miR21-5p靶向转录激活蛋白STAT3减轻高氧性急性肺损伤

目的探讨miR21-5p调控转录激活蛋白STAT3在高氧性急性肺损伤(HALI)中的作用及机制。方法选择40只C57BL/6J小鼠随机分为常氧组、高氧组、高氧+miR21-5p组及高氧+空载体组,吸入90%以上浓度氧气建立HALI小鼠模型。常氧组饲养于正常空气中;高氧+miR21-5p组及高氧+空载体组分别经气管导管滴入miR21-5p AAV6或空载体,饲养3周后建立HALI小鼠模型。高氧暴露48 h后,取肺组织采用ELISA试剂盒检测炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)和氧化应激标志物(SOD、MDA、ROS)水平;计算肺水含量;行HE染色观察形态学变化并行病理学评分;Tunel法检测肺组织细胞凋亡率;RT-PCR检测miR21-5p表达水平;Western blot检测STAT3、p-STAT3、Bax及Bcl-2蛋白相对表达水平。结果与常氧组比较,高氧组肺损伤病理评分、肺水含量及肺组织细胞凋亡率升高(P<0.05),炎症因子TNF-α、IL-6及IL-1β水平升高(P<0.05),MDA和ROS水平升高(P<0.05),SOD水平降低(P<0.05),STAT3、p-STAT3及Bax蛋白表达升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表达下降(P<0.05);与高氧组比较,高氧+miR21-5p组肺损伤病理评分、肺水含量及肺组织细胞凋亡率降低(P<0.05),炎症因子TNF-α、IL-6及IL-1β水平降低(P<0.05),MDA和ROS水平降低(P<0.05),SOD水平升高(P<0.05),STAT3、p-STAT3及Bax蛋白表达降低(P<0.05),高Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05)。高氧组HE染色可见肺泡结构紊乱、间隔增厚,大量炎症细胞浸润,透明膜形成及肺泡萎陷,高氧+miR21-5p组HE染色结果显示肺损伤程度明显减轻。结论miR21-5p靶向转录激活蛋白STAT3活性抑制炎症反应及凋亡并维持氧化还原平衡减轻HALI。

Ⅱ型肺泡上皮细胞来源外泌体miR-21-5p调控上皮钠离子通道减轻高氧性急性肺损伤

目的探讨Ⅱ型肺泡上皮细胞(typeⅡalveolar epithelial cells,AEC-Ⅱ)来源外泌体(exosomes,Exos)-miR-21-5p(miR-21)调控上皮钠离子通道(epithelial sodium channel,ENaC)对高氧性急性肺损伤(hyperoxia-induced acute lung injury,HALI)的保护效应及可能机制。方法6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠60只,其中20只使用差速贴壁离心法提取原代AEC-Ⅱ并培养,采用密度梯度离心法提取AEC-Ⅱ来源外泌体,透射电镜鉴定外泌体形态。余40只小鼠按随机数字表法分为(n=10):常氧(Control)组、高氧(HALI)组、高氧+Exos-miR-21(HALI+miR-21)组和高氧+siPI3K+Exos-miR-21(HALI+siPI3K+miR-21)组。除Control组外,余3组小鼠暴露于95%O 2的自制高氧饲养箱中构建HALI模型。72 h后RT-qPCR检测肺组织及外泌体miR-21表达;HE染色观察肺组织形态学变化并行肺损伤病理评分,计算肺组织湿/干质量比及肺泡液体清除率(alveolar fluid clearance,AFC);可见分光光度法测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)及总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)水平;荧光分光光度法测定活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平;Western blot检测PTEN、AKT、p-AKT、PI3K及α-ENaC、β-ENaC、γ-ENaC蛋白表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证miR-21与PTEN靶向关系。结果原代AEC-Ⅱ提取的囊泡状物质经鉴定为外泌体,外泌体中miR-21表达显著增高(P<0.05),PTEN为miR-21靶基因。与Control组比较,HALI组HE染色可见肺组织肺间隔增厚、大量炎症细胞浸润及肺泡萎陷,HALI组、HALI+miR-21组及HALI+siPI3K+miR-21组肺损伤病理评分、肺湿/干质量比、MDA及PTEN蛋白表达升高(P<0.05);SOD、T-AOC、AFC、miR-21及p-Akt、α-ENaC、β-ENaC、γ-ENaC蛋白表达水平降低(P<0.05),以HALI+siPI3K+miR-21组最明显。与HALI组比较,HALI+miR-21组HE染色可见肺间隔增厚、炎症细胞浸润明显减少,肺泡萎陷显著减轻;肺损伤病理评分、肺湿/干质量比、MDA及PTEN蛋白表达显著降低(P<0.05);而SOD、T-AOC、AFC、miR-21及p-Akt、α-ENaC、β-ENaC、γ-ENaC蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论Ⅱ型肺泡上皮细胞来源外泌体miR-21-5p通过靶向PTEN激活PI3K/AKT信号通路调控上皮钠离子通道减轻高氧性急性肺损伤。

