通心络对高糖高脂诱导人主动脉内皮细胞损伤的保护作用

目的探讨高糖高脂对人主动脉内皮细胞(HAECs)的影响及通心络的干预作用。方法经随机方式,将HAECs分为以下5组:通心络高、中、低浓度组,高糖高脂组和空白对照组。检测各组细胞生存活性、细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)含量、三磷酸腺苷(ATP)含量、线粒体膜电位(MMP)、细胞内活性氧簇(ROS)水平和细胞色素(Cyt)-C蛋白表达。结果与空白对照组比较,高糖高脂组MMP、ATP水平与细胞生存活性明显下降,细胞中ROS含量、细胞上清液LDH漏出量与Cyt-C蛋白表达皆明显上升(P<0.05,P<0.01);与高糖高脂组相比,通心络干预后细胞生存活性、ATP含量和MMP明显升高,细胞上清液LDH漏出量、细胞内ROS水平和Cyt-C蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论对于高糖高脂损伤的HAECs,通心络具有保护作用,相关保护机制可能和保护线粒体功能相关。

黄连素在高糖环境下促进骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景:糖尿病患者的口腔种植体骨结合率低下,失败率高,严重影响了生活质量,亟需有效手段改善糖尿病患者种植体骨结合以提高成功率。探究黄连素在高糖环境下对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及具体机制,将能为解决上述问题提供有效的理论支撑。目的:探讨天然提取物黄连素在高糖微环境下对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。方法:通过全骨髓贴壁法培养SD大鼠骨髓间充质干细胞。CCK-8法检测在高糖生理环境下添加不同浓度黄连素对骨髓间充质干细胞增殖的影响并筛选出最适黄连素浓度。通过碱性磷酸酶活性、茜素红染色以及PCR检测Runx2、Osx表达,判断黄连素在高糖环境下对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。为进一步探索作用机制,添加AMPK特异性抑制剂Dorsomorphin,使用DCFH-DA活性氧荧光探针检测活性氧水平,Western blot检测p-AMPK的表达。结果与结论:①10μmol/L为黄连素促进骨髓间充质干细胞增殖的最适浓度;②黄连素在高糖微环境下促进骨髓间充质干细胞矿化结节形成并提高碱性磷酸酶活性;③黄连素在高糖微环境下促进Runx2和OSx基因表达;④黄连素可有效抑制高糖环境下骨髓间充质干细胞的活性氧水平;⑤黄连素促进骨髓间充质干细胞成骨及抑制活性氧的作用被AMPK抑制剂逆转;⑥黄连素可激活AMPK,促进p-AMPK表达;⑦上述结果表明,黄连素(10μmol/L)能够通过激活AMPK并降低细胞内活性氧水平,从而促进高糖环境下骨髓间充质干细胞的成骨分化。

茶多酚对高糖所致人肾小球系膜细胞活性氧产生的影响

目的 :探讨高糖对人肾小球系膜细胞活性氧产生的影响以及茶多酚对其的干预作用。方法 :应用比色法检测高糖作用后培养系膜细胞上清液中超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH PX)的活力和丙二醛 (MDA)、超氧阴离子自由基 (O2-· )的水平 ,以及加入茶多酚后各指标的改变。结果 :高糖可降低系膜细胞培养上清液中SOD、GSH PX的活力 ,增加MDA和O2 -· 的含量 ;茶多酚可提高上清液中SOD和GSH PX的活力 ,降低MDA和O2 -· 的含量。结论 :高糖可导致人肾小球系膜细胞活性氧产生增多 。

