高效TAIL-PCR的改良及在洋葱中的应用

高效TAIL-PCR是一种完全依赖PCR的方法,它利用5'端带尾巴的高简并倍数的LAD引物在未知序列上创造结合位点;LAD0引物是LAD系列简并引物5'端的部分序列,利用其可以保证PCR扩增中结合未知序列端的引物浓度;利用巢式PCR可提高扩增产物特异性。本研究将该技术应用于洋葱的未知侧翼序列分离,建立了洋葱的高效TAIL-PCR技术体系。

高效、新T-DNA侧翼序列分离技术--Actail-PCR

【目的】建立一种有效分离T-DNA插入突变体侧翼基因组序列的方法。【方法】分离侧翼的目标基因组序列是利用T-DNA标签法研究植物功能基因组学的一个关键步骤,笔者发展稳定高效的Actail-PCR分离技术。该技术一侧引物来自于T-DNA载体,另一侧引物为一个复性控制引物。复性控制引物在3'端为一个14bp的随机简并引物,在5'端非目标尾部序列接上一个通用引物,中间由5个多聚脱氧次黄嘌呤核苷(poly(dI))连接。【结果】Actail-PCR技术将随机简并引物重新编辑成复性控制引物,在40℃的低严谨条件下,3'端的随机简并引物可以与T-DNA插入突变体的侧翼目标区段随机的结合,扩增得到目标片段,随后利用5'端的通用引物与T-DNA载体上的巢式引物依次组合,在65℃(10个循环后逐步降温至58℃)的高严谨条件下逐步扩增特异片段,同时抑制非特异性扩增,可以显著提高目标片段的扩增效率,减少假阳性。【结论】相对传统的TAIL-PCR,Actail-PCR技术可以更高效地分离T-DNA插入突变体的侧翼基因组序列。

改良TAIL-PCR技术在小麦PM H^＋ -ATPase基因启动子克隆中的应用

以小麦基因组DNA为模板,利用改良的热不对称交织PCR(TAIL-PCR)技术成功克隆到小麦PM H+-AT-Pase基因的上游侧翼序列,测序结果表明,该序列全长363 bp.序列分析结果表明,GGGCGGG序列位于-141^-135 bp;TATA-box位于基因转录起始位点CAT-box上游-37^-32 bp;-70^-80 bp间没有发现CCAAT-box;ATG位于CAT-box下游203~205 bp处,5’UTR(非编码区)序列全长202 bp,表明该序列为小麦H+-ATPase启动子序列.

TAIL-PCR技术及其在植物基因中的克隆

热不对称性PCR(thermal asymmetric interlacedPCR,TAIL-PCR)是一种用来分离与已知序列邻近的未知DNA序列的分子生物学技术。该技术利用3个根据已知序列设计的嵌套特异性引物分别和简并引物组合进行PCR反应,选择恰当退火温度对目标片段进行PCR扩增。TAIL-PCR技术作为一种使用技术简单易行,反应高效灵敏,产物特异性高,重复性好,能够在较短的时间内获得目标片段,已经在分子生物学研究领域广泛应用。本文从TAIL-PCR技术原理出发,对该技术特异性引物设计、随机引物组合选择、PCR反应条件等关键性问题进行综述,并介绍TAIL-PCR技术在植物基因克隆上的应用现状及发展前景。

TAIL-PCR方法快速克隆银杏查尔酮合成酶基因及序列分析(英文)

热不对称交错PCR(TAIL-PCR)方法已广泛应用于从多种生物克隆已知DNA序列的侧翼序列。对传统的TAIL-PCR方法进行改良:(1)将TAIL技术应用于TAIL-PCR中第3步PCR循环。(2)以10bp的随机简并引物即RAPD引物代替基因侧翼简并引物。以银杏品种家佛手的叶基因组DNA为模板,利用简并引物克隆到银杏查尔酮合成酶基因(CHS)片段序列Gbchs1,以此序列设计3条特异引物,利用改良的热不对称交错PCR方法克隆到CHS基因Gbchs2。结果表明,Gbchs2长1238bp,编码304个氨基酸并包含3’末端序列。GbCHS2蛋白质序列与其他植物的CHS蛋白质序列高度同源,包含CHS蛋白质保守的环化作用活性位点,催化活性位点、香豆素活性位点、及催化活性基序。改良后的TAIL-PCR方法为基因全长的克隆提供了一种简单快速高效的新方法。

