重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(二)

二、适用范围本指导原则中的rAAV载体是指基于腺相关病毒的结构和理化特性,经设计和重组改造所形成的用于携带外源目的基因(或核酸片段)的病毒载体。本指导原则主要针对应用于体内基因治疗的rAAV载体类产品在申报临床试验时应完成和提交的药学研究信息提出建议。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(七)

六、质量研究与质量标准1.质量研究rAAV载体类产品的质量研究应根据产品的设计、作用机制和生产工艺等方面确定,一般包括(但不限于):鉴别、结构分析、一般理化特性、含量、纯度、生物学活性、杂质、污染物检测等。研究样品应具有代表性,如工艺相近或相同的非临床研究用样品、临床试验用药品等。质量研究信息应完整,包括分析方法原理介绍、研究样品、试验条件和基本步骤、数据处理和结果分析等,分析方法应能满足预期用途。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(一)

一、前言体内基因治疗产品一般选用适当的载体或转染方式将外源基因(或基因编辑工具)导入人体,通过替代、补偿、阻断、修正特定基因以达到治疗疾病的目的。重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体因其理化性质稳定、致病性弱、整合风险低、外源基因表达持久等结构和生物学方面的优势,已成为体内基因治疗领域研究、应用最为广泛的载体之一。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(六)

五、生产工艺通过前期的工艺开发和临床试验用药品的制备,应能建立并初步证明生产工艺的合理性和可重复性,拟定工艺应能稳定生产出符合预期质量的临床试验用药品。申报资料须明确临床试验用药品的生产厂和检验厂,提供基本的生产工艺信息,包括生产规模、工艺流程、具体的工艺参数、过程中控制信息、批次定义等。工艺开发信息应能支持临床试验用药品生产工艺设定的合理性,如质粒瞬转工艺中质粒的用量和配比、杆状病毒感染工艺中的病毒用量和比例、病毒收获条件、纯化工艺条件、制剂处方筛选等。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(三)

三、一般原则临床试验申报阶段,rAAV载体类产品可参考《中国药典》的相关要求(尤其是“人用基因治疗制品总论”的要求),结合申报阶段的特点,制定合理的药学研究计划和质量控制策略。临床试验用药品应按照“《药品生产质量管理规范(2010年修订)》临床试验用药品附录”(2022年第43号)的相关要求进行生产。临床试验用药品的研发、生产、使用和废弃处理应符合生物安全相关法律法规的要求。

腺相关病毒感染GDF11对2型糖尿病大鼠血管损伤的保护作用

目的探讨腺相关病毒感染上调体内生长和分化因子11(GDF11)表达水平对2型糖尿病大鼠(T2DM)主动脉损伤的影响。方法随机选取9周龄雄性SD大鼠,采用高糖高脂饲料加小剂量链脲佐菌素(STZ)联合诱导,建立T2DM模型。正常大鼠和糖尿病模型大鼠随机分为5组:空白对照组(Control组)、阴性病毒对照组(NC组)、GDF11腺相关病毒组(GDF11组)、糖尿病组(DM组)、糖尿病+GDF11腺相关病毒组(DM+GDF11组)。喂养8周后,检测大鼠血清中胰岛素(INS)、晚期糖基化终末产物(AGES)、重组生长转化因子11(GDF11)、总胆固醇(T-CHO)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、不对称二甲基精氨酸(ADMA)、丙二醛(MDA)浓度;采用过碘酸雪夫氏染色(PAS染色)观察糖原沉积部位,苏木精-伊红染色(HE)观察血管损伤情况,扫描电镜观察血管内皮细胞和血管弹性纤维损伤情况,蛋白印迹和免疫组化检测血管损伤相关蛋白的表达水平。结果在动物实验中与Control组相比,生化指标提示:DM组大鼠血清中AGES、T-CHO、TG、LDL-C和MDA浓度升高(P<0.05),INS、GDF11、HDL-C、ADMA显著低于Control组(P<0.05),DM+GDF11组AGES和HDL-C与DM组无明显差异,T-CHO、TG、LDL-C和MDA相比较DM组降低(P<0.05),INS、GDF11和ADMA相比较DM组升高(P<0.05)。病理染色提示:DM组PAS染色提示糖原颗粒在主动脉内皮及内皮下沉积,HE染色观察到主动脉中膜增厚,内皮细胞及弹性纤维断裂走形不规则,电镜观察到DM组血管内皮损伤,弹性纤维断裂,DM+GDF11组这些变化有所减轻。蛋白印迹和免疫组化表示内皮细胞相关蛋白在DM组中表达下降(P<0.05),间充质标志物在DM组中表达升高(P<0.05),DM+GDF11组中这些蛋白有所回调,且差异有统计学意义(P<0.05)。结论提高体内GDF11表达水平可以改善糖尿病导致的主动脉血管损伤,推断可能与其抑制内皮间充质转化保护血管内皮细胞的功能从而改善血管损伤有关。

