一种新型无细胞真皮基质的研制

目的:研制一种新型的无细胞真皮基质。方法:用高渗盐除去异体皮肤的表皮细胞,经戊二醛交联后以低浓度NaOH消蚀以除去真皮中的细胞成分,得到无细胞真皮基质。结果:皮肤中所有细胞成分都被消除,胶原纤维稍松散,结构完整,排列正常。结论:经高渗盐-NaOH消蚀法能完全去除皮肤中的细胞成分而不损伤胶原纤维的三维结构,制备过程简单,具有很大的临床应用价值。

戊二醛交联优化脱细胞真皮基质的生物相容性

目的通过体内包埋实验将优化的脱细胞真皮基质(ADM)与成纤维细胞(FB)体外培养,探讨是否具有生物相容性。方法用高渗盐-NaOH消蚀法制备得到大鼠ADM,用低浓度戊二醛交联ADM,未交联A组(0min)作为对照,根据交联时间不同分成B组(10min)、C组(15min)和D组(30min)。通过大鼠体内包埋实验对比各组ADM物理性状、包埋后面积、炎性反应、浸润生长的FB和毛细血管数目,选择出最佳交联时间。制备优化的人ADM,用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测ADM的细胞毒性;人FB与ADM复合培养检测其细胞相容性,用免疫组织化学和透射电镜观察FB的生长和增殖情况;反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测FBⅠ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达。结果大鼠体内包埋实验显示,4周取材,未交联组不易触及移植物,植入物和周围的软组织基本融合难以分开;未交联组ADM的面积较包埋前缩小;未交联组ADM内有少量炎性细胞,胶原纤维嗜酸性弱;交联组ADM内未见炎性细胞,浸润生长的FB数目、血管数目与戊二醛交联时间的单因素相关性分析呈负相关;最佳的交联时间为10min。体外培养显示,优化ADM的细胞毒性反应0～1级;人FB能够很好地在优化的ADM表面贴附、生长和增殖;ADM内FBⅠ型、Ⅲ型前胶原mRNA的表达降低。结论高渗盐-NaOH消蚀法制备ADM,工艺简单、成本低、生物相容性好,可以提供细胞生长的空间,并可在细胞间转导通讯和信号,下调细胞外基质代谢系统。

ADM调控细胞生长的生物学性质及修复皮肤缺损的实验研究

目的:探讨高渗盐-NaOH消蚀法制备脱细胞真皮基质(acellular dermal matrix,ADM)调控成纤维细胞(fibroblast,FB)生长的生物学性质并进行皮肤缺损修复的动物实验。方法:用高渗盐-NaOH消蚀法制备得到人ADM,将人FB与ADM体外复合培养,免疫组化和透射电镜鉴定细胞生长和增殖情况;通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测FBⅠ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达。同样方法制备大鼠ADM,观察其结构;制备SD大鼠全厚皮肤缺损的模型,将ADM移植到创面进行修复。术后2周、4周、6周对修复创面进行大体形态学和组织学观察。结果:人FB可以在ADM上贴附、生长和增殖;与培养板上的人FB相比,ADM内FBⅠ型、Ⅲ型前胶原mRNA的表达降低。鼠ADM三维结构完整,排列整齐;移植后6周,皮肤表面光滑韧性好;表皮、真皮交界处乳头状结构出现,表皮细胞分化良好,约7～8层细胞,真皮内胶原纤维排列整齐。结论:ADM具有良好的调控细胞生长的生物学特性,修复皮肤创伤效果好。

成纤维细胞与脱细胞真皮基质复合培养的实验研究

目的本研究用酶消化法体外培养高纯度的人皮肤成纤维细胞(FB),将FB与高渗盐-氢氧化钠(NaCl-NaOH)消蚀法制作的人脱细胞真皮基质(ADM)复合培养并评价其生物相容性。方法中性蛋白酶-Ⅰ型胶原酶消化法体外培养人FB,通过组织学方法鉴定其纯度。携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒(Ad-GFP)转染人FB,组织学方法观察荧光蛋白的表达情况,流式细胞仪检测转染比例。将FB和Ad-GFP转染的FB接种在NaCL-NaOH消蚀法制作的人ADM上,组织学方法观察细胞的生长和增殖情况;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测ADM内FB角质细胞生长因子(KGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)mRNA的蛋白表达。结果体外培养的人FB形态为细长梭形,有较长的突起和明显的核分裂相,波形蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白的表达均为阳性。Ad-GFP转染FB的比例为72%。复合培养显示人FB不仅黏附在ADM表面,还可以较为均匀地在ADM天然孔隙中生长和增殖;与正常FB比较,ADM内FB KGF、bFGF mRNA的蛋白表达无明显变化。结论中性蛋白酶-Ⅰ型胶原酶消化法体外可以培养出高纯度的人FB。Ad-GFP转染FB获得成功。NaCL-NaOH消蚀法制作的ADM蕴含丰富的生物信息,FB作为种子细胞与其生物相容性好,为进一步开展皮肤创伤修复的实验研究奠定了基础。