实时荧光定量聚合酶链反应法与分离培养法在流感病毒鉴定中的关系研究

流感是至今尚无法完全控制的一种病毒性急性呼吸道传染病,同时也是国际上第一个实现全球监测的传染病[1]。为使阳泉市流感监测走向系统、全面和科学化,阳泉市疾病预防控制中心于2009年加入全国流感监测网络实验室,现将2015—2019年实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time PCR)检测阳性样本进行分离培养,分析CT值与流感病毒分离率的影响关系。

实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的比较

目的比较实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的差异。方法采用实时荧光定量RT-PCR及经典的狗肾传代细胞病毒分离2种方法 ,同时对流感监测点送检的80份疑似流感标本检测流感病毒。结果细胞培养病毒分离的阳性数为26份,实时荧光定量RT-PCR的阳性数为36份,好=8.1,P<0.005。结论 通过该实验,验证了实时荧光定量RT-PCR的确快速敏感,适用于实验室快速诊断。

实时荧光定量聚合酶链反应在HBV YMDD基因变异检测中的应用

目的以DNA测序法为标准,探讨实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测乙型肝炎(下称乙肝)病毒YMDD基因变异的敏感性和特异性。方法选取68例乙肝患者经拉米夫定治疗前及治疗9个月后其血清采用荧光定量PCR技术联合检测HBV DNA及YMDD变异,并随机选取10例(5例实时荧光定量PCR提示YMDD变异;5例提示未变异)慢性乙肝患者做DNA测序,分析二者的检测结果。结果拉米夫定治疗前HBVDNA的载量,两组相比差异无统计学意义(P>0.05),9个月后YMDD的变异率为14.7%(10/68);YMDD变异型组HBV DNA无l例阴转,YMDD野生型组HBV DNA阴转率为79.3%(46/58),差异有统计学意义(P<0.01);10例测序法所测结果与实时荧光定量PCR完全相符,总符合率为100.0%。结论实时荧光定量PCR技术联合检测HBV DNA及YMDD变异具有很好的临床应用前景。

实时荧光定量聚合酶链反应技术及细胞培养法在流感病毒检测中的应用价值

目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术及细胞培养法在流感病毒检测中的应用价值。方法选取2013年1月至2018年12月阜新市哨点医院采集的4026份疑似流感咽拭样本作为研究对象,先后采用不用的检验方式进行检测,研究组采用实时荧光定量PCR法,对照组采用细胞培养法,比较两种检测方法对流感病毒携带者样本临床分型阳性率的检测效果。结果研究组检出阳性样本512份。其中,检出新甲H1型149份,对照组分离毒株62株;研究组H3亚型206份,对照组分离毒株109株;研究组B型157份,对照组分离毒株97株,各组均未检出H5、H7、H9亚型。研究组检出阳性样本总数与对照组毒株总数呈正相关,且新甲H1型、H3型、B型与毒株分别呈正相关(P <0.05)。研究组检出流感病毒阳性率为25.68%,对照组检出流感病毒阳性率为6.66%,差异有统计学意义(P <0.05)。结论实时荧光定量PCR技术对流感病毒检测的速度更快,灵敏度更高,具有较高的临床应用价值。

实时荧光定量聚合酶链反应检测在乙型肝炎诊断中的应用

我国是乙型肝炎病毒（HBV）高流行区，50％～70％的人受到感染，8％～10％是HBV携带者，肝炎患者中60％是慢性肝炎患者，HBV又与肝硬化和原发性肝癌密切相关。

两种反转录荧光定量聚合酶链反应检测HCV RNA的对比分析

目的探讨常规反转录荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）与高精度RT-qPCR检测丙型肝炎病毒（HCV）RNA的差异,为医院开展院内感染监控提供参考。方法对2014年1月至2015年12月的459例住院受血者,采用两种RT-qPCR检测HCV RNA,比较两种检测方法 RNA阳性率的表达差异。结果高精度RT-qPCR和常规RT-qPCR检测HCV RNA的阳性率分别为3.70%（17例）、1.74%（8例）,高精度RT-qPCR检测HCV RNA阳性表达明显高于常规RT-qPCR检测,差异有统计学意义（χ^2=11.326,P〈0.05）。结论合理应用高精度RT-qPCR对输血前患者进行HCV RNA检测,可以提高对HCV RNA的检出率,减少了医源性感染,提高了对受血患者健康状况的判断能力。

