采用高效离子交换色谱分离分析动物肠道菌群方法初探

报道了利用高效离子交换色谱直接分离动物粪便肠道菌群的有关研究结果.人与兔的粪便样品稀释后经离心分离岀细菌,通过DEAE弱阴离子交换色谱(30cm×2cmi.d)进一步除去杂物,将所得细菌的完整细胞样品直接上样高效液相阴离子交换色谱进行分离.色谱柱采用TSKgelSuperQ-TOYOPEARL650C强阴离子交换树脂,平衡缓冲液为0.02mol/L的哌嗪-HCl缓冲液(pH8.0),吸附于色谱柱上的细菌完整细胞用0～1mol/LNaCl线性梯度进行洗脱,洗岀液由260nm紫外吸收与光散射强度检测器检测.人与兔粪便细菌样品分别获得8个与5个组分,经镜检与培养实验确认为细菌,并且光散射仪洗脱峰峰面积同细菌计数结果具有线性相关性.实验表明,高效离子交换色谱能够应用于肠道菌群这样的复杂细菌体系的分离分析.

应用高效离子交换色谱分析青枯菌的致病力分化

应用高效离子交换色谱和激光光散射仪检测器对不同致病力的青枯菌进行分析,建立了一种快速检测青枯菌致病力分化的新方法.青枯菌纯培养物经过高效离子交换色谱分离得到3个致病力不同的特征峰,大小依次为峰3组分>峰2组分>峰1组分.对10株青枯菌进行色谱分析,并结合番茄组培苗感染试验检测其致病力,结果发现,强致病力菌株经过色谱分离只在峰3的保留时间位置出现单一特征峰,在9d内即可引起100%的番茄组培苗发病;若菌株经过色谱分离形成3个特征峰,则峰3所占的面积比越大,该菌株的致病性相对就越强.25株不同致病力青枯菌的验证试验表明了该方法的可行性,番茄组培苗发病率x与峰3面积比y之间呈现出良好的线性关系,回归方程y=0.9581x+5.4984,相关系数r=0.986.通过对青枯菌色谱行为、致病力、细胞表面黏附的EPSⅠ含量三者之间相互关系的进一步研究,发现青枯菌的致病力越强,则细胞表面黏附的EPSⅠ越多,峰3所占的面积比就越大.

应用高效离子交换色谱快速分离定量不同致病力的青枯菌

应用高效离子交换色谱和激光光散射仪在线检测，快速分离定量不同致病力的青枯菌。青枯菌经过高效离子交换色谱分离得到3个特征峰，通过2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）平板鉴定和采用剪叶法回接番茄组培苗感染试验，发现这3个色谱峰所对应的青枯菌在致病力方面存在差异；其中峰3组分的致病力最强，峰1组分的致病力最弱。通过对青枯菌进样量与激光光散射仪的响应信号（峰面积）之间的线性关系研究，发现当青枯菌进样菌数为9×10^6～9×10^8时，菌数与色谱峰面积之间呈现出良好的线性关系，相关系数r=0．99。该项应用研究为不同致病力青枯菌的快速定量提供了一种新的分析方法。

不同生长阶段青枯菌的高效离子交换色谱表征

采用高效离子交换色谱和激光光散射仪对不同生长阶段的青枯菌进行色谱表征。青枯菌经过色谱分离得到3个特征峰。通过对延滞期、对数生长期和稳定期青枯菌细胞浓度、发酵液pH值、细胞表面黏附的胞外酸性多糖(EPSⅠ)含量与青枯菌色谱行为的关系研究,发现在8h时,青枯菌运动能力强,细胞表面EPSⅠ少,吸附力弱,绝大多数菌体直接随流动相流出形成峰1;随着培养时间延长,细胞表面黏附的EPSⅠ量增多,与树脂吸附力增强,保留时间延长。因此分析3个色谱峰的形成与青枯菌的运动性、以及细胞表面EPSⅠ与阴离子交换树脂的吸附作用有关。并通过比较3个色谱峰青枯菌细胞表面EPSⅠ含量的差异和观察青枯菌经过4%甲醛固定处理后色谱行为的变化加以进一步验证。高效离子交换色谱为细菌完整细胞的研究提供了一种新的分析方法。