胍丁胺对大鼠高氧性急性肺损伤的影响

目的探讨胍丁胺对大鼠高氧性急性肺损伤(HALI)的影响,为HALI药物治疗寻找理论依据。方法清洁级SD大鼠48只,随机分为6组,每组8只(n=8),即对照组、高氧组、胍丁胺A组(胍丁胺100 mg/kg)、胍丁胺B组(胍丁胺200 mg/kg)、胍丁胺C组(胍丁胺400 mg/kg)和胍丁胺D组(胍丁胺800 mg/kg)。对照组大鼠空气中饲养,高氧组、胍丁胺A组、胍丁胺B组、胍丁胺C组和胍丁胺D组大鼠高氧箱中饲养,分别在建模48 h抽取大鼠动脉血行血气分析,计算氧合指数(OI)和呼吸指数(RI);取大鼠左下肺测量大鼠肺湿/干质量(W/D);检测肺泡灌洗液(BALF)中TNF-α、 IL-6、IL-1含量及SOD、MDA的活性。结果①与对照组比较,高氧组及胍丁胺各组大鼠OI、SOD明显降低(均P<0.05),W/D、RI、TNF-α、IL-6、IL-1明显升高(均P<0.05);与高氧组比较,胍丁胺各组大鼠OI、SOD明显增高(均P<0.05);W/D、RI、TNF-α、IL-6、IL-1明显降低(均P<0.05)。②胍丁胺A组、B组、C组之间比较,随着胍丁胺计量增加,各组大鼠OI逐渐增高,RI逐渐降低,而胍丁胺C组与胍丁胺D组大鼠之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。③对照组大鼠肺组织肺泡结构正常;高氧组及胍丁胺各组大鼠肺组织结构明显紊乱,肺泡壁断裂、破坏及融合成肺大泡,肺泡间隔明显水肿、增宽,大量炎性细胞浸润,肺泡腔内出现水肿液及炎性细胞,可见少量红细胞;但随着胍丁胺计量增加,胍丁胺B组、胍丁胺C组及胍丁胺D组大鼠肺泡结构破坏逐渐减轻,而胍丁胺C组与胍丁胺D组大鼠肺泡结构变化不大。结论胍丁胺对大鼠HALI具有明确的保护作用,且最佳保护计量可能是400 mg/kg。

胍丁胺对高氧性急性肺损伤大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡的影响

目的观察胍丁胺对高氧性急性肺损伤(HALI)大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)凋亡的影响,为HALI的药物治疗提供基础理论依据.方法按随机数字表法将24只健康SD大鼠分为正常对照组(在空气中饲养)、HALI模型组、胍丁胺预处理组(高氧处理前给予400 mg/kg的胍丁胺),每组8只.将大鼠置于氧浓度>90%,温度25~27 ℃,湿度50%~70%,二氧化碳(CO2)浓度<0.5%的自制高氧模型箱中复制HALI大鼠模型;正常对照组不进行任何处理.高氧处理48 h后取大鼠颈动脉血进行血气分析;光镜下观察肺组织病理学改变并进行评分;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组支气管肺泡灌洗液(BALF)中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL-6、IL-1)含量;采用流式细胞仪检测肺组织AECⅡ凋亡情况,并计算细胞凋亡率;采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达水平.结果与正常对照组比较,HALI模型组氧合指数(OI)、Bcl-2蛋白表达明显降低〔OI(mmHg,1mmHg=0.133 kPa):135.04±16.82比463.74±22.04,Bcl-2蛋白表达(A值):0.35±0.18比0.89±0.08,均P<0.05〕,而呼吸指数(RI)、肺组织病理学评分、TNF-α、IL-6、IL-1、AECⅡ凋亡率、Bax蛋白表达均明显升高〔RI :1.29±0.15比0.24±0.03,肺组织病理学评分(分):4.72±1.32比0,TNF-α(μg/L):44.48±1.42比14.12±0.88,IL-6(μg/L):51.46±1.62比23.20±0.89,IL-1(μg/L):44.03±2.45 比 11.64±1.34,AEC Ⅱ 凋 亡 率:(56.24±1.14)% 比(22.64±0.58)%, Bax蛋白表达(A值):2.37±0.34比1.41±0.48,均P<0.05〕.与HALI模型组比较,胍丁胺预处理组大鼠OI、Bcl-2蛋白表达明显升高〔OI(mmHg): 364.72±14.56比135.04±16.82,Bcl-2蛋白表达(A值):0.68±0.10比0.35±0.18,均P<0.05〕;而RI、肺组织病理学评分、TNF-α、IL-6、IL-1、AECⅡ凋亡率、Bax蛋白表达均明显降低〔RI : 0.45±0.09比1.29±0.15,肺组织病理学评分(分):2.30±0.96比4.72±1.32,TNF-α(μg/L):22.98±0.72比44.48±1.42,IL-6(μg/L):35.79±0.86比51.46±1.62,IL-1(μg/L):24.06±0.86比44.03±2.45, AECⅡ凋亡率:(28.58±1.21)%比(56.24±1.14)%,Bax蛋白表达(A值):1.98±0.42比2.37±0.34,均P<0.05〕.结论胍丁胺可降低HALI大鼠AECⅡ凋亡率,其机制有待进一步研究.