聚合酶链反应熔解曲线法检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药的临床价值分析

目的:评价荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)熔解曲线法检测结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)对利福平和异烟肼耐药的临床价值,为临床MTB耐药情况的快速、准确检测提供参考。方法:选取2023年10月-2024年4月苏州市第五人民医院收治的153例结核病患者作为研究对象,留取所有患者的痰液标本、纤支镜洗液标本和培养菌株标本,同时采用荧光PCR熔解曲线法、利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术(XpertMTB/RIF法)和微孔板药敏法检测MTB对异烟肼和利福平的耐药情况,分析荧光PCR熔解曲线法检测MTB对利福平和异烟肼耐药的临床价值。结果:微孔板药敏法检测结果显示,153例结核病患者中有43例的MTB为耐药型,其中单利福平耐药的有1例(占0.65%),单异烟肼耐药的有15例(占9.80%),利福平+异烟肼耐药的有27例(占17.65%);与Xpert MTB/RIF法相比,荧光PCR熔解曲线法检测MTB对利福平耐药的符合率、阳性预测值、阴性预测值、灵敏性、特异性分别为98.04%、90.91%、100.00%、100.00%、97.56%,而其Kappa值为0.94;与微孔板药敏法相比,荧光PCR熔解曲线法检测MTB对利福平耐药的符合率、阳性预测值、阴性预测值、灵敏性、特异性和Kappa值分别为95.42%、81.82%、99.17%、96.42%、95.20%、0.86,而其检测MTB对异烟肼耐药的符合率、阳性预测值、阴性预测值、灵敏性、特异性和Kappa值分别为94.12%、92.31%、94.74%、85.71%、97.30%、0.85。结论:对于MTB对利福平和异烟肼的耐药检测,荧光PCR熔解曲线法与Xpert MTB/RIF法、微孔板药敏法几乎完全一致,可为临床耐药结核病的早期诊断提供较为可靠的依据。

实时荧光定量PCR法与常规细菌鉴定法在肠道致病菌检测中的应用效果对比分析

目的分析实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法与常规细菌鉴定法在肠道致病菌检测中的应用效果。方法选取2018年9月至2019年10月于我院就诊的360例腹泻患者为研究对象,采集所有患者的粪便标本并实施检测,同时进行实时荧光定量PCR法和常规细菌鉴定法检测,对比两种不同检测方法对肠道致病菌的检测阳性情况。结果360份粪便标本中,常规细菌鉴定法检测出14株沙门菌,阳性率为3.89%,6株志贺菌,阳性率为1.67%;实时荧光定量PCR法检测出15株沙门菌经,阳性率为4.17%,6株志贺菌,阳性率为1.67%。两种检测方法对沙门菌及志贺菌的检测阳性率比较,组间差异无统计学意义(P>0.05)。将实时荧光定量PCR法检测阳性患者的粪便标本再行常规细菌鉴定法检测,阳性率为100.00%。结论作为能够将DNA直接从粪便标本中提取的方法,实施荧光定量PCR法可对肠道疾病患者致病菌予以准确检测,同时操作简便,能够缩短诊断时间。

实时荧光定量PCR法在儿童巨细胞病毒感染诊断中的应用分析

目的分析实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法在人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)感染诊断中的应用价值。方法选取2021年1月至2023年3月我院收治的88例疑似HCMV感染患儿,于清晨采集患儿空腹静脉血5ml及新鲜晨尿的中段尿5ml,采用ELISA法测定HCMV-IgM,采用FQ-PCR法测定HCMV-DNA。统计病毒培养法诊断结果;以病毒培养法诊断结果作为金标准,计算HCMV-IgM、HCMV-DNA诊断HCMV感染结果,并计算诊断HCMV感染结果与病毒培养法诊断结果的一致性。结果88例疑似HCMV感染患儿中经病毒培养法诊断HCMV感染60例;以病毒培养法诊断结果作为金标准,HCMV-IgM诊断阳性34例,阴性54例,其中漏诊28例,误诊2例,HCMV-IgM诊断结果与病毒培养法诊断结果一致性差(Kappa=0.370,P=0.000);HCMV-DNA诊断阳性52例,阴性36例,其中漏诊9例,误诊1例,HCMV-DNA诊断结果与病毒培养法诊断结果一致性极好(Kappa=0.757,P=0.000);HCMV-DNA诊断灵敏度、准确度均高于HCMV-IgM,差异有统计学意义(P<0.05);HCMV-DNA与HCMV-IgM诊断特异度比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论FQ-PCR法诊断HCMV感染灵敏度、准确度及特异度均较高,FQ-PCR法诊断结果与病毒培养法结果一致性较为理想,能够降低误诊、漏诊风险。