高效离子交换色谱法分析青枯雷尔氏菌Tn5转座子突变菌株的异质性

【目的】研究青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)Tn5转座子突变菌株的异质性,筛选出无致病力高效生防菌株。【方法】利用已构建的青枯雷尔氏菌致病力参考指标"弱化指数(attenuation index,AI)"和接种番茄植株的生物测定法对60株供试的青枯雷尔氏菌Tn5转座子突变菌株进行致病力测定;利用高效离子交换色谱法研究不同致病力突变菌株的色谱行为异质性;构建色谱效价指数(chromatography titer index,CTIi),CTIi=Si/(S1+S2+S3)×100%(i=1、2或3;S1、S2和S3分别对应P1、P2和P3的峰面积),测定不同致病力青枯雷尔氏菌突变菌株的CTIi值,用皮尔逊相关系数(Pearson correlation coefficient,PCC)分析色谱效价指数与突变菌株的致病力和青枯病害防治效果的相互关系。【结果】基于AI值和生物测定结果,青枯雷尔氏菌Tn5转座子突变菌株具有3种不同致病力类型:强致病力、无致病力和中间型。强致病力菌株共33株,其AI值介于0.49—0.63,接种番茄15 d,植株发病率为66.33%—100%;无致病力菌株共有20株,其AI值介于0.78—0.89,接种番茄15 d,植株发病率为0;中间型菌株共有7株,其AI值介于0.68—0.73,接种番茄15 d,植株发病率为24.17%—45.92%。20株无致病力突变菌株对番茄青枯病的防治效果测定结果显示,防治效果介于16.68%—92.45%,菌株T831防治效果最好,达91.74%,其次是菌株T780,防治效果为87.51%,菌株T497防治效果最差,为16.68%。不同致病力青枯雷尔氏菌的高效离子交换色谱分离结果显示,青枯雷尔氏菌经高效离子交换色谱可以分离出P1(出峰时间为0.6 min)、P2(出峰时间为4.4或4.5 min)和P3峰(出峰时间为5.9或6.0 min);强致病力菌株和无致病力菌株均具有3种不同峰类型:单峰、双峰和3个峰,强致病力菌株的主峰为P3峰,无致病力菌株的主峰为P1峰,中间型菌株有双峰和3个色谱峰两种类型;强致病力菌株中CTI3为100%的菌株,致病力最强,诱导番茄植株发病率均达85%以上,CTI3<100%的菌株,接种后番茄植株发病率介于66.33%—84.14%;无致病力菌株中CTI1达100%的菌株,其防治效果高,均达到80%以上,CTI1<90%的菌株,其防治效果低,介于16.68%—63.62%;CTI3与突变菌株致病力呈极显著正相关,相关系数PCC值为0.62;CTI1与无致病力突变菌株的防治效果呈极显著正相关,相关系数PCC值为0.80。【结论】青枯雷尔氏菌Tn5转座子突变菌株具有3种致病力类型,不同致病力菌株的色谱行为不同。构建的色谱效价指数CTI1可用于快速筛选出无致病力高效生防菌株,CTI3可作为青枯雷尔氏菌致病力的参考指标。

青枯雷尔氏菌特征菌株高效离子交换色谱快速分离条件的优化

建立了高效离子交换色谱和紫外检测系统快速分离青枯雷尔氏菌的细菌色谱方法。通过比较青枯雷尔氏菌悬浮在哌嗪-HCl缓冲体系和双蒸水后的菌体数变化及细胞形态变化,分析该缓冲液对青枯雷尔氏菌生长活性及细胞表面特性的影响。结果表明,青枯雷尔氏菌悬浮在平衡缓冲液、洗脱缓冲液和双蒸水中的菌体数量无明显差异,分别为6.467×10~9、6.267×10~9和6.233×10~9cfu/mL。透射电镜观察发现,3种溶液处理后,青枯雷尔氏菌均保持完整的细胞结构。研究了缓冲液pH值、流速及菌体细胞浓度对青枯雷尔氏菌色谱分离效果的影响,确定青枯雷尔氏菌的最佳色谱分离条件为:缓冲液pH值为8.0,流速为2 mL/min,菌体浓度大于1.0×10~8cfu/mL且小于1.0×10^(10)cfu/mL。该分离条件缩短了分离时间,提高了分离效率,为快速分离青枯雷尔氏菌提供了一种有效的手段,同时也为细菌等微生物的分离提供了新途径。

