高效热不对称交互式PCR技术克隆地黄基因

利用高效热不对称交互式PCR（hiTAIL-PCR）技术从地黄基因组中扩增出3个DNA片段,经过电泳检测、回收、纯化和测序获得2个片段的碱基序列.其中一个由578个bp组成,包含一个453bp的开放阅读框（ORF）,编码151个氨基酸,与一些已知纤维素合酶基因在DNA水平和氨基酸水平的同源性分别高达81%~91%和83%~99%,而且推测蛋白质具有纤维素合酶的结构域;另一个由385个bp组成,没有ORF,不编码蛋白质,但是,预测其包含启动子元件.这些结果表明使用hiTAIL-PCR技术可以克隆地黄基因,克隆的基因将为地黄基因分子作用机制和分子育种研究奠定基础.

应用hiTAIL-PCR技术克隆Marinomonas sp.BSi20584菌株β-半乳糖苷酶基因

实验使用hiTAIL-PCR(high-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR,高效热不对称交错PCR)方法,从海单胞菌Marinomonas sp.BSi20584中克隆β-半乳糖苷酶基因。从GenBank注册的已知β-半乳糖苷酶氨基酸序列出发,设计引物克隆编码β-半乳糖苷酶保守片段的DAN序列;根据Marinomonas sp.BSi20584天然酶N端氨基酸残基测序结果,设计上游引物,保守DNA片段5'端设计下游引物,克隆N端到保守序列之间的DNA片段;将所得的2个DNA片段拼接并命名拼接后的片段为nbs。根据hiTAIL-PCR方法设计引物,染色体步移克隆nbs上下游片段,拼接上下游片段得到全长序列,设计引物扩增全长片段并测序。本文成功克隆了Marinomonas sp.BSi20584菌株β-半乳糖苷酶的编码基因,全长1 971 bp,NCBI比对表明其编码产物为GH-42家族的一个新成员。

sikFBA4基因启动子的克隆及低温表达模式分析

天山雪莲生长于常年积雪覆盖高海拔处的高山区域,具有很强的极端低温生境适应能力,属于研究植物低温适应的良好模式植物。前期的研究表明,sikFBA4基因可以显著提高番茄的抗寒能力。为进一步研究sikFBA4基因的耐寒响应模式,以天山雪莲为材料,采用实时荧光定量PCR分析sikFBA4在低温胁迫下的表达模式;利用高效热不对称PCR法(Hi-Tail PCR)克隆sikFBA4启动子序列并进行生物信息学分析。为分析PsikFBA4序列克隆的完整性及转录表达特性,将PsikFBA4与GUS基因融合在烟草中进行瞬时表达。结果表明,sikFBA4在低温胁迫条件下的表达发生瞬时显著上调,并在1h达到峰值,而后表达下调。通过启动子克隆分析,在PsikFBA4序列-1648bp位置处具有冷响应元件LTRE;进一步的GUS染色和酶活力测定结果表明,低温能够显著提高GUS基因的表达活性,说明sikFBA4属于低温诱导型基因。SikFBA4基因启动子的克隆、序列分析以及表达分析,为进一步探究雪莲果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(sikFBAs)基因的表达与调控机制奠定了基础。

T-DNA插入筛选棉花枯萎病菌致病力减弱突变体及其侧翼序列分析

【背景】新疆是棉花生产的主要地区,枯萎病的发生严重影响着棉花的产量。目前,关于棉花枯萎病原菌的发病机制尚无详细报道。【目的】在尖孢镰刀菌突变体库中筛选出致病力降低的突变体并分析其致病基因,以阐明棉花枯萎病菌的致病分子机制。【方法】在前期已建立的枯萎病菌突变体库的基础上,对随机挑选的136份突变体致病力进行鉴定,并对其表型和侧翼序列进行分析。【结果】获得5个致病能力明显降低的突变株,突变体B-18的形态与野生型有差异且菌落颜色变为紫色;5个突变体生长速率均降低,其中B-18下降最明显;5个突变体产孢数量均降低。扩增5个突变体,测序后经BLAST比对分析,确定了T-DNA在枯萎病菌基因组的分布情况。【结论】对筛选出的5个致病力缺陷的突变体进行分析并找到致病基因,为研究棉花致病基因的功能和克隆提供了坚实的理论基础。

柔细束丝藻土臭素合成酶基因的克隆及表达分析

土臭素(Geosmin)是一种具有土霉异味的次级代谢产物,对水体具有严重的影响.为探讨柔细束丝藻(Aphanizomenon gracile)土臭素的合成机制以及环境因子对其土臭素产量的影响,利用高效热不对称交错PCR(High-effi ciency thermal asymmetric interlaced PCR,hi TAIL-PCR)技术对柔细束丝藻藻株WH-1的土臭素合成酶基因进行克隆,并对该基因在不同温度和光强下的表达情况进行实时荧光定量PCR(RT-PCR)分析.结果显示本研究成功克隆柔细束丝藻藻株WH-1的土臭素合成酶基因(geo),geo全长2 262 bp,编码753个氨基酸.低温(15℃)、强光(35μmol m-2 s-1)以及不间断光照处理均有利于geo的表达.这表明hi TAIL-PCR技术作为一种高效、低廉的染色体步移技术具有较好的应用价值,同时为异味物质的监测及防治提供部分理论基础.