表达ROG的重组腺相关病毒载体的构建及高滴度病毒的制备

目的:获得表达小鼠ROG(repressor of GATA 3)基因的重组腺相关病毒载体,制备表达ROG的重组腺相关病毒。方法:设计、合成引物,通过RT PCR法从CTLL 2细胞总RNA中扩增ROG基因,测序确认后,连接于pAAV MCS载体,双酶切、PCR鉴定重组病毒载体;制备高滴度重组腺相关病毒。结果:成功扩增了小鼠ROG基因,构建可表达ROG基因的重组腺相关病毒载体,并获得表达ROG的重组腺相关病毒。结论:本实验获得的小鼠ROG重组腺相关病毒,将为支气管哮喘的基因治疗研究奠定基础。

Dll4基因靶向RNAi重组腺相关病毒载体的构建和高滴度病毒制备

目的:构建一个表达肿瘤血管生成调节基因Delta-like ligand4(Dll4)小干扰RNA的重组腺相关病毒载体,制备靶向性抑制Dll4表达的高滴度重组腺相关病毒。方法:将包含肿瘤血管生成调节基因Dll4特异性小干扰RNA片段的质粒用EcoRI+SalI双酶切,回收目的片段,将pSNAV2.0质粒用EcoRI+SalI双酶切后同目的片段连接,脂质体法转染BHK-2l细胞,G418筛选后以辅助病毒感染获取病毒。结果:PCR和测序证实,成功构建包含U6启动子和肿瘤血管生成调节基因Dll4特异性RNA干扰片段的重组腺相关病毒载体,并制备出滴度为2.4×l011vectorgenome/L高滴度腺相关病毒。结论:成功构建携带Dll4基因短发夹状干扰RNA的腺相关病毒载体。为下一步探索抗肿瘤血管生成基因治疗的新途径提供实验基础。

靶向敲减KLF4基因的重组腺相关病毒载体的构建及其在肺动脉高压动物模型中的应用

目的构建靶向敲减KLF4基因的重组腺相关病毒载体,并应用于肺血管疾病,为后期研究肺血管KLF4基因敲减在肺动脉高压大鼠中的作用及相关分子机制奠定基础。方法根据大鼠KLF4基因序列,设计针对大鼠特异性的siRNA序列,以pHBAAV-U6-MCS-CMV-EGFP作为空白载体,通过酶切技术构建带有GFP荧光标记的KLF4干扰腺病毒载体pHBAAV-r-KLF4shRNA-GFP,行测序分析,并进行病毒扩增、纯化及滴度测定。本研究对长时间(3个月)接触香烟烟雾的大鼠进行气道注入AAV1-KLF4-shRNA的干预治疗,观察大鼠右心室收缩压、平均右心室压等血流动力学指标改变。结果经测序检测显示,大鼠AAV1-KLF4-shRNA腺相关病毒载体构建成功。健康对照组、生理盐水模型组、对照病毒模型组、治疗干预组的右心室收缩压和平均右心室压比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论对长时间接触香烟烟雾的肺动脉高压模型大鼠应用AAV1-KLF4-shRNA腺相关病毒载体,能有效改善右心室收缩压和平均右心室压,该载体在相关疾病动物模型中应用有效,为后期顺利开展AAV1-KLF4-shRNA在肺动脉高压中的预防和治疗作用,以及相关分子机制的深入研究提供基础条件。