溶菌霉等10种标准蛋白质在高效离子交换色谱上的复性研究

目的研究变性蛋白质在高效离子交换色谱(h igh perform ance ion exchange chrom atography,HPIEC)上的保留行为及复性效率。方法分别用盐酸胍(GuHC l)、尿素(Urea)和十二烷基磺酸钠(SDS)将溶菌酶(Lys)等10种标准蛋白质变性,然后在流动相为氯化钠的条件下,用HPIEC对变性蛋白质进行复性,并测定其保留时间、Z值、质量及活性回收率。结果10种变性蛋白质中的4种在HPIEC上得到复性,其保留时间、峰形、Z值与天然蛋白基本一致,其中溶菌酶和核糖核酸酶的质量和活性回收率高,复性效果好。结论用HPIEC对变性的标准蛋白质进行复性,得到较好的复性效果,为HPIEC用于蛋白质复性的实际应用奠定了基础。

脱脂乳发酵体系中乳酸菌的高效离子交换色谱分析

应用高效离子交换色谱对脱脂乳发酵体系中的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌进行色谱表征。结果表明,单菌培养过程中保加利亚乳杆菌菌体形态的变化在其相应色谱行为上得到了体现,二者的色谱峰有比较好的稳定性。两种菌的峰面积与菌数之间呈现出良好的线性关系,可决系数R2分别为0.9957和0.9916。因此本方法的建立,可用于酸奶发酵过程中乳酸菌的分析与表征,有望为乳酸菌混合物的研究提供一种快捷的新方法。

高效离子交换色谱法分析青枯雷尔氏菌无致病力epsD突变菌株的异质性

利用高效离子交换色谱(HPIEC)技术结合形态观察和胞外多糖(EPS)含量测定,比较分析青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株FJAT-91⊿epsD与强致病力出发菌株FJAT-91及自然致弱的无致病力菌株FJAT-1458的异质性。结果表明,菌株FJAT-91⊿epsD与菌株FJAT-91在菌落和菌体形态上均有明显差异,与菌株FJAT-1458的形态相似。胞外多糖含量测定结果表明,菌株FJAT-91⊿epsD的EPS含量((12.64±1.46)μg/mL)显著低于菌株FJAT-91((30.49±2.97)μg/mL),与菌株FJAT-1458的EPS含量((11.30±1.38)μg/mL)相当。高效离子交换色谱分离结果表明,菌株FJAT-91、FJAT-91⊿epsD和FJAT-1458形成的色谱峰个数和保留时间不同,菌株FJAT-91只有单一色谱峰P3,保留时间为6.04 min;菌株FJAT-91⊿epsD有P1和P2两个色谱峰,保留时间分别为0.59 min和4.62 min;菌株FJAT-1458只有单一色谱峰P1,保留时间为0.59 min。对不同色谱峰回收培养,并对回收培养后的菌株进行致病力鉴定。结果表明,番茄植株接种菌株FJAT-91-P3后第4 d开始发病,第10 d发病率达100%;植株接种菌株FJAT-91⊿epsD-P2后第9 d开始发病,第20 d发病率达100%;植株接种菌株FJAT-1458-P1和菌株FJAT-91⊿epsD-P1后,在观察期内均未发病。研究结果可为利用菌株FJAT-91⊿epsD防治作物青枯病提供理论依据。

高效离子交换色谱法研究植酸酶对小猪肠道微生物的影响

植酸酶作为一种饲料酶制剂,可以通过催化水解将磷酸盐从植酸中释放出来,因而可以提高饲料中磷的利用率,降低环境的磷污染,但是,植酸酶作为一种饲料酶制剂,是否对动物肠道微生物产生影响,并通过改变肠道菌群的生理平衡来影响动物的消化与吸收,这一问题尚没有明确的答案。本研究植酸酶在仔猪的玉米-豆粕型日粮中添加植酸酶,并利用色谱的手段对对照组和试验组小猪肠道微生物色谱行为进行表征,并分析了各菌群的糖苷酶及蛋白酶的活力分布,发现添加植酸酶可以促进糖苷酶分泌型细菌的生长,这一数据对植酸酶在体内的作用机理提出了新的思路。