TAIL-PCR研究进展及其在畜牧兽医中的应用

热不对称交错PCR(TAIL-PCR)是一种以PCR为基础的染色体步移,主要用于分离已知基因的侧翼序列,具有简便、快速、高效、特异性强等特点。文章从TAIL-PCR的原理、优势及局限性、反应体系优化等方面对TAIL-PCR的研究进展进行综述,其中在畜牧兽医中主要用于已知基因侧翼克隆和转基因动物模型外源基因插入位点确定。但由于基因组DNA的庞大和复杂性,使得从基因组中克隆获得目的基因仍存在诸多限制因素,如特异性引物错配和随机引物结合位点不确定,易造成非特异性产物的产生;模板GC含量异常或存在高度重复序列时,即使使用多种简并引物也难以获得阳性产物。因此,应根据实际情况对TAIL-PCR进行灵活调整。当模板较复杂时,可借鉴连接介导PCR原理,给引物加上接头,提高扩增反应的特异性;当模板较简单或序列较清晰时,可根据模板特点(如高GC含量)或已知模板序列设计引物、调整反应条件,增加操作的简便性;还可参考Suppression-PCR原理,选择引物和反应条件,获得较长的扩增片段。此外,TAIL-PCR可与多种技术联合使用,促使其在畜牧兽医中获得更广泛深入的应用。

利用TAIL-PCR和RT-PCR技术克隆云芝植酸酶基因

从采绒革盖菌(Coriolus versicolor,常被称为杂色云芝)中筛选到产植酸酶基因.根据植酸酶基因的保守序列设计引物P1、P2,从云芝中分离克隆植酸酶基因的片段.再在分离到的已知序列的5′端和3′端设计嵌套的特异引物SP1、SP2、SP3和SP1′、SP2′、SP3′,利用TAIL-PCR技术进行分离已知序列的侧翼序列.结合Blastn、ORF和Primer5.0软件,在侧翼序列上设计特异引物P3、P4,最终从云芝中分离克隆到全长的植酸酶基因B4.再在B4序列的基础上设计引物phyP rt1、phyP rt2,利用这两个引物通过RT-PCR技术从云芝中克隆到全长的植酸酶基因B5.通过分析,分离克隆到的植酸酶基因可能是新的基因.

一种基于PCR技术混合样本高效定性筛查转基因阳性样本的方法

【目的】基于PCR技术与DNA样本混合策略建立一种高效定性筛查大量待检样本中转基因阳性样本的方法。【方法】以480个样本为研究案例,对待检样本DNA模板随机编号后构建虚拟三维混合池,置于5×96孔板中,将各板、各行和各列分别混合,构建所有板各行的X维行池(A,B,C,……G,H)和所有板各列的Y维混合池(1,2,3,……11,12),各板所有样本混合的Z维混合池(I,II,III,IV,V)。利用三维交叉唯一性原理与PCR检测的灵敏性与特异性,高效定性筛查样本中的阳性个体。将浓度为500 ng.μL-1的阳性对照分别用ddH2O和同浓度阴性DNA模板进行96倍(96×)稀释,检测该方法的灵敏性与特异性。5×96孔板480个样本中,双盲法随机掺入13个Bt176转化事件标准样本(Cry1Ab阳性与Bt176特异引物阳性),通过对25个混合池检测,得到候选阳性样本,并进行二次检测,筛查出真正的阳性样本。【结果】96×混合样本未影响检测的灵敏性与特异性。通过该种混合池得到可能的33个候选样本,再对33个候选样本进行二次检测,成功检测出所有与设置相符的盲样,即掺入的13个阳性样本。【结论】该方法适用于从大量的样本中用PCR方法定性筛查少量阳性样本的检测,工作量比普通单样本逐一检测的方法降低了80%左右。

TAIL-PCR的改良及其在分离小麦基因启动子中的应用

在经典TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR)的基础上,对其进行了如下四处改进:用10个碱基的RAPD引物代替16个碱基的随机兼并引物作为PCR中的随机引物;将较低特异性循环的复性温度由44℃降至29℃;增加5个高特异性反应循环,减少5个较低特异性反应循环;用单引物对第三轮PCR产物进行初步鉴定。利用改进的TAIL-PCR方法分离了小麦X基因的5′未知的侧翼序列,与GUS基因融合后转入拟南芥,通过组织化学检测分析表明分离到的5′侧翼序列具有启动子功能,同时说明改进的TAIL-PCR能更好地应用到较复杂基因启动子的分离。

TAIL-PCR法快速分离红曲霉色素突变株T-DNA插入位点侧翼序列

采用热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)法分离红曲霉色素突变株T-DNA插入位点的侧翼序列,扩增到了长度介于500bp～1300bp之间的7个DNA片段,对这些DNA片段测序,并采用生物信息学方法对测序结果进行了分析,表明其中有1个片段与烟曲霉Af293发育调控子flbA的相似性较高。TAIL-PCR法成功应用于分离红曲霉突变株T-DNA插入位点的侧翼序列,为大规模获取插入位点侧翼序列建立了可行的方法,也为进一步研究红曲霉功能基因奠定了基础。

