZαA/ura3+αH,摇瓶培养表达产量可达(120±20)mg/L;经还原和非还原SDS-PAGE分析,抗体的轻、重链能够通过分子间二硫键正确装配;所表达抗体可与HER2胞外域特异性结合。结论:实现抗HER2人源化单克隆抗体在乳酸克鲁维酵母中的表达,具有与其抗原特异性结合的能力。

水产健康养殖防病和促生长用生物制剂

本项目立足于促生长用抗生素替代及药用抗生素减量使用，针对传统抗生素替代品益生菌饲用改善不稳定问题，重点开发防病和促生长用水产动物消化道微生物益生元件，创建信号肽库筛选联合胞内蛋白酶敲除枯草芽孢杆菌高效分泌表达平台，克服后功能基因时代普遍存在的难表达及低分泌表达等产业化障碍，实现淬灭酶（防治细菌病）和几丁质降解酶（防治寄生虫病及促进生长）的产业化生产，淬灭酶AiiO-AIO6具有耐高温、高比活及枯草芽孢中分泌表达的性能，共浴可抑制A.hydrophia毒力因子表达，且不影响其正常生长，具有防治鱼类养殖革兰氏阴性细菌性病害的功能；几丁质酶ChiCD3可显著降解寄生虫孢子壳瓣（共浴破壁率>35%）；获得高降解虾壳几丁质的ChiB565和具有几丁质酶和β-1,3-1,4-葡聚糖酶活的高比活双功能酶Chi92，采用枯草芽孢杆菌高分泌的几丁质氧化水解酶极大提高几丁质酶降解几丁质能力，以上研究有效解决我国水产养殖中细菌和寄生虫病害防治以及废弃虾蟹壳粉资源化问题，促进水产健康养殖，提高首都水产品的安全卫生质量，在首都水产养殖业环境保护和保障首都人民健康方面具有重要意义。