微小RNA-21-5p对大鼠高氧性急性肺损伤的影响

目的：探讨微小RNA-21-5p（miR-21-5p）对大鼠高氧性急性肺损伤（HALI）的影响，为HALI的基因治疗提供理论依据。方法按随机数字表法将160只SD大鼠分为高氧对照组、磷酸盐缓冲液（PBS）组、空病毒组及miR-21-5p组4组，每组40只。高氧对照组大鼠直接置于高氧箱（氧浓度＞90%）中饲养，其余3组分别经鼻腔滴入PBS、慢病毒及miR-21-5p慢病毒各200μL，然后置于高氧箱中饲养。各组分别在高氧放置0、24、48及72 h时随机取10只大鼠进行动脉血气分析，并计算氧合指数（OI）和呼吸指数（RI）；随后颈动脉放血处死大鼠取肺组织，测量左肺湿/干质量（W/D）比值，行苏木素-伊红（HE）染色，光镜下观察右肺组织病理学改变并进行病理学评分。结果高氧损伤0 h时，各组大鼠OI、RI、肺组织病理学评分、肺W/D比值差异均无统计学意义（均P＞0.05）；随着高氧损伤时间的延长，各组OI逐渐降低，RI、肺组织病理学评分、肺W/D比值逐渐升高。与高氧对照组比较，miR-21-5p组高氧损伤24、48、72 h时OI明显增加〔mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa）：24 h 时358.10±29.25比306.19±37.23，48 h 时336.67±29.27比269.70±29.00，72 h 时323.81±19.05比203.81±43.40，均P＜0.05〕，RI明显减少（24 h时0.23±0.05比0.31±0.06，48 h时0.28±0.07比0.38±0.06，72 h时0.30±0.04比0.46±0.07，均P＜0.05），肺组织病理学评分明显降低（分：24 h时0.60±0.52比0.90±0.74，48 h时1.30±0.95比2.90±1.20，72 h时1.90±0.88比4.70±1.57，均P＜0.05），肺W/D比值明显下降（24 h时3.77±0.38比4.14±0.46，48 h时3.83±0.31比4.56±0.34，72 h时3.89±0.31比5.32±0.27，均P＜0.05）。PBS组、空病毒组高氧损伤后各指标与高氧对照组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。光镜下观察可见，随着高氧损伤时间的延长，各组大鼠肺泡结构逐渐紊乱，肺泡壁断裂破坏，肺泡间隔逐渐增宽、水肿、炎性细胞浸润，部分大鼠可见少量红细胞渗出；但miR-21-5p组肺组织病理损伤程度较其他各组明显减轻。结论持续高浓度氧暴露24 h后可成功建立HALI模型；miR-21-5p对HALI大鼠肺组织具有一定的保护作用。

lncRNA-GAS5/miRNA21 ceRNA调控网络在高氧性急性肺损伤发病过程中的作用研究

目的:探究lncRNA-GAS5/miRNA21 ceRNA调控网络在高氧性急性肺损伤(HALI)发病过程中的作用。方法:SD大鼠随机分为空白组、模型组、lncRNA组和lncRNA联合miRNA组,空白组不做任何处理,lncRNA组静脉注射lncRNAGAS5过表达慢病毒载体,lncRNA联合miRNA组静脉注射lncRNA-GAS5和miR-21过表达慢病毒载体,模型组静脉注射等体积慢病毒空载体;模型组和各干预组大鼠均吸入高浓度氧气建立大鼠HALI模型。高氧处理48 h后检测大鼠动脉血氧合指数(OI)、呼吸指数(RI),ELISA检测血浆细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平,观测肺组织病理损伤,计算左肺上叶湿/干重比(W/D),AnnexinⅤ-PI凋亡染色试剂盒检测肺泡上皮细胞凋亡,RT-PCR、Western blot检测肺组织lncRNA-GAS5、miR-21、细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达及NF-κB激活情况。结果:模型组大鼠肺组织lncRNA-GAS5水平显著高于空白组,而miR-21水平显著低于空白组(P<0.01);与模型组相比,lncRNA组大鼠OI显著降低,RI、肺W/D、病理评分、肺组织凋亡细胞数、细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达、IκBα磷酸化水平及细胞核内NF-κB p65水平显著升高(P<0.01);与lncRNA组相比,lncRNA联合miRNA组大鼠OI显著升高,RI、肺W/D、病理评分、肺泡上皮凋亡细胞数、细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达、IκBα磷酸化及细胞核内NF-κB p65水平显著降低(P<0.01)。结论:lncRNA-GAS5/miRNA21轴参与HALI发病过程,lncRNA-GAS5通过负调节miR-21表达间接激活NF-κB通路,促发HALI。

