发芽小麦高温α-淀粉酶挤压膨化工艺优化

为解决酿造食品工业中小麦原料还原糖和阿魏酸含量低的问题,利用高温α-淀粉酶挤压膨化处理技术对发芽小麦进行预处理,基于外源酶、内源酶与高温膨化共同作用促进原料中淀粉水解,以期提高其中的还原糖和阿魏酸含量。通过单因素和正交试验,确定最佳工艺条件为物料水分30%、加酶量0.18%、末端机筒温度90℃、螺杆转速80 r/min。在此条件下,还原糖和阿魏酸含量分别为38.39%和3.78 mg/g。与小麦原料和单一发芽处理相比,还原糖含量分别提高481.67%和20.95%,阿魏酸含量分别提高131.90%和38.97%。通过冷场发射扫描电镜(cold field emission scanning electron microscope,Cold FESEM)、傅里叶转换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)、高效体积排阻色谱(high performance size exclusion chromatography,HPSEC)表征,观察到发芽小麦的淀粉结构被破坏,其结晶度、短程有序度、重均分子量降低。高温α-淀粉酶挤压膨化处理发芽小麦能够促进还原糖的生成和阿魏酸的释放,为后续发酵食品的生产提供更好的发酵条件和更多的风味前体物质。

一株热反硝化地芽孢杆菌Y62产耐高温α-淀粉酶的异源表达

为获得耐高温α-淀粉酶的菌株,该研究从常年覆盖热油的土壤中分离筛选产耐高温淀粉酶的细菌,通过形态学、生理生化分析和16S rRNA鉴定菌株种属,对筛选出的菌株进行中试工程化发酵产酶,下游酶分离中利用简便的硫酸铵沉淀法分离粗酶,并且对分离纯化的耐高温淀粉酶提取物进行热稳定评价。克隆菌株耐高温淀粉酶的基因序列并用于构建表达载体,在大肠杆菌BL21中成功进行异源表达,并对所产淀粉酶进行生物信息学分析。结果表明:通过筛选获得一株产淀粉酶的热反硝化地芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)Y62,中试放大后在48 h取得112.7 U/mL酶活,其粗酶回收率可达90.2%。该淀粉酶具有良好的耐高温特性,在100℃下仍能保持37.8%的活性。异源表达产物以包涵体的形式存在,改变诱导条件后溶出可溶性蛋白,纯化产物经过质谱鉴定后确定该淀粉酶为α-淀粉酶。生物信息学分析及预测表明该耐高温淀粉酶编码511个氨基酸,分子量为59.86 kDa,含2个跨膜区域、3个催化位点和2个Ca2+结合位点,与已报道的α-淀粉酶GTA相似。

高温α-淀粉酶产生菌株的选育

从西藏当雄温泉附近的土壤中,分离到一株能在55℃生长并分泌高温α 淀粉酶的菌株,经初步鉴定为凝结芽孢杆菌,命名为BacilluscoagulansLS 1.该菌株用紫外线和亚硝基胍诱变,在55℃摇瓶培养条件下,筛选到一个发酵液酶活达到100U/mL的突变株,较出发菌株的酶活提高了约25倍.发酵液经90℃处理60min,酶活性保持在90%以上.

耐高温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达

高温α-淀粉酶是发酵行业用量最大的酶类,为了实现高温α-淀粉酶基因的高效表达,本研究比较了不同启动子对地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中表达的影响.分别用强启动子P43和地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基因自身启动子构建了表达载体pP43NMK-amy和pUBC19-amy,并在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis1A752S中进行表达.结果表明,与地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基因自身启动子相比,采用P43启动子的耐高温α-淀粉酶其表达水平提高了8.9倍.而且在枯草芽孢杆菌B.subtilis1A752S中分泌表达的α-淀粉酶仍具有耐高温的特性,酶反应的最适温度为90℃,表明酶的热稳定性由蛋白质本身的氨基酸序列决定的.