一种DNA侧翼序列分离技术——TAIL-PCR

在分子生物学研究中,基因克隆和分子杂交的探针制备等操作常需分离与已知DNA序列邻近的未知序列,热不对称交错PCR(简称TAIL PCR)反应技术能够较好地解决上述难题。该技术通过3个嵌套的特异性引物分别和简并引物组合进行连续的PCR循环,利用不同的退火温度选择性地扩增目标片段,所获得的片段可以直接用做探针标记和测序模板。TAIL PCR技术简单易行,反应高效灵敏,产物的特异性高,重复性好,能够在较短的时间内获得目标片段,已经成为分子生物学研究中的一种实用技术。笔者综述了TAIL PCR反应的原理、引物设计、反应条件设置及产物分析。

斜卧青霉114-2 cbh1基因的TAIL-PCR克隆及与抗阻遏突变株JU-A10的比较

【目的】研究斜卧青霉(Penicillium decumbens)114-2与其抗阻遏突变株JU-A10外切酶基因序列的差异。【方法】用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)和RT-PCR扩增得到斜卧青霉114-2外切葡聚糖酶Ⅰ(cbh1)基因全长和cDNA全长。【结果】cbh1基因全长为1500bp,含有两个内含子,编码453个氨基酸(GenBank,EF397602)。克隆并分析了1.9kb的cbh1基因上游序列,分别发现了葡萄糖代谢抑制因子CREⅠ与纤维素酶转录调控蛋白ACEΙ的两个的潜在结合位点。【结论】在相同的培养条件下,其抗阻遏突变株JU-A10的外切酶活明显高于野生株114-2。两菌株的cbh1基因序列完全一致,说明外切酶活明显提高不是由于cbh1基因发生突变引起的。

土壤磷素高效利用转基因大豆特异性PCR检测方法

华南农业大学根系生物学研究中心采用拟南芥的紫色酸性磷酸酶基因AtPAP15转化大豆品系粤春03-3(YC03-3),获得了酸性磷酸酶活性明显提高、可高效利用土壤磷素的转基因大豆新品系AP15-1。本研究以AP15-1为研究对象,应用TAIL-PCR技术,根据载体序列设计特异引物,获得了转化载体左侧插入的旁邻序列。设计事件特异性检测引物,进行PCR扩增,只能在AP15-1的样品中扩增出特异性条带,进一步用实时荧光定量PCR作分析,结果显示,该引物对重复性好,融解曲线显示只有一个特异峰值。本实验应用该引物对建立的检测方法,检测的灵敏度可以达到0.01%,实时荧光定量PCR检测的极限值可以达到9个基因组的拷贝数,能够满足对转基因大豆新品系AP15-1及其衍生品种检测的需要。

应用Tail-PCR扩增蓝猪耳T-DNA侧翼序列

蓝猪耳是一种重要的具有观赏和科研价值的花卉植物.采用TAIL-PCR成功扩增了转基因蓝猪耳T-DNA插入位点的侧翼序列,扩增片断长度为200～2000bp,大多数片段在400bp和800bp左右,其中36%的序列含有植物的同源序列.通过与GenBank数据库比对,确定了部分T-DNA插入位点周边序列编码的可能蛋白,并提交序列7条;另外还对T-DNA转化植物时整合的位点进行了分析,发现断裂位点集中在距右边界15～18bp和右边界外234bp处,分别占总扩增片段的47.62%和38.10%.这为利用T-DNA标签进行蓝猪耳基因克隆和功能分析提供了实验技术上的保证.

优化TAIL-PCR方法克隆棉花抗逆相关转录因子编码基因

ABF/AREB/ABI5/DPBF类转录因子属于碱性亮氨酸类蛋白,在依赖ABA的逆境信号传导途径中起重要的作用。本研究结合该类转录因子的结构特点,利用3′RACE技术和优化的TAIL-PCR技术成功获得棉花中三个该家族成员编码基因。进一步验证结果表明两步PCR成功获得基因完整的ORF、3′UTR以及部分5′UTR序列。本研究所获基因为棉花抗逆基因工程提供了候选基因源,优化后的TAIL-PCR技术为克隆棉花中目的基因提供了一种简便高效的方法。

高效热不对称交互式PCR技术克隆地黄基因

利用高效热不对称交互式PCR（hiTAIL-PCR）技术从地黄基因组中扩增出3个DNA片段,经过电泳检测、回收、纯化和测序获得2个片段的碱基序列.其中一个由578个bp组成,包含一个453bp的开放阅读框（ORF）,编码151个氨基酸,与一些已知纤维素合酶基因在DNA水平和氨基酸水平的同源性分别高达81%~91%和83%~99%,而且推测蛋白质具有纤维素合酶的结构域;另一个由385个bp组成,没有ORF,不编码蛋白质,但是,预测其包含启动子元件.这些结果表明使用hiTAIL-PCR技术可以克隆地黄基因,克隆的基因将为地黄基因分子作用机制和分子育种研究奠定基础.