沙丁胺醇减轻大鼠的高氧性急性肺损伤

背景:临床上高氧导致的高氧性急性肺损伤越来越受到人们的关注。研究显示,沙丁胺醇能够减轻大鼠的炎性反应,提高多种抗氧化物质的活性,改善微循环,从而减轻肺水肿的程度,对肺组织起到一定的保护作用。目的:探究沙丁胺醇减轻高氧性急性肺损伤的效果及其作用机制。方法:将SD大鼠分为对照组、不同时间高氧处理肺损伤模型组和不同剂量沙丁胺醇雾化给药治疗组(0.025,0.05,0.1,0.2,0.4 mg/kg)。通过测定各项生化指标确定最佳的高氧(>95%)处理时间和沙丁胺醇使用剂量;随后分别用qRT-PCR、Western-blot和苏木精-伊红染色法测定给予最佳沙丁胺醇剂量时肺损伤模型组大鼠肺组织JNK/PI3K/Akt/NF-κB/ICAM-1信号通路中mRNA和蛋白的表达以及肺脏组织的病理变化。结果与结论:①实验成功构建了高氧性急性肺损伤模型,且60 h时模型效果最佳;②最优的沙丁胺醇使用剂量为0.2 mg/kg;模型组与对照组相比,各项生化指标均出现极显著的升高或降低(P<0.05)、肺损伤模型组JNK/PI3K/Akt/NF-κB/ICAM-1信号通路相关因子(JNK,PI3K,Akt,核因子E2相关因子2,核因子κB,细胞间黏附分子1,白细胞介素8,肿瘤坏死因子)mRNA和蛋白表达水平均明显上调(P<0.05),沙丁胺醇治疗组则明显回归(P<0.05);③肺损伤模型组表现出严重的病理损伤和炎性因子浸润,沙丁胺醇可有效缓解肺损伤模型组的变化;④结果说明,沙丁胺醇可通过JNK/PI3K/Akt/NF-κB/ICAM-1信号通路来减轻高氧性急性肺损伤大鼠的肺损伤程度。

miR-21-5p过表达对大鼠高氧性急性肺损伤形态学的影响

目的探讨微小RNA-21-5p (miR-21-5p)过表达对大鼠高氧性急性肺损伤(HALI)形态学的影响,为HALI的基因治疗寻找理论依据。方法按随机数字表法将96只SD大鼠分为正常组(于空气中饲养)、HALI组(置于高氧箱中,氧浓度90%以上,温度保持在25~27℃,湿度保持在50%~70%,CO 2浓度<0.5%)、miR-21-5p组(经鼻滴入含miR-21-5p的慢病毒液200 μL,滴度6×10^6 TU/mL)3组,每组32只。各组分别于实验开始后的0、24、48、72 h随机抽取8只大鼠,取动脉血行血气分析,计算氧合指数(OI)和呼吸指数(RI);取右肺组织行苏木素-伊红(HE)染色,光镜下观察肺组织病理学改变并进行病理评分;取左肺,测量肺湿/干重(W/D)比值。结果实验开始时,各组大鼠呼吸参数、肺组织病理学改变和病理评分、肺W/D比值比较差异均无统计学意义。随时间延长,正常组各指标均无明显改变。HALI组OI逐渐下降,RI、肺病理评分及W/D比值均逐渐升高;24 h起各指标与正常组比较差异均有统计学意义[OI(mmHg,1 mmHg= 0.133 kPa):304.19±36.23比438.42±28.58,RI:0.32±0.04比0.22±0.05,肺组织病理评分(分):0.92±0.72 比0.00±0.36,肺W/D比值:4.16±0.42比3.65±0.43, P 均<0.05]。miR-21-5p组24 h起各指标均较HALI模型组明显改善[OI(mmHg):354.10±30.24比304.19±36.23,RI:0.31±0.04比0.32±0.04,肺组织病理评分(分):0.80±0.52比0.92±0.72,肺W/D比值:3.78±0.36比4.16±0.42, P 均<0.05]。随时间延长,正常组大鼠肺组织结构无明显改变;HALI模型组大鼠肺泡结构逐渐紊乱,肺泡壁断裂破坏,肺泡间隔逐渐增宽、水肿、炎性细胞浸润,部分大鼠可见少量红细胞渗出;miR-21-5p组大鼠肺组织病理损伤程度较HALI模型组明显减轻。结论 miRNA-21-5p可明显减轻大鼠HALI,对大鼠HALI肺病理学改变影响显著。