腺相关病毒基因治疗在肝脏疾病中的应用及展望

腺相关病毒(AAV)载体基因治疗在多个临床试验中已被证明安全有效。近期,靶向肝脏的AAV载体治疗血友病的临床研究备受关注,为改善凝血功能障碍提供了有效策略。然而,外源基因导入可能导致肝损伤等不良反应,基因治疗的长期风险尚不明确。本文重点探讨AAV载体在血友病基因治疗的应用,总结其在多种肝脏疾病中的应用价值,并提出针对潜在风险的控制措施。

重组腺相关病毒:很有潜力的基因治疗载体

腺相关病毒(AAV)是细小病毒家族的一员,为无包膜的线性单链DNA病毒.由于AAV具有长期潜伏于人体而不具有任何明显致病性等优点,人们对AAV作为一种理想的基因治疗载体给予了很大期望.但是,近来发现,这类载体在应用上有许多明显的缺陷,包括某些细胞膜上病毒受体数量极少,重组AAV载体位点特异性整合不足,AAV衣壳成分和转基因产物引起宿主的免疫反应等等.这些缺陷促使人们加大对AAV生物学特性和转染过程的研究,从而更好地对AAV载体进行改进,使新一代重组AAV载体具备基因治疗所必需的安全性、高效性和靶向性,以期更广泛地应用于临床.

重组人骨形成蛋白4基因腺相关病毒载体的构建

目的构建重组人骨形成蛋白4(human bone morphogenetic protein 4,hBMP-4)基因腺相关病毒载体。方法根据hBMP-4的基因序列设计引物,上游引入EcoR位点,下游引入Sal位点,以EX-A0242-M01-hBMP-4为模板扩增目的基因。将hBMP-4基因克隆入pUC18载体中,获得重组质粒pUC18-hBMP-4。然后用EcoR与Sal酶切pUC18-hBMP-4及质粒pSNAV,回收酶切片段,T4DNA连接酶16℃过夜,转化大肠杆菌DH5α感受肽细胞,筛选阳性克隆获得pSNAV-hBMP-4,EcoR/Sal双酶切鉴定,并行全基因测序。转染BHK21细胞,G418筛选培养,获得抗药克隆细胞株。HSV1-rc/△UL2感染,包装此细胞株并收获病毒载体AAV-hBMP-4。行DNA点杂交法测定病毒滴度,SDS-PAGE分析判断病毒纯度。结果PCR电泳及酶切鉴定表明,pSNAV-hBMP-4重组成功,基因测序显示装入pSNAV质粒中的hBMP-4基因正确;AAV-hBMP-4病毒的大致滴度为1.5×1012μg/ml,分泌蛋白浓度为0.124mg/ml,病毒载体纯度在95%以上。结论实验获得的病毒载体滴度高、感染性好,可以满足骨组织工程的需要。

DREAM基因小分子干扰RNA重组腺相关病毒载体的构建与鉴定

目的构建表达DREAM基因的小分子干扰RNA(siRNA)重组腺相关病毒(rAAV)载体,并观察感染PC12细胞后DREAM蛋白表达受抑制情况。方法设计并合成shRNA对应的2条互补的寡核苷酸链,pDC316-EGFP-U6质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切与退火后的寡核苷酸连接,构建pDC316-EGFP-DREAMshRNA-U6质粒,以其为模板设计引物并引入EcoRⅠ和SalⅠ位点,PCR产物酶切后与pSANV2.0连接构建重组质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP,酶切测序证实后,重组腺相关病毒介导将pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP感染PC12细胞,Western blot检测DREAM蛋白表达水平。结果经PCR、酶切及测序证实,重组腺相关病毒载体质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP构建成功,包装成病毒感染PC12细胞48 h后,Western blot结果显示与对照组细胞相比,DREAM蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。结论成功构建和筛选出介导特异性shRNA-DREAM的重组腺相关病毒载体。