地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及其产物的分泌

以耐高温α 淀粉酶生产菌地衣芽孢杆菌染色体DNA为模板 ,通过PCR扩增耐高温α 淀粉酶基因 ,将扩增产物 1 9kb的DNA片段插入到pUC1 9质粒中 ,再转化大肠杆菌JM1 0 9,通过在淀粉平板上形成透明圈等方法筛选到一株阳性克隆菌株JM1 0 9(pUAM) ,其表达产物可分泌到培养基中 ,除去菌体的发酵液中每 1 0 0mL酶活可达到 2 7个单位。将发酵上清液浓缩后用冷无水乙醇分级沉淀 ,所得样品进行SDS PAGE分析 ,得到分子质量为 60ku的目的蛋白带。

耐高温α-淀粉酶高密度高表达发酵条件的优化

通过摇瓶实验对产耐高温α-淀粉酶的重组菌E.coli BL21的高密度高表达发酵条件进行研究。考察不同培养基和不同发酵条件对该菌株产耐高温α-淀粉酶的影响,并利用正交试验进行优化。结果表明:在葡萄糖0.5g/L,酵母粉15g/L,pH6.5,诱导时机为接种后发酵4h,诱导时间为6h,IPTG添加量为0.8mmol/L,接种量为体积分数3%的优化条件下,该重组菌发酵液菌体生物量为原来的1.29倍,酶活力达到8.754U/mL,是原来的1.55倍,目的蛋白的表达量也为原来的1.24倍。

地衣芽孢杆菌WB-11菌株耐高温α-淀粉酶的酶学特性

从地衣芽孢杆菌 (Bacilluslicheniformis )中分离到一α 淀粉酶组分 ,经PAGE及SDS PAGE检测为电泳均一的纯酶蛋白。该酶最适反应温度为 95℃ ,5 0和 70℃条件下酶活性稳定 ,90℃保温 30min残余酶活力为 2 8 9%。该酶最适作用pH为 6 0～ 6 5 ,在pH 5 0～ 8 0内稳定。酶的相对分子质量为 6 5 90 0 ,等电点 6 94 ,对可溶性淀粉的Km 值为 0 4 1mg·mL-1 。Ca2 + 、Mn2 + 、Cu2 + 、Co2 + 及Ba2 + 对酶具有激活作用 ,其中Ca2 + 激活作用最显著 ,且以 4～ 8mmol·L-1 浓度为最适。Ca2 + 还能显著提高酶的热稳定性 ,4mmol·L-1 Ca2 + ,90℃保温 30min ,酶的残余活力提高至 83%。

溶氧等参数对耐高温α-淀粉酶发酵的影响

利用耐高温α-淀粉酶的生产菌种—地衣芽孢杆菌IIY-1菌株,对其发酵过程中的各种参数的变化规律与控制方式进行了研究。实验结果表明,采用连续式的pH值的控制方式有利于提高耐高温α-淀粉酶的发酵水平,最后的发酵液的酶活力明显地高于脉动式的pH值控制方式。菌体在产酶阶段对发酵液的溶氧水平要求不高,但是溶氧浓度(DO值)不应低于10%。

荞麦淀粉耐高温α-淀粉酶液化工艺条件研究

利用耐高温α-淀粉酶能将底物同步糊化和液化的特性,通过单因素和正交试验对耐高温α-淀粉酶水解荞麦淀粉的动力学参数和最适反应条件进行了测定。结果表明:耐高温α-淀粉酶的最适温度为80～85℃,最适pH为5.0～6.5;该酶水解荞麦淀粉的Km为4.967 4mg/mL,Vm为0.344 8mg/(mL·min);该酶水解养麦淀粉的优化工艺条件为荞麦淀粉浆浓度25%,温度为83℃,pH 6.5,酶用量40 U/g,液化时间15 min。荞麦淀粉液化液糖化后的DE值为89.87%。

高温α-淀粉酶-挤压膨化耦合处理对全谷物糙米粉品质的影响

以普通糙米、红米和黑米为原料,分析了高温α-淀粉酶-挤压膨化耦合处理对全谷物糙米粉径向膨化率、水溶性指数、吸水性指数、分散时间、结块率、黏度、糊化度以及还原糖、总蛋白质含量和可溶性蛋白质含量的影响。结果表明:3种全谷物糙米经过高温α-淀粉酶-挤压膨化耦合处理后其径向膨化率和糊化度均显著降低(P<0.05);水溶性指数显著升高(P<0.05)了2.51倍、1.89倍和2.73倍,吸水性指数显著降低(P<0.05)了77.29%、33.41%和67.44%;分散时间和结块率均显著降低(P<0.05),分散时间分别减少了64.60%、60.66%和65.40%,结块率分别降低了75.57%、84.64%和75.24%;冲调黏度均显著下降(P<0.05),加酶处理的糙米粉在低剪切速率下具有较低黏度,其黏度曲线趋于平直;还原糖和可溶性蛋白质含量显著提高(P<0.05),总蛋白质含量提高不显著(P>0.05)。