基于转录组学测序探讨高氧性急性肺损伤发生机制中的信号通路

目的观察高氧性急性肺损伤(HALI)时转录组学的变化并进行验证,进一步明确HALI时的通路变化。方法将12只健康雄性C57BL/6J小鼠按随机数字表法分为常氧组和HALI组,每组6只。常氧组小鼠置于室内正常饲养;HALI组置于高氧箱吸入95%氧气构建HALI动物模型。高氧暴露72 h后取肺组织进行转录组学测序,然后将测序所得的数据进行差异基因分析及京都基因与基因组百科全书数据库(KEGG)通路富集分析。另取肺组织,苏木素-伊红(HE)染色后,光镜下观察肺组织病理学改变;采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)对转录组学分析筛选出的HALI相关信号通路中的关键分子进行验证。结果转录组学分析显示,与常氧组比较,高氧暴露可引起小鼠肺组织中537个差异基因表达,包括239个上调基因和298个下调基因。进一步KEGG通路富集分析筛选出富集最显著的20条信号通路,排名前3位的信号通路分别为铁死亡信号通路、肿瘤抑制基因p53信号通路和谷胱甘肽(GSH)代谢信号通路;其中,铁死亡信号通路相关基因包括上调基因血红素加氧酶-1(HO-1)和下调基因溶质载体家族7成员11(SLC7A11),p53信号通路相关基因包括上调基因p53和下调基因鼠双微基因2(MDM2),GSH代谢信号通路相关基因为上调基因谷氧还蛋白1(Grx1)。光镜下显示,常氧组小鼠肺泡结构正常;HALI组小鼠肺泡隔增宽增厚,肺泡腔缩小或消失。通过RT-RCR和Western blotting进一步证实,与常氧组相比,HALI组小鼠肺组织HO-1、p53 mRNA和蛋白表达明显上调〔HO-1 mRNA(2^(-ΔΔCt)):2.16±0.17比1.00±0.00,HO-1蛋白(HO-1/β-actin):1.05±0.01比0.79±0.01,p53 mRNA(2^(-ΔΔCt)):2.52±0.13比1.00±0.00,p53蛋白(p53/β-actin):1.12±0.02比0.58±0.03,均P<0.05〕,Grx1、MDM2、SLC7A11 mRNA和蛋白表达明显下调〔Grx1 mRNA(2^(-ΔΔCt)):0.53±0.05比1.00±0.00,Grx1蛋白(Grx1/β-actin):0.54±0.03比0.93±0.01,MDM2 mRNA(2^(-ΔΔCt)):0.48±0.03比1.00±0.00,MDM2蛋白(MDM2/β-actin):0.57±0.02比1.05±0.01,SLC7A11 mRNA(2^(-ΔΔCt)):0.50±0.06比1.00±0.00,SLC7A11蛋白(SLC7A11/β-actin):0.72±0.03比0.98±0.01,均P<0.05〕。结论HALI与铁死亡、p53、GSH代谢信号通路密切相关,靶向上述信号通路中的关键靶点可能是防治HALI的重要策略。

非编码RNA在高氧性急性肺损伤中作用的研究进展

高氧性急性肺损伤(HALI)是临床氧疗的一种主要并发症,在成人主要表现为急性呼吸窘迫综合征(ARDS),在婴幼儿则会导致支气管肺发育不良(BPD),严重影响患者的预后与生活质量,因此越来越受到人们的重视。然而,HALI的发病机制复杂且不明确,目前也无明确的治疗方法。非编码RNA(ncRNA)是一类重要的功能RNA转录体,由于缺少有效开放阅读框,并不具备编码蛋白质的功能;但是,ncRNA仍可在多水平调控基因表达,从而影响多种疾病的发生发展。近年来已有大量体内外研究表明,ncRNA在HALI发生发展过程中具有重要作用。本文就ncRNA在HALI中的表达及意义进行综述,旨在为HALI的防治提供新的诊疗思路。

微小RNA-21-5p通过激活PI3K/Akt信号通路调控Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡减轻大鼠高氧性急性肺损伤