实时荧光定量PCR法分析结核分枝杆菌耐药性的价值观察

目的探究实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法在结核分枝杆菌(MTB)耐药性中的应用价值。方法选择2018年10月至2020年11月我院收治的结核病患者84例,采用FQ-PCR法分析,以罗氏药敏比例法作为检测MTB耐药性的“金标准”,分析FQ-PCR法在MTB耐药性中的应用价值。结果FQ-PCR法分析MTB耐药性中各药物灵敏度、特异度、阳性预测值比较差异有统计学意义(P<0.05);而准确度及阴性预测值比较,差异无统计学意义(P>0.05)。kappa检验显示:对阿米卡星检测一致性不佳(kappa值为0.279);对利福平、异烟肼、莫西沙星及乙胺丁醇一致性尚可(kappa值分别为0.637、0.631、0.578、0.623);对链霉素一致性良好(kappa值为0.815)。结论FQ-PCR法在MTB耐药性分析中具有较高的临床应用价值,优势明显,可为临床诊断及用药提供可靠依据。

实时荧光定量PCR检测人乳头瘤病毒应用研究

目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测人乳头瘤病毒(HPV)的应用价值。方法随机选择2015年2月至2016年2月于本院就诊的宫颈病变患者203例,采用实时荧光定量PCR和第二代杂交捕获法(HCⅡ)对宫颈组织标本进行HPV DNA检测,对检测结果进行分析。结果 77例宫颈上皮内瘤变(CIN)患者实时荧光定量PCR和HCⅡ法HPV DNA阳性检出率分别为93.51%和85.71%,二者比较差异无统计学意义(P>0.05);和72例慢性宫颈炎及鳞状上皮病变患者实时荧光定量PCR和HCⅡ法HPV DNA阳性检出率分别为59.72%和36.11%,二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。203例患者实时荧光定量PCR和HCⅡ法HPV DNA阳性检出率分别为71.43%和57.64%,二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论实时荧光定量PCR和HCⅡ都可用于HPV DNA检测,二者对某些类型宫颈疾病的检测阳性率存在差异。实时荧光定量PCR检测对HPV感染具有一定的辅助诊断意义,有利于宫颈类疾病的早期诊治,值得推广应用。

Line-Gene实时荧光定量PCR不同结果分析模式对检测结果的影响

目的探讨实时荧光定量PCR不同结果分析模式对检测结果的影响.方法用Line-Gene FQD-33A型荧光定量PCR检测系统检测本院门诊和病房乙肝病人血清HBV DNA 77份,分别用最大二阶导数法和样点拟合法进行结果分析.结果发现两种分析方法的总体相关性较好(r= 0.978). 但HBV DNA拷贝数含量＜105时, 两种模式的相关性差(r= 0.706),此时,最大二阶导数法得出的数值要比样点拟合法低(t=2.61,P＜0.05),且易出现假阴性结果.结论虽然样点拟合法步骤较多,但其结果更可靠,因此进行结果分析时,建议使用样点拟合法.而且当样本中HBV DNA拷贝数＜105时只能使用样点拟合法进行结果分析.

实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与RT-PCR法及细胞培养法检测甲_3型流行性感冒病毒的比较

目的比较实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法、RT-PCR法及细胞培养法检测甲3型流行性感冒(流感)病毒的灵敏度与特异性。方法采用建立的实时荧光定量RT-PCR、RT-PCR及经典的狗肾传代细胞病毒分离等3种方法,同时对流感监测点送检的60份疑似流感标本检测甲3型流感病毒。结果细胞病毒分离的阳性数为10份,RT-PCR与实时荧光定量RT-PCR的阳性数分别为12份和15份。实时荧光定量RT-PCR的灵敏度达0.01TCID50,且对甲1型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒H5、严重急性呼吸道综合征冠状病毒及其它呼吸道病毒均无交叉反应,从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右。结论实时荧光定量RT-PCR由于检测在密封环境中进行,避免了产物与环境间的交叉污染,且是3种方法中最为快速敏感的方法,适用于公共卫生应急疫情的实验室快速诊断。

急性T淋巴细胞白血病微小残留病实时荧光定量聚合酶链反应检测的意义

目的 研究采用实时荧光定量聚合酶链反应 (RQ-PCR)技术检测具有tal-1缺失的急性T淋巴细胞白血病(T ALL)患儿骨髓微小残留病 (MRD)水平的可行性,并探讨不同时间点MRD水平在预后和临床治疗干预上的意义。方法 采用最常见的tal 1缺失断裂点sildb1-tal1db1,对 50例T-ALL患儿初治标本进行阳性筛选;应用RQ-PCR技术检测所有阳性患儿初治标本的敏感度,并对这些患儿化疗达完全缓解(CR)及其后不同时间点的骨髓标本进行MRD定量检测,并以极限稀释法检测结果进行比较;对上述两种方法分别检测出的结果进行相关回归分析。结果 ( 1 )在 50例T-ALL患儿中,共检测出 10例阳性患儿; (2)采用RQ-PCR技术和极限稀释法分别检测患儿CR期及其后各个时间点的 28份标本,有 24份标本两种方法检测结果均大于 10-5,两种方法检测结果的相关性很好(r=0 898,P<0.001); (3)在规律治疗的 8例患儿中,CR时骨髓MRD水平高于 10-4的 3例患儿皆在化疗过程中复发,而低于 10-4的 5例一直未复发。结论 RQ-PCR技术是一项特异性强,重现性好、精确快速的MRD定量检测手段。不同时间点的MRD水平升高对预后的意义不同,对及时调整治疗方案、改善预后有重要价值。