高糖环境下肾小球系膜细胞和内皮细胞相互作用对活性氧产生的影响以及茶多酚的干预作用

目的 :探讨在高糖环境下肾小球系膜细胞与内皮细胞相互作用对活性氧产生的影响和茶多酚的干预作用。方法 :系膜细胞和内皮细胞单独分别培养和共同培养 ,分正常对照组、高糖组及茶多酚干预组 ,培养 0、12、3 6h后 ,用分光光度法检测培养液中丙二醛 (MDA)含量及超氧化物歧化酶 (SOD)活性。结果 :高糖共同培养时SOD活性比两者分别单独培养时更低(P <0 .0 1) ;共同培养时茶多酚干预组的SOD活性显著高于高糖组 (P <0 .0 1)。高糖共同培养时MDA含量较两种细胞单独培养明显增高 ,高于两种细胞单独培养的总和 (P <0 .0 1) ;共同培养时茶多酚干预组MDA含量低于高糖组 (P <0 .0 1)。结论 :( 1)高糖环境下 ,系膜细胞和内皮细胞存在相互作用 ,这种作用能促进肾细胞活性氧的产生 ;( 2 )

p47phox向胞膜移位调节高糖导致的内皮细胞内活性氧升高

目的探讨在高浓度葡萄糖刺激下NADPH氧化酶亚单位p47phox调节内皮细胞内活性氧升高的机制。方法Ⅱ型胶原酶法分离人脐静脉内皮细胞,流式细胞仪检测细胞内活性氧的生成量,western blotting和免疫荧光分别检测细胞内p47phox蛋白的表达和其细胞内的定位。结果高浓度葡萄糖刺激HUVECs内活性氧的升高;NADPH氧化酶抑制剂DPI及apo-cynin抑制高糖导致的活性氧升高;高糖刺激状态下p47phox蛋白表达量并不增加,它由胞质向胞膜移位,DPI和apocynin抑制p47phox移位。结论 p47phox通过向胞膜移位调节高浓度葡萄糖导致的HUVECs内NADPH氧化酶源性的活性氧升高。

茶多酚对高糖所致人肾小球系膜细胞活性氧和TGF-β_1表达的影响

目的 探讨高糖对人肾小球系膜细胞活性氧 (ROS)和转化生长因子 β1(TGF β1)表达的影响及茶多酚的干预作用。方法 培养人肾小球系膜细胞 ,分为正常对照组、高糖组、茶多酚组和茶多酚干预组 ,培养 0、12、36h后 ,用分光光度比色法测定细胞上清液超氧化物歧化酶 (SOD)活性和丙二醛 (MDA)含量 ,用半定量RT PCR和免疫细胞化学法检测细胞内TGF β1mRNA和蛋白表达的变化。结果 高糖导致系膜细胞SOD活性下降和MDA含量升高 ,上调TGF β1mRNA和蛋白表达 ,随时间延长更为明显 ;茶多酚干预可拮抗高糖时系膜细胞的上述改变。结论 高糖能促进人肾小球系膜细胞ROS产生增加 ,上调TGF β1mRNA和蛋白表达 。

高糖培养下系膜细胞JAK_2/STAT_3信号转导通路活性变化及与活性氧簇作用的研究

目的:通过观察高糖培养条件下大鼠肾小球系膜细胞P-STAT3的表达变化,探讨糖尿病状态下JAK2/STAT3途径活性的变化及该通路与活性氧簇(ROS)之间的相互作用。方法:用传代培养的大鼠肾小球系膜细胞同步化后分组:(1)正常糖浓度组(含5.5mmol/L),高糖浓度组(25mmol/L),甘露醇组(5.5mmol/L糖+19.5mmol甘露醇),正常糖+AG-490(浓度10μmol/L)组,高糖+AG-490(浓度10μmol/L)组。继续观察培养后用WesternBlot及细胞免疫化学方法检测系膜细胞STAT3、P-STAT3表达的变化。(2)正常糖浓度组(N),高糖浓度组(H),甘露醇组(M),正常糖+Apocynin组(N+A,Apocynin浓度为100μmol/L),高糖+Apocynin组(H+A,Apocynin浓度为100μmol/L),收集上清液,用比色法检测系膜细胞ROS水平。(3)NADPH氧化酶抑制剂Apocynin预处理,分组同(2),Apocynin提前1h加入,与正常糖或高糖同时培养后,用WesternBlot方法检测系膜细胞P-STAT3表达。结果:(1)高糖培养大鼠肾小球系膜细胞P-STAT3的表达较正常糖浓度组明显升高,甘露醇组与正常糖浓度组相比差异无统计学意义;各组之间STAT3表达差异无统计学意义。(2)高糖条件下,ROS产生明显升高,NADPH氧化酶抑制剂Apocynin可明显降低ROS的产生。(3)高糖条件下,Apocynin经预处理,在正常糖浓度和高糖浓度同时培养48h后,正常糖浓度组和正常糖+Apocynin组对比P-STAT3的表达差异无明显区别;高糖+Apocynin组较正常糖浓度组有明显区别,但与高糖组相比明显降低。结论:高糖通过磷酸化方式激活大鼠肾小球系膜细胞JAK2/STAT3信号转导通路;高糖作用下,肾小球系膜细胞ROS产生增加,并具有时间依赖性;高糖状态下ROS可激活肾小球系膜细胞的JAK2/STAT3信号传导通路,证明ROS可能参与糖尿病肾病的发生和发展过程。