TAIL-PCR方法快速分离Xcc致病相关基因序列

以mini Tn5gfp km转座子中nptII片段作为探针 ,对已获得的五株野油菜黄单胞菌野油菜黑腐病致病型(Xcc)非致病突变体进行了Southernblot分析 ,结果表明 ,这五株突变体确由mini Tn5gfp km转座子插入致病相关基因所致 ,且为单拷贝不同位点的插入。提取这五株突变体总DNA作为模板 ,采用改进的热不对称交错PCR (TAIL PCR)方法从其中克隆到了各自转座子插入区侧翼序列 ,对这些侧翼序列进行了序列测定并将分析结果与GenBankdatabase及Xcc全基因组序列做了比较 ,结果表明 ,五个侧翼序列所在的基因确与Xcc致病性有关。这种改进后的TAIL

利用TAIL-PCR技术克隆猴头菇β-glucosidase基因

根据已知的β-glucosidase基因的保守序列设计引物,从猴头菇的菌丝体中克隆到β-glucosidase基因片段B1,再利用TAIL-PCR技术扩增B1两端的侧翼序列B2和B3,B2和B3序列经Blastn、ORF和Primer5·0软件分析后,再设计B2和B3侧翼序列的特异引物对猴头菇的基因组DNA进行扩增,最终扩增到全长的β-glucosidase基因,其大小为2226bp。

不同TAIL-PCR通用引物在转基因大豆、水稻、油菜侧翼序列分离中的应用评价

为研究不同转基因作物T-DNA插入位点侧翼序列分离中所用的通用简并引物对TAIL-PCR的影响,本研究使用5个通用简并引物分别对8个转基因大豆、30个转基因水稻和2个转基因油菜株系进行了TAIL-PCR分析,结果表明,5个简并引物在TAIL-PCR中的扩增效果存在显著差异,同一简并引物在不同转基因物种的扩增效果显著不同。AD1引物在转基因水稻和转基因油菜中扩增效果较好,AD2引物在转基因水稻、油菜和转基因大豆中扩增效果均较好,AD3引物在转基因水稻中扩增出1个株系,在转基因油菜中扩增出1个株系,但AD3引物与pFGC5941 T-DNA RB上游有匹配,不适用于以pFGC5941为载体的转基因材料分析。AD4和AD5 2个引物在3个转基因物种的扩增均较差。对AD1和AD2两个引物的TAIL-PCR扩增产物进行测序,结果表明,扩增产物均对应转基因材料的侧翼序列。研究表明,不同通用引物在不同转基因事件中侧翼序列的分离效果差异较大,通用引物AD1和AD2TAIL-PCR成功率最高。不同通用引物的应用效果不仅与不同物种有关,也与外源基因的插入位点有关,而且还与载体序列匹配程度相关。为提高TAIL-PCR中T-DNA插入位点侧翼序列分离成功率,建议同时采用多个通用引物平行扩增。

梅花南京红须F3′H全长基于gDNA的TAIL-PCR法克隆(英文)

根据从基因组DNA扩增到的梅花‘南京红须’类黄酮3'-羟化酶基因片段(469 bp)没计3条嵌套的特异性引物，与6条短的随机简并引物组成的引物库分别用热不对称交错PCR法从‘南京红须’基因组DNA扩增该片段的5'和3'旁侧序列。获得的5'和3'旁侧序列分别长1443 bp和1200 bp。将两个旁侧序列在469 bp片段的基础上拼接得到‘南京红须’全长为2 144 bp的类黄酮3'-羟化酶基因，被命名为pmhxF3'H。序列分析表明：该基因与11条正式发表的、已递交到GenBank的类黄酮3'-羟化酶基因的cDNA序列在总体上有52．21％的一致性．具有3个内含子，其启动子含有1个“AGGA盒”、1个“GC盒”和3个“TATA盒”。这是首次用热不对称交错PCR法从木本植物的基因组DNA克隆到类黄酮3'-羟化酶基因。本研究将为梅花花色的分子生物学机理探索、花色的基因工程改良提供参考。