耐高温α-淀粉酶产生菌的选育研究

从土壤中分离到1株能在55℃生长并分泌耐高温α-淀粉酶的菌株,其最适生长pH值为7.0～8.0,最适生长温度50℃。该菌株经初步鉴定为芽孢杆菌,疑似微地衣芽孢杆菌,命名为DG-1。对该菌株分泌的耐高温α-淀粉酶的性质研究表明,最适作用pH值为7.0,在pH6.0～7.5的范围内有较高酶活。最适反应温度为95℃,95℃保温60min处理后酶活仅损失4.73%。经紫外线诱变处理,得到菌株DG-4,酶活较出发菌株提高了104.6%。

温度和pH值对耐高温α-淀粉酶活力的影响

本文系统的研究了温度、pH值和底物浓度对地衣芽孢杆菌HM - 3产生的耐高温α -淀粉酶酶活力的影响。研究结果表明 :地衣芽孢杆菌HM - 3耐高温α -淀粉酶的最适酶促反应温度为 :75℃ - 85℃之间 ,最适作用的pH值为 :6 .1- 7.0之间 ,该酶用于玉米淀粉的液化其最适底物浓度是 2 0 %～ 2 5 %。

耐酸耐高温α-淀粉酶的研究进展

介绍了耐酸耐高温α-淀粉酶在工业生产中具有经济、节能、方便操作等优势;并且概述了耐酸耐高温α-淀粉酶的菌种来源,其中耐酸性α-淀粉酶的菌种主要来源于芽孢杆菌、曲霉以及嗜热真菌;耐高温α-淀粉酶的菌种主要来源于凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和嗜热网络球杆菌等;本文还对耐酸耐高温α-淀粉酶的菌种选育技术方法包括物理方法、化学方法以及基因操作技术等进行了阐述。研究发现对耐酸耐高温α-淀粉酶的发酵工艺进行优化后,最高可以使酶活提高2.1倍;同时在对该淀粉酶的钙离子依赖性进行研究中,得出某些耐酸耐高温α-淀粉酶具有不依赖Ca2+的特性;最后预测人们将会运用基因工程等技术手段,不断地开发出各种特性的耐酸耐高温性α-淀粉酶。

高温α-淀粉酶菌的产酶条件、酶性质与环境应用研究

从堆肥中筛选到一株能在55℃生长并分泌高温α-淀粉酶的菌株,经初步鉴定为地衣芽孢杆菌,命名为Bacillus licheniformis ZD-8.在液体筛选培养基的碳源为乳糖、氮源为(NH4)2SO4,通气量为10%、pH值及C/N比分别为8和3/1、65℃的条件下,培养24h的菌株产酶量最高.酶学性质研究表明,该酶最适pH值为8,最适反应温度为95℃;95℃下保温60min后酶活仅损失4.8%;较低浓度Ca2+存在下,该酶即可有很好的稳定性.污泥有机质降解实验表明,培养了22h的菌株对污泥有机质降解能力最强;将高温α-淀粉酶活性增加2倍后(为2×104U.mL-1),添加到经过不同处理的污泥中,其有机质降解率、脱氢酶增加率和SOUR增加率平均增加17.1%、76.9%、27.3%;在污泥中添加0.1mmo.lL-1CaCl2后,其有机质降解率、脱氢酶增加率、SOUR增加率平均增加7.1%、20.4%、3.4%.