活性氧与丝裂原激活蛋白激酶通路的相互作用介导高糖引起的心肌细胞损伤

目的探讨活性氧(ROS)与丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路的相互作用在高糖损伤H9c2心肌细胞中的作用。方法应用细胞计数盒(CCK-8)检测细胞存活率;Hoechst 33258核染色检测凋亡细胞形态及数量的改变;双氯荧光素(DCFH-DA)染色荧光显微镜照相检测细胞内ROS水平;Western blot测定蛋白质表达水平。结果高糖(35 mmol/L葡萄糖)处理H9c2心肌细胞24 h可引起明显的损伤,表现为细胞存活率下降,凋亡细胞数量及ROS水平明显升高。另方面,高糖可明显地上调磷酸化(p)p38MAPK、细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)及c-Jun N端激酶(JNK)(为MAPK家族的3个成员)的表达水平。N-乙酰半胱氨酸(NAC,为ROS清除剂)能抑制高糖引起的心肌细胞毒性和细胞凋亡,也能阻断高糖对p-p38MAPK、p-ERK1/2及p-JNK表达的上调作用。此外,p38MAPK、ERK1/2和JNK的选择性抑制剂均能抑制高糖引起的心肌损伤,并能抑制ROS生成增多。结论在高糖损伤H9c2心肌细胞中,存在ROS与MAPK通路的正相互作用,这种相互作用可能在高糖引起的心肌细胞损伤中起着重要的作用。

高糖对人腹膜间皮细胞生成活性氧的影响

[目的]研究不同浓度的葡萄糖对人腹膜间皮细胞(human peritoneal mesothelial cells,HPMCs)生成活性氧的影响。[方法]HPMCs体外培养并进行免疫组化鉴定,取第3代细胞用于实验。分别按照不同的实验要求将细胞分组。不同葡萄糖浓度干预组:①空白对照组;②1.5%葡萄糖组;③2.5%葡萄糖组;④4.25%葡萄糖组。不同作用时间组:①空白对照组;②2.5%葡萄糖组。两组细胞分别培养12、24、48 h。应用流式细胞仪检测细胞对氧化剂敏感的2,7-二氢二氯荧光素(2’,7’-dichlorodihydrofluorescein,DCFH)发生氧化所产生的荧光量,从而间接的反映细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的水平,观察随葡萄糖浓度变化及不同作用时间对人腹膜间皮细胞产生活性氧的影响。[结果](1)与空白对照组比较,高糖干预人腹膜间皮细胞后,其细胞内平均荧光强度明显升高(P<0.05),并且随葡萄糖浓度升高而逐渐增高,其中4.25%葡萄糖组最高。(2)与空白对照组比较,随着时间的延长,高糖作用下细胞内平均荧光强度明显升高(P<0.05),培养48 h其水平最高。[结论]高糖可刺激体外培养的人腹膜间皮细胞ROS的生成。

