猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因在昆虫细胞中的高效融合表达

对杆状病毒Bac to Bac表达系统的转座质粒pFastbac1进行改造 ,即在其多角体蛋白启动子下游插入谷胱苷肽 S 转移酶 (glutathione S transferase ,GST)基因 ,构建GST融合表达转座质粒pFGST。通过转座和转染Sf9细胞 ,证实该系统能高水平表达GST。采用PCR方法从pMT gp5 1质粒中扩增截去N端信号肽序列的猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)YA株ORF5基因 ,并将截短的ORF5基因片段克隆到pFGST中 ,使之与GST融合 ,构建的重组转座质粒pFGST 5 3转染DH1 0Bac ,提取大分子BacmidDNA ,转染Sf9细胞 ,获得能表达融合蛋白的高滴度重组病毒rvGST5 3。rvGST5 3感染Sf9细胞 ,SDS PAGE和Western印迹分析表明 :与GST融合的ORF5基因在Sf9细胞中获得高效表达 ,表达产物分子量为 45kD ,能与抗PRRSVE蛋白单克隆抗体发生特异性反应。将表达产物免疫小白鼠 ,经间接免疫荧光检测 ,免疫血清能使PRRSVYA株感染的MARC 1 45细胞呈较强的荧光着色 ,证实表达的融合蛋白具有良好的免疫原性。

CpTI蛋白在大肠杆菌中的高效融合表达及其纯化与活性测定

豇豆胰蛋白酶抑制剂 (CowpeaTrypsinInhibitor)基因 (CpTI)因其抗虫谱广及不易耐受等优点在植物基因工程中得到广泛应用。为进行遗传修饰食品 (Geneticallymodifiedfoods,GMF)中所含CpTI基因表达产物的安全性评价 ,我们需要在体外微生物体系中获得大量的CpTI蛋白。采用pGEX融合蛋白表达系统 ,将CpTI与GST的编码序列在大肠杆菌BL2 1中进行融合表达 ,表达产物达到菌体总蛋白的 4 0 %。经一步GlutathioneSephrose 4B亲和纯化 ,融合蛋白GST CpTI纯度达到 90 %以上。将Thrombin蛋白酶与融合蛋白过夜作用 ,可获得切掉了GST标签的CpTI蛋白。活性测定显示GST CpTI及CpTI蛋白均具有明显的胰蛋白酶抑制剂活性。用纯化的融合蛋白免疫家兔还可诱导产生高效价的抗体 ,经ELISA检测抗体滴度 >1∶2 0 0 0 0。WesternBlotting实验显示 ,无论是菌体超声裂解后总蛋白中的CpTI蛋白或是经纯化后的CpTI蛋白均可与自制的抗体发生特异性结合。这为进一步进行CpTI蛋白的安全性评价工作奠定了良好基础。