高糖腹膜透析液对人腹膜间皮细胞NLRP3-IL-1β的影响

目的:观察高糖腹膜透析液对人腹膜间皮细胞NLRP3-IL-1β的影响。方法:体外培养人腹膜间皮细胞株第5~10代[HMr SV5,DMEM/F12培养基含10%(体积分数)胎牛血清],观察1.5%、2.5%、4.25%(质量分数)葡萄糖腹膜透析液(dextrose)及线粒体呼吸链复合酶Ⅰ抑制剂鱼藤酮(rotenone),线粒体呼吸链复合酶Ⅱ抑制剂噻吩甲酰三氟丙酮(thenoyltrifluoroacetone,TTFA),线粒体呼吸链复合酶Ⅲ抑制剂抗霉素A(antimycin A)对细胞IL-1β表达的影响(免疫印迹);通过小RNA干扰技术下调NLRP3的表达,免疫印迹分析4.25%高糖腹膜透析液作用下细胞IL-1β的表达;通过白藜芦醇(resveratrol,RSV)诱导自噬,3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)、自噬相关蛋白5(autophagy related gene 5,ATG5)siRNA、自噬相关蛋白(Beclin1)siRNA抑制自噬,流式细胞仪分析细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS),免疫印迹分析IL-1β的表达。结果:对照组、1.5%高糖腹膜透析液、2.5%高糖腹膜透析液、4.25%高糖腹膜透析液、鱼藤酮(10μmol/L)、抗霉素A(50 mg/L)、噻吩甲酰三氟丙酮(10μmol/L)各组细胞上清IL-1β的相对表达依次为0、0.175±0.082、0.418±0.163、2.357±0.288、2.642±0.358、3.271±0.462、0.123±0.091,提示2.5%高糖腹膜透析液、4.25%高糖腹膜透析液、鱼藤酮、抗霉素A作用细胞IL-1β表达明显升高,应用NLRP3 siRNA可阻断上述效应;此外,对照组、阴性对照siRNA(negative control,NC siRNA)、RSV(50μmol/L,诱导自噬)、3-MA(10 mmol/L,抑制自噬)、ATG5 siRNA(抑制自噬)、Beclin1 siRNA(抑制自噬)各组总线粒体荧光强度分别为1.76±0.42、1.83±0.55、1.85±0.62、7.36±0.92、5.35±0.77、5.06±0.62,超氧化线粒体荧光强度分别为821.68±95.12、868.15±102.82、723.39±92.56、1 660.08±113.65、1 433.01±107.24、1 562.36±112.88,结合免疫印迹结果,提示抑制自噬可增强线粒体ROS产生和提高IL-1β表达,诱导自噬对ROS、IL-1β无明显影响。结论:长期应用高糖腹膜透析液,腹膜间皮细胞NLRP3-IL-1β持续激活,实时启动自噬可能成为干预NLRP3-IL-1β持续激活、延缓腹膜透析腹腔慢性炎症及腹膜纤维化的治疗靶点。

干细胞外泌体减轻高糖腹膜透析液诱导的腹膜炎症

目的探讨间充质干细胞外泌体是否可减轻高糖腹膜透析液诱导的腹膜炎。方法选取雄性6~8周龄C57BL/6小鼠24只,体重20~25 g,随机分成4组:正常对照组、生理盐水组、4.25%含糖腹透液组、4.25%含糖腹透液+外泌体组。正常对照组不采取任何干预措施;生理盐水组每次腹腔内注射0.9%生理盐水0.1 ml/g;4.25%含糖腹透液组每次腹腔注射4.25%含糖腹透液0.1 ml/g;4.25%含糖腹透液+外泌体组每次腹腔注射4.25%含糖腹透液0.1 ml/g,并在第28天和35天腹腔注射外泌体200μg/kg。以上各组小鼠腹腔注射0.9%生理盐水或4.25%含糖腹透液每日2次,连续6周。6周后,评估小鼠腹膜转运及超滤功能;取壁层腹膜行PAS染色,评估腹膜增厚程度;免疫组化检测MPO、巨噬细胞标志F4/80、CD68,评估炎症细胞浸润情况;实时定量RT-PCR检测IL-6、IL-1β、TNF-α,评估炎症因子表达水平;免疫组化检测GSL-1,评估微血管及毛细血管新生程度。结果4.25%含糖腹透液组腹膜厚度显著高于正常对照组和生理盐水组(P<0.01)。与4.25%含糖腹透液组相比,4.25%含糖腹透液+外泌体组的腹膜增厚程度、腹膜间皮中性粒细胞和巨噬细胞数量、腹膜间皮新生血管数量、以及腹膜炎症因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)的mRNA表达水平均明显下降(P<0.05)。与正常对照组、生理盐水组、4.25%含糖腹透液+外泌体组相比,4.25%含糖腹透液组小鼠的腹膜功能表现为葡萄糖平衡作用快、尿素氮清除力强,但超滤功能显著下降(P<0.05)。结论干细胞外泌体可有效减轻高糖腹膜透析液诱导的腹膜炎症水平,改善腹膜超滤功能。