活性氧激活线粒体凋亡通路介导高糖诱导心肌细胞凋亡的研究

目的探讨氧化应激和p53介导的线粒体凋亡通路在高糖诱导乳鼠心肌细胞凋亡的作用。方法将培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞随机分为四组:对照组、高糖组(葡萄糖浓度为25mmol/L)、高糖+抗氧化剂组(抗氧化剂浓度为10mmol/L)和高糖+p53抑制剂组(p53抑制剂浓度为50μmol/L)。荧光分光光度计检测细胞内的活性氧,分光光度计检测上清液中的超氧化物歧化酶,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot对各组细胞p53和Caspase-9进行半定量分析。结果与对照组相比,高糖组心肌细胞凋亡率(P<0.01)和ROS明显升高(P<0.01),上清液中的SOD含量明显降低(P<0.01),Caspase-9(P<0.01)和线粒体蛋白p53表达增多(P<0.01)。与高糖组相比,高糖+抗氧化剂组心肌细胞凋亡率(P<0.01)和ROS明显降低(P<0.01),上清液中SOD明显升高(P<0.01),Caspase-9(P<0.01)和线粒体蛋白p53表达减少(P<0.01)。与高糖组相比,高糖+p53抑制剂组的心肌细胞凋亡率(P<0.01)和ROS明显降低(P<0.05),上清液中SOD含量升高(P<0.05),Caspase-9(P<0.01)和线粒体蛋白p53表达减少(P<0.01)。结论高糖可能通过产生的活性氧介导p53转位到线粒体激活线粒体凋亡通路,引起心肌细胞凋亡。

茶多酚对高糖时内皮细胞产生活性氧和TGF-β_1的影响

目的探讨高糖对内皮细胞产生活性氧和转化生长因子β1(TGF β1)的影响,以及茶多酚的干预作用。方法培养人脐静脉血管内皮细胞(ECV304),分为正常对照组、高糖组、茶多酚组和茶多酚干预组。培养0、12、36 h后,用分光光度比色法测定细胞上清液超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量,用RT PCR法测定细胞内TGF β1 mRNA的变化。结果高糖导致内皮细胞SOD活性下降和MDA含量升高,上调TGF β1 mRNA表达,其变化随时间延长更为明显。茶多酚干预可拮抗高糖时内皮细胞的上述改变。结论茶多酚有抑制高糖对内皮细胞的损伤作用。

牡丹皮多糖2b对高糖所致大鼠系膜细胞增生及活性氧产生的影响

目的探讨高糖对大鼠系膜细胞(MC)增生及活性氧产生的影响,以及牡丹皮多糖2b(PSM2b)对其的干预作用。方法采用MTT法和比色法,分别检测不同浓度PSM2b各组体外高糖培养的MC增生和细胞上清液中超氧化物歧化酶(SOD)的活力和丙二醛(MDA)的水平。结果PSM2b对高糖所致的MC增殖有显著的抑制作用,其抑制作用呈浓度依赖性,并且能够提高上清液中SOD活力,降低MDA含量。结论高糖可导致MC增生和活性氧产生增多,而PSM2b能进行有效的干预。

茶多酚对高糖所致人肾系膜细胞活性氧、Ⅳ型胶原合成的影响

目的:探讨高糖对人肾小球系膜细胞活性氧、Ⅳ型胶原合成的影响及其茶多酚的干预作用。方法:系膜细胞在高糖(35mmol/LD-糖)条件下加入或不加入茶多酚(20μg/ml)培养至36h,运用化学比色法、放射免疫法检测高糖作用后培养系膜细胞上清液中活性氧(SOD和MDA)、Ⅳ型胶原的含量以及加入茶多酚后其含量的改变;应用免疫细胞化学法检测高糖作用后系膜细胞内Ⅳ型胶原的表达以及加入茶多酚后其表达的改变。结果:高糖使系膜细胞上清液中SOD含量减少,MDA含量增加,使培养的系膜细胞上清液中及细胞内Ⅳ型胶原含量增加;茶多酚可提高上清液中SOD活性,降低MDA含量,抑制系膜细胞合成和分泌Ⅳ型胶原。结论:高糖致人肾小球系膜细胞活性氧产生增加,促进Ⅳ型胶原合成和分泌,茶多酚可有效干预高糖的作用。