高效离子交换色谱法测定半乳糖、葡萄糖、乳糖及低聚半乳糖含量

建立离子色谱法定量测定以乳糖为原料、使用伊半乳糖苷酶生产的低聚半乳糖产品的方法。样品前处理过程中用体积稀释法代替质量稀释法，采用高效CarboPac PA20阴离子交换色谱柱和积分安培法检测，并对淋洗液组成进行优化。优化后的方法加标回收率90．58％-99．45％，相对标准偏差为3．54％。半乳糖、葡萄糖、乳糖的方法检出限分别为0．24、0．59、0．75μg／g。半乳糖和葡萄糖在0．2～7μg／mL、乳糖在0．6～10μg／mL的范围内，其质量浓度与峰面积线性关系良好，相关系数在0．9992～0．9999之间。用此方法测定6种原料低聚半乳糖，目标组分总含量为95．84％～101．19％。

高效离子交换色谱检测冻融交替处理对蛋白质的影响

将各种温度处理的标准蛋白质进行了阴离子交换高效液相层析，结果表明，冻融交替并常温放置长时间，以及水溶解或特定ｐＨ缓冲溶液溶解经贮藏一定时间，会导致肌蛋白降解或发生变化．

蛋白质分离与纯化过程中高效离子交换色谱柱的再生探讨

随着我国科学技术的快速发展,生物技术应用水平取得了大幅度的提升,很多生物技术被广泛应用与蛋白质的生产过程中,例如,发酵工程、蛋白质工程以及基因工程等,但是在蛋白质的分离与纯化方面,技术水平发展仍较为缓慢,这在很大程度上制约着蛋白质的工业化建设,致使其所具备的经济效益以及社会效益无法得以全面发展。

对数期金黄色葡萄球菌的离子交换色谱行为及其表征

建立了高效离子交换色谱和激光光散射仪联用的分离 检测系统研究对数期金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的方法。实验采用TSKgelSuperQ TOYOPEARL650C色谱柱,以20mmol/L的哌嗪 盐酸缓冲液(pH6 0)为流动相,倍增系数为21的光散射系统检测,发现对数期的S.aureus表现出两个有规律变化的色谱峰。透射电镜观察显示前峰的S.aureus为圆形,后峰为椭圆形且有一条明显的横隔壁。采用3 (4,5) 双甲基 2 噻唑 (2,5) 苯基溴化四氮唑盐(MTT)试剂测定这两个色谱峰,发现后峰的增殖能力比前峰高65 3%。实验结果表明,前峰为停止分裂的金黄色葡萄球菌、后峰为处于裂殖状态的金黄色葡萄球菌。该方法可作为研究微生物的一种快速而精确的新型分析方法。

高效离子交换色谱测定蛋白质的微不均一性生物经济

本文展示了使用生物兼容色谱系统和高分辨离子交换模式分离蛋白质变异体的例子，使用专门设计用于蛋白质分离的阴阳离子交换色谱柱来分离OVA．合成的BSA．酪蛋白的磷酸化蛋白变异体？核糖核酸酶A和单克隆抗体的脱氮基化变异体？以及单克隆抗体的C-末端赖氨酸．酸性和碱性变异体，与早期那些通过优化洗脱液和或分离程序的工作相比，从这些例子可以看到现在的分离状况有显著改进。

离子交换色谱对抗VEGFR2单抗的电荷异质性分析

目的采用离子交换高效液相色谱(CEX-HPLC)分析抗VEGFR2(抗血管内皮生长因子受体2)单抗制品的电荷异质性。方法应用CEX-HPLC技术,对VEGFR2单抗进行电荷异质性分析,并结合羧肽酶B(CpB)和N-糖酰胺酶F(EndoF2)酶切,初步研究其电荷异质性的成因。结果用CEX-HPLC分析CpB酶切前后单抗,证明其碱性变异体主要由C末端赖氨酸不均一性引起;分析EndoF2酶切前后处理的单抗,证明其酸性变异体部分由N-糖末端上的唾液酸修饰所引起。通过2种酶的顺序酶切可相对准确地分析含C-末端赖氨酸以及含唾液酸单抗的比例。结论采用CEX-HPLC可较好地分析单抗的电荷异质性;并结合合适的酶切处理,可判断单抗主要电荷异质性的来源,为保证单抗制品生产工艺的稳定性及质量控制提供了有效手段。