来源于Pyrococcus furiosus的耐高温α-淀粉酶基因在衣藻叶绿体中的表达

来源于Pyrococcusfuriosus的耐高温α-淀粉酶是一种重要的酒精工业用酶,在植物中表达耐高温α-淀粉酶可以大大降低用植物秸秆生产酒精的成本。选择衣藻叶绿体基因组同源片段clpP-trnL-petB-chlL-rpl23-rpl2和壮观霉素抗性基因,构建了来源于Pyrococcusfuriosus的耐高温α-淀粉酶基因的衣藻叶绿体表达载体p64A。通过基因枪将其导入衣藻叶绿体中,经壮观霉素抗性(100mg/L)筛选,获得了9个抗性衣藻转化子。转化子经过抗性继代筛选后,经PCR、Southernblot检测分析及暗培养,证实耐高温α-淀粉酶基因已整合到衣藻叶绿体基因组中并得到表达。酶活性检测表明,转基因衣藻表达产物具有耐高温α-淀粉酶活性,每克鲜重衣藻最高达77.5u。实验结果证明在植物叶绿体中表达工业酶制剂是可行的。

高温α-淀粉酶产生菌的筛选及酶学性质研究

从酒厂高温曲中筛选到一株产高温α-淀粉酶的野生菌株,经初步鉴定为链霉菌,命名为Streptomyces sp.1109。在45℃条件下,该菌株固体发酵产酶活力达到169.13 u/g。通过酶学性质研究,该酶反应最适温度为85℃,最适pH为6.5,具有较高的热稳定性。

枯草芽孢杆菌工程菌产耐酸性高温α-淀粉酶发酵条件的优化

利用基因工程手段获得的产耐酸性高温α-淀粉酶基因枯草芽孢杆菌工程菌株pWB-amyd/WB600,通过单因素筛选及正交实验进行发酵培养基优化,得到的最佳配方为(g/L):玉米粉20,蛋白胨30,CaCl20.5,Na2HPO48.同时对实验室摇瓶条件下液体发酵的主要影响因素初始pH、接种量、装液量、转速、温度等进行探讨,确定了最佳培养条件:37,℃、pH 6.5、200,r/min摇床培养36,h,接种量为2%,装液量为30,mL/250,mL.在此优化条件下,耐酸性高温α-淀粉酶活力达到3,980,U/mL,是未优化条件下的2.1倍.

耐酸性高温α-淀粉酶突变基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

利用表达载体pET-30a，实现了去信号肽的耐酸性高温α-淀粉酶突变基因amyd及未突变的高温”淀粉酶基因amy在大肠杆菌BL21（DE3）中的高效表达。经多步纯化，重组酶AMY及AMYD的比活分别达到312．7U／mg蛋白和354．6U／mg蛋白，纯化倍数分别为75．90和83．83，获得凝胶电泳条带单一的蛋白样品，经SDS-PAGE检测，AMY及AMYD酶分子质量均为63．5ku。重组酶AMY的最适温度80℃，最适反应pH为6．5，在温度低于90℃，反应pH5．5～7时，酶活较稳定。重组酶AMYD的最适温度80℃，最适反应pH为4．5，在温度低于90℃，反应pH4．0～6．5时，酶活较稳定。

地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶的组成及光谱学性质

a-Ⅲ是地衣芽孢杆菌变异株A．4041高温a-淀粉酶中的主要组分，每分子含10个钙原子，氨基酸分析表明：a-Ⅲ富含丝氨酸（17．9％），天门冬氨酸和谷氨酸（包括酰胺）占20．7％，碱性氨基酸占7．7％。紫外光谱的最大和最小吸收分别在278nm和249nm，荧光光谱的最大激发波长和发射波长分别为282nm和340nm。远紫外CD谱显示222nm和219nm的双负峰及208nm和216nm处鼓起的两个负肩，溶液中a-螺旋构象占388％。

重组毕赤酵母生产耐高温α-淀粉酶发酵条件的优化

利用重组毕赤酵母诱导表达可产生耐高温α-淀粉酶,在摇瓶发酵基础上,从诱导时间、甲醇添加量、pH值、接种量4个因素考察发酵条件对耐高温α-淀粉酶酶活力的影响,结合四元线性回归正交试验设计研究方法构建出甲醇诱导重组毕赤酵母生产耐高温α-淀粉酶的回归模型;优化最佳工艺参数为:诱导时间96h、甲醇添加量0.5%、接种量150mL/100mL、摇床转速200r/min。确定最优工艺条件下,耐高温α-淀粉酶酶活为217.2U/mL。