目的探讨微小RNA-21-5p(miR-21-5p)是否通过激活磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路调控Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)凋亡减轻高氧性急性肺损伤(HALI)。方法将72只雄性SD大鼠按随机数字表法分为常氧对照组、HALI组、PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002+HALI组(LY+HALI组)、miR-21-5p过表达+LY294002+HALI组(miR-21-5p+LY+HALI组)、miR-21-5p过表达+HALI组(miR-21-5p+HALI组)及二甲基亚砜(DMSO)+HALI组,每组12只。用95%氧气制备HALI动物模型;常氧对照组动物在常氧状态下正常饲养。制模前3周经气管导管滴入200μL滴度(1×10^(12) TU/mL)的miR-21-5p腺相关病毒载体AAV6-miR-21-5p转染肺组织;DMSO及LY294002均以0.3 mg/kg于制模前1 h经尾静脉给药。制模后48 h,取颈动脉血检测氧合指数(OI)及呼吸指数(RI),采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测miR-21-5p表达;取肺组织,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测炎症因子〔肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素(IL-6、IL-1β)〕水平,测定肺湿/干质量(W/D)比值,苏木素-伊红(HE)染色后光镜下观察肺组织病理学改变并进行病理学评分。每组取6只大鼠提纯AECⅡ细胞,应用流式细胞仪检测凋亡率,采用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)和PI3K/Akt信号通路蛋白的表达水平。结果与常氧对照组比较,高氧暴露后可见肺泡间隔增厚,大量炎症细胞浸润,RI、炎症因子、肺W/D比值、病理学评分,以及AECⅡ细胞早期凋亡率、PTEN蛋白表达和Akt磷酸化水平均升高,而OI及miR-21-5p表达降低,说明模型制备成功。LY294002预处理后,可进一步加重HALI大鼠肺组织病理损伤,RI、炎症因子、肺W/D比值均较HALI组进一步升高,OI进一步降低,同时可促进AECⅡ细胞凋亡,进一步上调PTEN蛋白表达,并抑制Akt磷酸化;而miR-21-5p预处理可负向调控PTEN,激活PI3K/Akt信号通路,抑制AECⅡ细胞凋亡,减轻HALI,与LY+HALI组比较,炎症因子水平降低〔TNF-α(μg/L):100.33±3.48比116.55±2.53,IL-6(ng/L):141.06±3.70比161.31±3.59,IL-1β(μg/L):90.82±3.69比112.23±2.87,均P<0.05〕,RI、肺损伤病理学评分、肺W/D比值及AECⅡ细胞早期凋亡率明显降低〔RI:0.81±0.02比1.05±0.07,病理学评分(分):0.304±0.008比0.359±0.007,肺W/D比值:5.29±0.03比5.52±0.08,细胞凋亡率:(27.20±2.34)%比(34.17±1.49)%,均P<0.05〕,OI、miR-21-5p表达均明显升高〔OI(mmHg,1 mmHg≈0.133 kPa):266.71±2.75比230.12±4.04,miR-21-5p(2^(-ΔΔCt)):2.21±0.13比0.33±0.03,均P<0.05〕,且AECⅡ细胞PTEN蛋白表达显著降低(PTEN/GAPDH:0.50±0.06比0.93±0.06,P<0.05),Akt磷酸化明显增加〔磷酸化Akt(p-Akt)蛋白(p-Akt/GAPDH):0.86±0.05比0.56±0.06,P<0.05〕。结论miR-21-5p可能通过负向调控PTEN激活PI3K/Akt信号通路,从而抑制AECⅡ细胞凋亡,减轻HALI。

蟛蜞菊内酯通过调控铁死亡减轻高氧性急性肺损伤

目的探讨蟛蜞菊内酯是否通过调控铁死亡从而减轻高氧性急性肺损伤(HALI),为HALI的药物治疗提供理论依据。方法将24只C57BL/6J小鼠按随机数字表法分为常氧对照组、HALI模型组和蟛蜞菊内酯预处理组,每组8只。蟛蜞菊内酯预处理组经腹腔注射50 mg/kg蟛蜞菊内酯预处理6 h,其余两组不进行任何预处理;之后维持制模仓内二氧化碳含量<0.5%、氧含量>90%48 h构建HALI模型,常氧对照组置于室内空气中。制模后处死小鼠取肺组织,光镜下观察肺组织病理学改变并进行病理学评分,计算肺湿/干质量比值(W/D);检测肺组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL-6、IL-1β)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)水平;采用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测肺组织谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)蛋白表达。结果光镜下可见HALI模型组小鼠肺泡结构破坏,肺泡和肺间质有大量中性粒细胞浸润且肺间质增厚;肺损伤病理评分(分:0.75±0.02比0.11±0.01)和肺W/D比值(6.23±0.34比3.68±0.23)较常氧对照组明显升高(均P<0.05)。蟛蜞菊内酯预处理组小鼠肺泡腔清晰,中性粒细胞浸润和肺间质厚度不及HALI模型组,肺损伤病理评分(分:0.43±0.02比0.75±0.02)和肺W/D比值(4.56±0.12比6.23±0.34)较HALI模型组明显降低(均P<0.05)。与常氧对照组比较,HALI模型组肺组织SOD(kU/g:26.41±4.25比78.64±3.95)、GSH(mol/g:4.51±0.33比12.53±1.25)明显降低(均P<0.05),而MDA(mmol/g:54.23±4.58比9.65±1.96)、TNF-α(μg/L:96.32±3.67比11.65±2.03)、IL-6(ng/L:163.35±5.89比20.56±3.63)、IL-1β(μg/L:72.34±4.64比15.64±2.47)均明显升高(均P<0.05),GPX4蛋白表达明显降低(GPX4/β-actin:0.44±0.02比1.00±0.09,P<0.05)。与HALI模型组比较,蟛蜞菊内酯预处理组SOD(kU/g:53.28±3.69比26.41±4.25)、GSH(mol/g:9.99±0.13比4.51±0.33)明显升高(均P<0.05),MDA(mmol/g:25.36±1.98比54.23±4.58)、TNF-α(μg/L:40.25±4.13比96.32±3.67)、IL-6(ng/L:78.32±4.65比163.35±5.89)、IL-1β(μg/L:30.65±3.65比72.34±4.64)均明显降低(均P<0.05),GPX4蛋白表达明显升高(GPX4/β-actin:0.68±0.04比0.44±0.02,P<0.05)。结论蟛蜞菊内酯可通过调控铁死亡从而减轻HALI。