浅谈离子色谱在药品检测中的应用

离子色谱是20世纪70年代以来发展起来的一种新型液相分离技术,具有检测方便快捷、灵敏度高、选择性好及色谱柱的稳定性好、容量高等优势,目前已经逐步应用于药品检测领域。主要阐述离子色谱的分离原理、研究进展及其在药品检测领域的主要应用,离子色谱通过与其他检测方法的联合使用不多扩展技术的应用范围,并推动我国药品分析领域的发展。

离子色谱法在重金属元素价态分析中的应用

作为高效液相色谱的一种，离子色谱可分为高效离子交换色谱（HPLC）、离子排斥色谱（HPIEC）和离子对色谱（MPIC）。离子色谱是利用离子交换基团之间的交换．亦即基于离子交换树脂上可离解的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子之间进行的可逆交换及分析物溶质对交换剂亲和力的差别实现离子的分离。离子色谱法主要用于阴阳离子的分析，

小鼠肠道菌群HPLC分析中色谱分离条件的优化

研究了在小鼠肠道菌群的高效离子交换色谱(HPLC)分析中,不同色谱分离条件对分离效果的影响,确立了最佳色谱条件:样品上样于Toyopearl TSK gel SuperQ-650c强阴离子交换树脂柱,以0.02mol/L哌嗪-HCl缓冲液(pH8.0)平衡,洗脱盐浓度为1.0mol/L NaCl,洗脱梯度为0.1～0.5mol/L NaCl线性梯度洗脱80min,再经0.5～0.75mol/L NaCl线性梯度洗脱25min,流速定为1ml/min,进样量1ml。小鼠肠道菌群HPLC分析方法的建立,为深入研究小鼠肠道菌群的组成和动态变化奠定了基础。

聚乙二醇化重组人干扰素α2b位置异构体比例离子交换高效液相色谱测定法的建立及修饰位点分析

目的建立聚乙二醇化重组人干扰素α2b(PEGylated recombinant human interferonα2b,PEG-rhIFNα2b)位置异构体比例的离子交换高效液相色谱(ion exchange high performance liquid chromatography,IEC-HPLC)测定法,并对各异构体修饰位点进行分析。方法色谱柱采用Proteomix SCX-NP10(10.0 mm×250 mm,10μm);流动相A为:1.8 mmol/L一水合柠檬酸-3.3 mmol/L十二水合磷酸氢二钠(pH 5.3),流动相B为:30 mmol/L柠檬酸三钠-35 mmol/L二水合磷酸二氢钠(pH 6.0);线性梯度洗脱:0~180 min(0%B→12%B),180~220 min(12%B→15%B);流速为:0.4 mL/min;柱温为:25℃;进样量:不低于100μg。同时对IEC-HPLC法进行专属性及重复性验证。采用建立的方法测定3批PEG-rhIFNα2b的位置异构体比例,并通过SPSS 19.0软件进行分析,拟定5个位置异构体比例质量标准。采用建立的方法富集5个位置异构体的洗脱峰,进行修饰位点定位。结果空白对照和rhIFNα2b原液无色谱峰出现,对PEG-rhIFNα2b位置异构体测定无干扰,PEG-rhIFNα2b可见5个异构体峰,且分离度良好;同批PEG-rhIFNα2b连续测定3 d,峰1、2、3、4和5面积的总RSD分别为1.96%、2.53%、2.54%、1.05%和1.86%,均<3.0%。PEG-rhIFNα2b的5个位置异构体比例质量标准可拟定为:峰1为5%~9%、峰2为14%~21%、峰3为7%~10%、峰4为30%~34%、峰5为31%~39%。PEG-rhIFNα2b位置异构体峰1修饰位点主要为K31,峰2主要为K134,峰3主要为K131和K164,峰4主要为K83,峰5主要为K121,未检测到N-末端PEG修饰。结论建立了PEG-rhIFNα2b位置异构体比例的IEC-HPLC测定法,该方法具有良好的专属性及重复性,可用于PEG-rhIFNα2b位置异构体比例的测定。