叶用莴苣ARF4Like基因克隆及高温下的表达分析

【目的】探明叶用莴苣ARF4Like基因与抽薹之间的关联。【方法】从“GB-30”的cDNA中得到并克隆出LsARF4Like基因全部cDNA序列,再应用SOPMA、MEME、SWISS-MODEL等生物信息软件对cDNA序列进行分析。【结果】分析序列发现,基因全长为2295 bp,开放阅读框2295 bp,共编码764个氨基酸,含有ARF家族保守结构域。运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术测定了LsARF4Like基因在高温处理后的基因表达变化,分析其结果显示,高温使LsARF4Like基因表达量显著上调。【结论】高温促进叶用莴苣GB-30中LsARF4Like基因的表达,推测LsARF4Like基因与叶用莴苣抽薹存在一定的关联。

叶用莴苣LsE3基因克隆与表达分析

【目的】为探明E3泛素连接酶基因对叶用莴苣高温抽薹的影响。【方法】通过RT-PCR克隆得到LsE3编码序列,生物信息学工具分析序列特征,实时荧光定量PCR方法分析基因表达水平。【结果】LsE3基因长度1 122bp,编码373个氨基酸。生物信息学分析显示,其C端有一个RING-H2finger结构域。多序列比对和系统发育分析表明,该蛋白序列具有较高的保守性,与向日葵(Helianthus annuus L.)亲缘关系较近。LsE3亚细胞定位预测位于细胞核。荧光定量PCR结果显示,高温处理显著影响植株茎中LsE3表达量。【结论】LsE3可能在叶用莴苣高温抽薹中发挥重要作用。

叶用莴苣无缝克隆构建LsE3基因过表达载体和新RNAi载体及遗传转化体系优化

研究旨在应用新技术和新载体构建过表达和沉默载体,优化遗传转化体系,验证生菜LsE3基因功能,探究高温抽薹机制。以pCAMBIA1304和pFGC5941载体为材料,通过无缝克隆构建叶用莴苣转基因载体,并通过筛选培养基配方优化遗传转化体系。试验成功地以p CAMBIA1304为基础,插入源自pFGC5941的dsRNA表达框序列,获得了新RNAi空载pCAMBIA1304-FGC5941,构建了LsE3沉默载体,并成功以双元质粒载体pCAMBIA1304构建了LsE3过表达载体。试验对易抽薹叶用莴苣品种‘GB-31’进行潮霉素浓度、直接芽诱导培养基配方和生根培养基配方的筛选,确立了潮霉素适宜筛选浓度为5 mg/L,并确立了最优培养芽诱导和生根培养基配方。试验成功获得新RNAi空载并构建了转基因载体,优化了遗传转化体系,为解决载体构建繁琐复杂的问题提供新思路,并奠定了生菜转基因技术的基础。