实时定量荧光逆转录聚合酶链反应检测胃癌患者血CK20 mRNA及其意义

目的 研究胃癌患者外周血、肿瘤区域引流血中CK2 0mRNA的表达情况,探讨其临床意义。方法 用实时定量荧光逆转录聚合酶链反应(RT- PCR)方法,对6 0例健康献血员外周血和5 5例胃癌手术患者的手术前外周血、术中肿瘤区域血及术后外周血进行检测。结果 健康人外周血中CK2 0mRNA均为低表达,胃癌患者术前外周血中CK2 0mRNA的表达率为4 5 % ,Ⅲ、Ⅳ期胃癌患者术前外周血中表达率高于Ⅰ、Ⅱ期患者(P <0 .0 5 ) ;术中肿瘤区域引流血中CK2 0mRNA的表达率为6 4 % ,高于术前的4 5 % (P <0 .0 5 )。术前外周血中高表达的患者术后随访3～4 0个月中出现复发转移和死亡例数明显高于术前低表达的患者(P <0 . 0 5 )。结论 实时定量荧光RT PCR检测CK2 0mRNA可以评估胃癌血道微转移,有利于判断预后。

柯萨奇病毒B组5型TaqMan一步法RT-qPCR检测方法的建立

目的建立柯萨奇病毒B组5型(coxsackievirusB5,CV-B5)特异的TaqMan一步法实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测方法。方法根据CV-B5的VP1序列,设计特异性引物和TaqMan探针。将目的基因插入pMD18^(TM)载体,在DH5α感受态细胞中扩增,大肠杆菌体外转录后获得RNA标准品并建立标准曲线,最后对检测方法的重复性、敏感度和特异性进行评价。结果该方法在10^(3)~10^(11)拷贝/微升的模板范围内具有良好的线性关系(r^(2)>0.99),扩增效率E=100.9%,敏感度达1×10^(3)拷贝/微升,只对CV-B5有特异性扩增曲线,且重复性较好。结论本实验建立的TaqMan一步法RT-qPCR检测方法有较高的敏感度、特异性和重复性,有良好的抗干扰性,可用于CV-B5的临床样本检测和绝对定量分析。

3种肺炎支原体感染检测方法的临床效果比较

目的比较实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法、培养-增强套式PCR(培养-增强nPCR)法和培养法检测肺炎支原体感染的临床应用价值。方法分别采用实时FQ-PCR法、培养-增强nPCR法和培养法对临床诊断为肺炎支原体肺炎和疑似肺炎支原体肺炎的97例患儿的咽拭子标本进行检测。结果实时FQ-PCR法检测的阳性率明显高于培养法(P<0.001),实时FQ-PCR法的检出率和培养-增强nPCR法比较无显著差别(P>0.05),但实时FQ-PCR法更加简便、快速。结论实时FQ-PCR法较培养-增强nPCR法和培养法更适用于肺炎支原体的早期快速诊断。

乳腺癌klk6基因表达的实时荧光定量法的建立及初步应用

目的建立人乳腺癌相关基因组织型激肽释放酶基因家族成员Kallikrein6(klk6)mRNA荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQPCR)检测方法,以检测正常乳腺和乳腺癌组织中klk6基因表达水平。方法以GAPDH作参照,用SYBRGreenI荧光定量技术,建立检测klk6mRNA的FQPCR方法;并检测32份正常乳腺和乳腺癌组织标本的循环阈值(Ct),然后,通过REST软件分析klk6mRNA的表达水平。结果FQPCR方法对GAPDH和klk6mRNA的扩增效率分别为0.90和0.95,批内变异系数(CV)分别为1.0%～2.1%和0.8%～1.2%,批间CV分别为3.2%和3.9%。正常乳腺和乳腺癌组织的klk6对GAPDH的相对表达量分别为0.017±0.009和0.040±0.017。用REST软件分析,提示乳腺癌组织klk6表达水平上调。结论建立的klk6mRNAFQPCR检测方法简便,特异,重复性好,可信度高,可用于klk6基因表达水平与肿瘤相关性研究。