不同注射剂量9型腺相关病毒载体在小鼠脑和脊髓表达效果分析

腺相关病毒(AAV),尤其是从轴突末端转移到神经元的AAV9型,是研究神经环路和解析大脑功能的有力工具。利用囊泡型谷氨酸神经元(VGlut2)基因敲入小鼠联合脑立体定向注射,通过将AAV9-DIO-ChR2-EGFP病毒注射于VGlut2转基因小鼠的蓝斑核(LC),探究不同注射剂量对病毒侵染范围和小鼠体重的影响。结果表明,与高注射量(1μL)相比,低注射量(0.5μL)可将AAV9-DIO-ChR2-EGFP限定至蓝斑核(LC)。在AAV9-DIO-ChR2-EGFP注射3周后,侵染范围由LC延伸至初级运动皮质(primary motor cortex,M1)、下丘脑、中缝苍白核(araphe pallidus nucleus,Rpa)和颈髓(cervical spinal cord,CSC)。随后检测了低注射量的AAV9(0.5μL)是否影响小鼠体重,统计结果表明,0.5μL AAV9注射对小鼠体重无影响(P=0.9795)。结果表明,低注射量(0.5μL)可以在一定程度上限制AAV的表达范围,并且脑内注射AAV9不会改变小鼠体重。

NOS反义RNA重组腺相关病毒载体体内提高脑细胞耐缺血能力的实验研究

目的探讨二种分别携带神经元型一氧化氮合酶（nNOS）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）反义RNA重组腺相关病毒载体（rAAV—AsnNOS和rAAV-AsiNOS）提高脑细胞耐受缺血能力的作用机制。方法应用立体定位技术将预处理好的病毒载体转染至将要梗死侧的基底节区，转染病毒滴度为2×10^9mL～，并将SD大鼠分为4组：即rAAV-AsnNOS组，rAAV-AsiNOS组，rAAV—LacZ组和对照组；处理后运用MACO建立缺血模型，每组分为缺血早期和缺血晚期，流式细胞术（FCM）检测NT阳性细胞百分比和细胞凋亡率，逆转录反应系统（RT-PCR）分析nNOS、iNOS，p38MAPK，Caspase-3 mRNA的表达。结果一定剂量的重组病毒载体转染到大鼠海马区域，无神经损伤症状；转染rAAV-AsnNOS病毒载体的脑神经细胞在缺血早期（缺血1～6h），NT阳性细胞百分比、细胞凋亡率以及nNOS、p38MAPK和Caspase-3 mRNA表达量均较对照组、rAAV-LacZ组和rAAV—AsiNOS组降低；转染rAAV—AsiNOS病毒载体的脑神经细胞在缺血晚期（缺血24—72h），NT阳性细胞百分比、细胞凋亡率以及nNOS、p38MAPK和Caspase-3 mRNA表达量均较对照组、rAAV-LacZ组和rAAV-AsnNOS组降低，差异有统计学意义。结论转染重组病毒载体后动物模型脑神经细胞能够耐受缺血损伤，转染rAAV-AsnNOS病毒载体的脑神经细胞能够在缺血早期抑制nNOS、p38MAPK和Caspase-3的表达，转染rAAV—AsiNOS病毒载体的脑神经细胞能够在缺血晚期抑制iNOS、038MAPK和Caspase-3的表达，从而在缺血后抑制神经细胞凋亡的发生。

大鼠CTLA4-FasL融合基因重组腺相关病毒载体的构建、制备及表达

目的检测大鼠CTLA4-FasL重组腺相关病毒载体感染大鼠关节炎性成纤维样滑膜细胞后目的基因的表达。方法构建大鼠CTLA4-FasL融合基因重组腺相关病毒载体,制备重组病毒,体外感染从佐剂诱导关节炎的大鼠关节中分离的炎性成纤维样滑膜细胞,利用Flag标签纯化目的蛋白,ELISA和Western blot等方法检测目的蛋白的表达。结果获得含有大鼠CTLA4-FasL融合基因的重组腺相关病毒,感染炎性成纤维样滑膜细胞后能够分泌性表达目的蛋白。结论构建并制备的CTLA4-FasL重组腺相关病毒能够有效感染炎性成纤维样滑膜细胞并促使期表达CTLA4-FasL融合蛋白,为今后关节炎治疗的体内实验研究奠定了基础。