维生素E对高糖诱导人腹膜间皮细胞纤维连结蛋白表达及活性氧生成的影响

持续不卧床腹膜透析（CAPD）是目前治疗终末期肾病（ESRD）的主要替代治疗方法之一,以往的研究已表明高糖可导致腹膜间皮细胞损伤,细胞外基质产生增多,最终导致腹膜纤维化。高糖引起腹膜纤维化的机制至今尚未阐明。氧化应激（OS）是指由于促氧化与抗氧化系统两者平衡失调导致活性氧（ROS） 过度产生造成的组织损伤。研究已经证实腹膜透析患者普遍存在氧化应激。

还原型谷胱甘肽对高糖环境下肾小管细胞活性氧、核因子-κB及骨桥蛋白的影响

目的观察高糖对人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)产生活性氧、核因子-κB(NF-κB)及骨桥蛋白(OPN)的影响及还原型谷胱甘肽(GSH)的干预作用。方法用分光光度比色法测定上清液超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量,用RT-PCR法测定细胞内NF-κB mRNA的变化及用ELISA法测定上清液中OPN的含量。结果高糖组SOD活力显著低于正常组(P<0.01),MDA含量、NF-κB mRNA的表达及OPN含量明显高于正常组(P<0.01),GSH可增加SOD活力(P<0.05),并减少MDA及OPN的含量、NF-κB mRNA的表达(P<0.01)。结论高糖可导致HK-2细胞活性氧产生增多及NF-κB、OPN的高表达,而GSH可进行有效干预。

活性氧介导高糖负荷致人系膜细胞癌胚纤维连接蛋白的表达

背景:研究发现,癌胚纤维连接蛋白系新合成细胞外基质的重要标志,而高糖环境氧化应激与癌胚纤维连接蛋白的关系尚未见报道。目的:观察高糖作用对人系膜细胞活性氧和癌胚纤维连接蛋白mRNA表达的影响。方法:将培养的系膜细胞分为以下各组:正常对照组(5mmol/LD-葡萄糖);渗透压对照组(5mmol/LD-葡萄糖+20mmol/LL-葡萄糖);高糖组(25mmol/LD-葡萄糖);α-硫辛酸干预组,分为高糖+LA50组(25mmol/LD-葡萄糖+50μmol/Lα-硫辛酸)、高糖+LA100组(25mmol/LD-葡萄糖+100μmol/Lα-硫辛酸)、高糖+LA200组(25mmol/LD-葡萄糖+200μmol/Lα-硫辛酸)。以RT-PCR法检测癌胚纤维连接蛋白mRNA表达水平,荧光显微镜和荧光酶标仪测定细胞内活性氧水平。结果与结论:高糖促进系膜细胞活性氧的产生,亦增加癌胚纤维连接蛋白mRNA的表达,α-硫辛酸可显著降低高糖负荷下细胞内活性氧水平,同时减少癌胚纤维连接蛋白mRNA的表达,且呈浓度依赖性,提示活性氧介导高糖负荷致人系膜细胞癌胚纤维连接蛋白的表达,α-硫辛酸可部分逆转这一效应。

活性氧与ATP敏感性钾通道的相互作用参与高糖对H9c2心肌细胞的损伤

目的研究活性氧(ROS)和ATP敏感性钾通道(KATP通道)的相互作用在高糖(HG)引起的心肌细胞损伤中的作用。方法应用Western blot检测心肌细胞KATP通道蛋白、Cleaved Caspase-3的表达水平;双氯荧光素染色荧光显微镜照相检测胞内ROS水平;细胞计数盒测定心肌细胞存活率;Hoechst 33258核染色荧光显微镜照相测定凋亡细胞数量的变化;JC-1染色法测定线粒体膜电位。结果应用高糖(35 mmol/L葡萄糖)处理H9c2心肌细胞24 h能明显下调KATP通道蛋白的表达水平,1000μmol/L N-乙酰半胱氨酸(ROS清除剂)预处理心肌细胞60min可阻断HG对心肌细胞KATP通道蛋白表达的下调作用。100μmol/L二氮嗪(线粒体KATP通道开放剂)和50μmol/L吡拉地尔(非选择性K_(ATP)通道开放剂)预处理均显著抑制HG引起的心肌细胞ROS的堆积。1000μmol/L N-乙酰半胱氨酸、100μmol/L二氮嗪和50μmol/L吡拉地尔均能抑制HG引起的心肌细胞损伤,使细胞存活率升高,凋亡细胞数量、Cleaved Caspase-3表达及线粒体膜电位丢失减少。结论在HG状态下,心肌细胞的ROS和K_(ATP)通道存在相互作用,两者在HG引起的心肌细胞损伤中发挥重要作用。