miR-21-5p过表达对高氧性急性肺损伤大鼠AECⅡ早期凋亡的影响

目的探讨微小RNA-21-5p(miR-21-5p)过表达对高氧性急性肺损伤(HALI)大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)早期凋亡的影响。方法按随机数字表法将SD大鼠分为对照组(CON组)、高氧组(H组)、过表达组(OE组)及空载体组(EV组)4组,每组20只。以吸入90%以上高浓度氧制备HALI动物模型;CON组则吸入空气。OE组及EV组分别经气管导管往肺内滴入miR-21-5p腺相关病毒-?6(AAV-6)过表达载体或空载体,饲养3周后制备HALI模型。各组于制模0、24、48、60h分别取5只动物,检测肺损伤相关指标,如氧合指数(OI)、呼吸指数(RI)、肺湿/干重比值(W/D)、肺组织病理评分;同时采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测AECⅡ中miR-21-5p表达,用流式细胞仪检测AECⅡ早期凋亡率。结果①肺损伤相关指标:H组OI随时间延长逐渐降低,RI、肺W/D比值及病理评分均随时间延长逐渐增高,24h即与CON组差异有统计学意义〔OI(mmHg,1mmHg=0.133kPa):336.04±5.79比400.22±19.70,RI:0.20±0.02比0.10±0.06,肺W/D比值:5.04±0.09比4.85±0.09,肺组织病理评分(分):0.13±0.01比0.07±0.01,均P<0.05〕,表明持续吸入高浓度氧可成功建立HALI模型。②miR-21-5p表达:H组、OE组及EV组AECⅡ细胞中miR-21-5p表达均随时间延长逐渐增高,且24、48、60h时miR-21-5p表达均显著高于CON组。OE组0、24、48、60h时miR-21-5p表达较H组进一步增高(2-ΔΔCt:3.75±0.11比0.98±0.14,3.98±0.12比1.18±0.13,4.28±0.18比1.49±0.06,4.66±0.12比1.80±0.12,均P<0.05)。③AECⅡ早期凋亡率:H组、OE组及EV组AECⅡ细胞早期凋亡率均随时间延长逐渐升高,且24、48、60h时细胞早期凋亡率均显著高于CON组。而OE组24、48、60h时AECⅡ早期凋亡率较H组显著降低〔(1.22±0.63)%比(2.84±0.59)%,(5.76±0.18)%比(13.10±2.01)%,(29.48±0.48)%比(49.04±1.36)%,均P<0.05〕。④EV组各时间点miR-21-5p表达和AECⅡ早期凋亡率与H组比较差异均无统计学意义。结论miR-21-5p过表达可抑制HALI大鼠AECⅡ早期凋亡。

信号转导和转录激活蛋白STAT1/3/5在高氧性急性肺损伤中的作用及机制研究

目的探讨信号转导和转录激活蛋白(STAT1/3/5)是否对高氧性急性肺损伤(HALI)具有保护作用及其机制。方法将70只C57BL/6J小鼠按随机数字表法分为常氧对照组、HALI组、STAT1/3/5抑制剂组共5组,每组14只。在90%以上高氧中暴露48 h建立HALI模型;3个STAT抑制剂组分别于制模前1周腹腔注射STAT1抑制剂40 mg/kg、STAT3抑制剂5 mg/kg、STAT5抑制剂10 mg/kg,连续预处理1周。每组随机取6只采血,采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测微小RNA-21(miR-21)表达。随后处死小鼠取肺组织,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL-6、IL-1β)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、基质金属蛋白酶9(MMP9)含量,计算肺组织含水量,在光镜下观察肺组织病理学变化并进行肺损伤病理评分,采用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测肺组织磷酸化STAT(p-STAT1、p-STAT3、p-STAT5)表达。采用Kaplan-Meier生存曲线分析每组剩余8只小鼠7 d累积生存率。结果光镜下可见HALI组及STAT1抑制剂组肺泡结构破坏,肺泡和肺间质大量中性粒细胞(NEU)浸润,肺间质增厚,肺损伤病理评分及肺组织含水量明显升高;STAT3抑制剂组和STAT5抑制剂组肺泡腔清晰,NEU浸润程度和肺间质厚度不及HALI组,肺损伤病理评分和肺组织含水量明显降低,STAT3抑制剂组更为明显。与常氧对照组比较,HALI组TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA和MMP9含量及p-STAT3、p-STAT5表达水平均明显升高,而SOD和miR-21表达则明显下降。与HALI组比较,STAT3抑制剂组及STAT5抑制剂组TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA和MMP9含量均明显下降,而SOD及miR-21表达明显升高,以STAT3抑制剂组更为明显〔TNF-α(μg/L):42.53±3.25比86.36±5.48,IL-6(ng/L):68.46±4.28比145.00±6.89,IL-1β(μg/L):28.74±3.53比68.00±5.64,MDA(μmol/g):20.33±2.74比42.58±3.45,MMP9(ng/L):128.55±6.35比325.13±6.65,SOD(kU/g):50.53±4.19比22.53±3.27,miR-21(2-ΔΔCt):0.550±0.018比0.316±0.037,均P<0.05〕。Kaplan-Meier生存曲线分析显示,STAT3抑制剂组和STAT5抑制剂组7 d累积生存率均明显高于HALI组〔62.5%(5/8)、37.5%(3/8)比12.5%(1/8),均P<0.05〕。结论抑制STAT3过度活化可能通过miR-21的表达抑制炎症反应,调控氧化应激并改善肺通透性,在HALI中发挥肺保护作用。