靶向肝癌细胞的重组腺相关病毒载体的构建

目的 构建以甲胎蛋白增强子(AFP E)和白蛋白启动子(ALB P)联合转录调控序列(AFPenh+ALBprom, EP)为启动子的重组腺相关病毒基因治疗载体,用于肝细胞肝癌(HCC)的靶向基因治疗研究。方法 用PCR方法扩增EP基因片段,将EP基因片段顺义克隆至重组腺相关病毒载体系统(AAV Helper Free System)中表达质粒 pAAV IRES hrGFP的启动子位点,并替换其原有的巨细胞病毒(CMV)启动子,构建出以 EP为启动子的表达质粒 pAAV IRES hrGFP EP; 再将 pAAV IRES hrGFP EP与 AAV Helper Free System中的控制质粒pAAV RC和辅助质粒 pHelper用脂质体转染法共转染人胚肾细胞(293 细胞),生成以 EP 为启动子的、可用于HCC靶向基因治疗的重组腺相关病毒载体(rAAV EP)。结果 成功构建并包装出以 EP为启动子的重组腺相关病毒载体 rAAV2 EP,病毒滴度达1.2×105/ml。结论 构建的以腺相关病毒为载体、受 AFP E和 ALB P联合转录调控序列驱动的重组腺相关病毒载体 rAAV2 EP,可望能用于HCC靶向基因治疗研究,并为肝脏疾病的靶向基因治疗提供先进载体系统。

携带CIP2A shRNA重组腺相关病毒载体的构建及其鉴定

目的构建携带CIP2AshRNA重组腺相关病毒载体,制备靶向性沉默CIP2A表达的高浓度重组腺相关病毒。方法设计合成CIP2AshRNA,退火形成双链与pDC316-EGFP-U6质粒BamHⅠ和HindⅢ双酶切产物相连接构建形成质粒pDC316-EGFP-CIP2AshRNA,以鉴定正确的pDC316-EGFP-CIP2AshRNA克隆为模板PCR扩增EGFPCIP2AshRNA片段,EcoRⅠ和SalⅠ双酶切PCR扩增产物及pSNAV2.0质粒后进行连接形成重组质粒pSNAV2.0-EGFP-CIP2AshRNA,建立载体细胞株BHK/CIP2A-shRNA,采用AAV MaxTM包装系统大规模制备rAAV2-EGFPCIP2AshRNA并对其纯化及滴度测定。将rAAV2-EGFP-CIP2AshRNA感染肝癌细胞HepG2,利用空载病毒载体rAAV2-EGFP作对照,采用Real-time PCR及Western blot方法检测CIP2AshRNA基因沉默效果。结果携带编码CIP2AshRNA腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-EGFP-CIP2AshRNA经双酶切及测序鉴定,质粒构建正确;将重组质粒与辅助病毒HSV1-rc/ΔUL2共转染包装细胞BHK-21,成功制备重组腺相关病毒rAAV2-CIP2AshRNA,经测定纯化所得rAVV2病毒滴度为0.25×1012v.g./mL。筛选MOI值为1×105感染肝癌细胞HepG2,CIP2A mRNA及蛋白表达水平分别于感染后24h和48h与对照细胞相比出现明显下降。结论成功制备高滴度携带CIP2AshRNA重组腺相关病毒载体rAAV2-CIP2AshRNA。

重组腺相关病毒载体2型转染骨髓间充质干细胞的体外实验(英文)