GSH对高糖环境下人肾小管细胞活性氧的影响

将体外培养的人肾小管上皮细胞分为低糖对照组(N)、高糖组(H)、高糖+GSH(1mmol/L)组、高糖+GSH(5mmol/L)组及高糖+GSH(10mmol/L)组五组。培养24h、48h及72h后,用分光光度比色法测定上清液超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。结果:高糖组SOD活力显著低于正常对照组(P<0.01),MDA含量明显高于正常对照组(P<0.01),三组浓度的GSH均可增加SOD活力(P<0.05),并减少MDA含量(P<0.01),且均呈剂量依赖性。结论:高糖可导致人肾小管上皮细胞活性氧产生增多,而GSH可进行有效干预。

血管紧张素-(1-7)通过抑制活性氧激活的环氧合酶-2通路保护心肌细胞对抗高糖引起的损伤

目的探讨活性氧(ROS)激活的环氧合酶-2(COX-2)通路在高糖(HG)损伤H9c2心肌细胞中的作用及血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)]能否通过调控ROS激活的COX-2通路抑制HG引起的心肌细胞损伤。方法应用Western blot法检测COX-2蛋白的表达;细胞计数盒(CCK-8)测定细胞存活率;Hoechst 33258核染色检测凋亡细胞的形态及数量的变化;DCFH-DA染色荧光显微镜测定细胞内ROS水平;JC-1染色荧光显微镜照相测定线粒体膜电位(MMP)。结果应用1000μmol/L ROS清除剂(N-乙酰半胱氨酸,NAC)或1μmol/L Ang-(1-7)共处理H9c2心肌细胞12 h能显著地抑制HG对COX-2表达的上调作用;35 mmol/L葡萄糖(HG)处理心肌细胞24 h引起明显的损伤作用,使细胞存活率和MMP降低,凋亡细胞数量及细胞内ROS生成增多;Ang-(1-7)或COX-2抑制剂(NS-398)共处理心肌细胞明显地抑制上述HG引起的损伤作用。结论 Ang-(1-7)通过抑制ROS激活COX-2通路保护心肌细胞对抗HG引起的损伤。

TL1A抗体通过抑制活性氧产生阻止高糖诱导血管内皮细胞凋亡

目的:探讨TL1A抗体在高糖所致活性氧(ROS)增多及细胞凋亡中的作用。方法:将培养的人脐静脉内皮细胞分为正常对照组、正常糖+TL1A组、高糖对照组、高糖+SOD+CAT组、高糖+TL1A抗体组和高渗对照组。采用流式细胞术检测人脐静脉内皮细胞ROS生成量;Annexin V/PI荧光双染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:与正常对照组相比,高糖对照组ROS生成量增加53%,细胞凋亡率达正常的5.8倍(P<0.01)。于正常糖培养液中加入外源性TL1A蛋白,活性氧的生成量及细胞凋亡率均明显增多,显著高于正常对照组和高糖对照组(P<0.01);在高糖培养液中加入9μg/ml TL1A抗体,活性氧生成量由(71.63±6.61)降至(50.63±4.05),细胞凋亡率由(23.70±3.20)%降至(5.07±0.47)%(P<0.01)。结论:TL1A抗体通过抑制ROS产生阻止高糖诱导血管内皮细胞凋亡。