新生大鼠高氧性肺损伤肺组织中AQP1、α-ENaC蛋白和mRNA表达及呋塞米雾化的干预作用

目的 探讨呋塞米雾化对新生大鼠高氧肺损伤的保护作用.方法 将新生SD大鼠随机分为空气组、高氧组和干预组,比较肺组织病理改变、肺组织AQP1,α-ENaC蛋白及mRNA表达情况.结果 空气组中的实验动物反应好,高氧组实验动物表现脱氧后烦躁不安,呼吸困难明显,其中1 只实验动物死亡.而干预组中的实验动物一般活动情况较高氧组明显改善.三组中高氧组肺组织形态与结构改变最为严重.在实验3、7、14 d时,高氧组肺组织AQP1蛋白及mRNA表达水平低于空气组(P<0.05),干预组肺组织AQP1蛋白及mRNA表达水平在实验3、7、14 d时均与空气组接近,明显高于高氧组,差异有统计学意义(P<0.05).在实验3、7、14 d时,高氧组肺组织α-ENaC的蛋白及mRNA表达水平较空气组明显下降(P<0.05),而干预组肺组织α-ENaC蛋白及mRNA表达水平较高氧组明显升高,其差异具有统计学意义(P<0.05).结论 雾化吸入呋塞米可能通过上调AQP1、α-ENaC的蛋白表达水平及mRNA表达水平,改善肺功能,从而对高氧性肺损伤起到一定保护作用.

右美托咪定通过抑制核因子-κB通路减轻高氧急性肺损伤的作用机制

目的探究右美托咪定是否通过抑制核因子-κB(NF-κB)通路缓解大鼠高氧诱导急性肺损伤(HALI)。方法将HALI模型大鼠分为模型组、对照组和低、中、高剂量实验组,每组15只;另取15只相同条件下暴露在空气中饲养的大鼠作为假手术组。假手术组和模型组均予以等量0.9%Na Cl,腹腔注射;对照组予以5 mg·kg-1SC75741,腹腔注射;低、中、高剂量实验组分别予以25,50和100μg·kg-1右美托咪定,腹腔注射。用免疫印迹法检测p-JAK激酶2(JAK2)、p-信号传导和转录活化因子3(STAT3)和NF-κB蛋白表达。结果低、中、高剂量实验组和模型组、对照组、假手术组的p-JAK2蛋白相对表达水平分别为(0.63±0.08),(0.58±0.06),(0.32±0.07),(0.88±0.05),(0.23±0.06)和(0.16±0.03),p-STAT3蛋白相对表达水平分别为(0.75±0.03),(0.51±0.11),(0.37±0.05),(0.98±0.12),(0.21±0.03)和(0.15±0.03),NF-κB蛋白相对表达水平分别为(0.78±0.09),(0.64±0.13),(0.48±0.08),(0.95±0.09),(0.21±0.03)和(0.22±0.03),模型组的上述指标与低、中、高剂量实验组、假手术组和对照组相比,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论右美托咪定能够通过抑制NF-κB通路激活,从而发挥对HALI大鼠的保护作用。

微小RNA-21-5p靶基因调控自噬的相关研究进展

自噬是降解细胞内蛋白质和受损细胞器的一个动态过程,维持着细胞内的环境稳定,并为细胞的存活提供良好条件。高氧性急性肺损伤(HALI)是临床氧疗的严重并发症之一。HALI的发病机制尚不明确,已有研究表明自噬参与了HALI的发生过程。调控自噬的通路机制众多,包括磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路、丝裂素活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)信号通路、磷酸腺苷依赖性蛋白激酶/unc-51类自噬激活激酶1(AMPK/ULK1)信号通路以及转化生长因子-β(TGF-β)、叉头转录因子O1(FoxO1)和Ras三磷酸腺苷酶超家族成员Rab11a参与的信号通路,上述信号通路相关基因作为微小RNA-21-5p(miR-21-5p)靶基因在众多疾病中具有调控自噬活性的作用。本文就miR-21-5p靶基因调控自噬的各信号通路进行综述,以期寻找到有关HALI中miR-21-5p靶基因调控自噬发挥肺保护作用机制的线索,也为后续基础研究提供相关理论依据。