背景:目前应用于基因治疗的病毒载体中,重组腺相关病毒载体2型载体与腺病毒和反转录病毒载体比较,由于其无致病性,引起学者们的关注。目的:观察体外重组腺相关病毒载体2型转染骨髓间充质干细胞,并用其作为携带基因表达的载体进行急性髓性白血病基因治疗的可能性。设计:开放性实验。单位:南方医科大学南方医院的血液科。材料:实验于2004-02/07在南方医科大学南方医院的血液科实验室完成。本实验所用的骨髓间充质干细胞来自急性髓性白血病6例初发患者和4名健康成年志愿者的第3～5代传代细胞。方法:从初发的急性髓性白血病患者和正常健康志愿者髂后上棘做骨髓穿刺抽取6～10mL肝素抗凝的骨髓,分离培养出间充质干细胞,用包含增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型感染间充质干细胞,将获取的骨髓间充质干细胞加入含一定感染复数(感染复数=1×102,1×103,1×104,1×105,1×106,1×107)的增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型病毒载体的不完全培养液,10～14d后在相差荧光显微镜下或用流式细胞仪观测绿色荧光蛋白的表达。在体外培养条件下观察绿色荧光蛋白在经过重组腺相关病毒载体2型转导的骨髓间充质干细胞中的表达。体外观察经增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型转导并被新霉素筛选后绿色荧光蛋白在被转导的骨髓间充质干细胞中的表达。通过相差荧光显微镜下确证绿色荧光蛋白表达后,在BD流式细胞仪上检测绿色荧光蛋白的表达。主要观察指标:①增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型对骨髓间充质干细胞的转染率分析。②在转染后的不同时间点用相差荧光显微镜和流式细胞仪观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果:①转染率分析:增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型对来源于健康志愿者和急性髓性白血病患者的骨髓间充质干细胞的转染率均不高,转染率在0.3%～1.4%。转染后10～14d绿色荧光蛋白开始表达,一般感染条件绿色荧光蛋白阳性骨髓间充质干细胞所占比例为(1.030±0.034)%,重复3轮感染条件下为(1.140±0.036)%,脂质体协助感染条件下为(1.380±0.054)%,改变转染条件(包括重复感染,延长感染时间,增加感染复数,脂质体协助转染)亦不能明显增加转染率(P>0.05),而增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型却能高效的转染其包装细胞293细胞。②绿色荧光蛋白在体外长期稳定表达分析:实验观察61d内,绿色荧光蛋白保持低水平长期稳定表达,在转染后的12～33d,绿色荧光蛋白阳性的骨髓间充质干细胞从起始时的1.16%下降到0.5%～0.6%,33～61d一直维持在这一水平;经过新霉素筛选30d后,表达绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞达到6.6%左右,在体外继续传代培养,在体外观察的100d中,表达绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞一直维持在6%的水平。结论:重组腺相关病毒载体2型介导的基因转导的优势是安全、无免疫反应,目的基因能够长期稳定表达。重组腺相关病毒载体和骨髓间充质干细胞可用于体外基因治疗,其将来可能成为全身基因治疗的良好载体。

重组腺相关病毒载体介导的绿色荧光蛋白在急性髓性白血病患者骨髓间充质干细胞中的表达

目的探讨重组腺相关病毒载体(rAAV-2-eGFP)是否可高效转导入骨髓间充质干细胞(BMSCs).方法从初发的急性髓性白血病(AML)患者骨髓中分离培养出BMSCs,在不同的感染复数(MOI=102,103,104,105,106,107)下用包含增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的rAAV-2-eGFP感染BMSCs,寻找最佳的感染条件,并在转染后的不同时间点用倒置荧光显微镜以及流式细胞仪观察其表达情况.结果转染后10～14 d,eGFP在BMSCs中表达,转染效率为0.3%～2%,增加MOI亦不能明显增加转染效率.在MOI=105的条件下转染后观察了61 d,eGFP保持低水平长期稳定表达,在转染后的12～33 d,eGFP阳性的BMSCs从起始时的1.16%下降到(0.5～0.6)%,33～61 d一直维持在这一水平.结论rAAV-2-eGFP和BMSCs可用于体外基因治疗,但极低的转染效率可能是其进一步应用的障碍.